专利名称：壳聚糖在防治水稻白叶枯病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物保护技术的生物防治领域，尤其涉及壳聚糖在防治水稻白叶枯病 中的应用。
背景技术：
水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight of rice，以下简称白叶枯病)病原菌 为 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ishiyama) Swings et. al. (Xoo)，是水禾苗黄单胞菌属 下的一个致病变种，命名也几经波折。Xoo最开始被命名为Bacillus oryzea，随后依次被 更名为 Pseudomonas oryzea 禾口 Xanthomonasoryzae,在 1978 又被重新命名 Xanthomonas camperstris pv. oryzea. 1990年Swing等根据病原的表型、基因型、化学分类资料重新 承认水稻黄单胞菌这个种(Xanthomonas oryzae)，该种包括了分别引起白叶枯病和细条 病黄单胞杆菌白叶枯致病型(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和细菌性条斑病致病型 (Xanthomonas oryzae pv. oryzicola) 2个变种。至此该菌的地位才得以稳固。水稻白叶枯病是目前威胁我国南方水稻生产的重要细菌病害，目前与条斑病，稻 瘟病和纹枯病并称水稻四大病害。白叶枯病最早于1884年在日本福网县发现，不过最初却 被误认为是由酸性土壤引起的生理性病变，直至1909年研究者从发病的水稻叶片菌脓中 分离到大量细菌，并以此接种水稻得到了相同的发病症状，至此该病是一种细菌性病害的 理论才得建立。50年代以来，随着种子调运，病区面积不断扩大。现已在亚洲、非洲、欧洲、 美洲和澳大利亚等地均有发生，是许多国家的检疫对象。该病在亚洲尤其在周年种植水稻 的南亚和东南亚地区的危害最为严重。我国大部分地区均有发生，以华东、华中和华南稻区 发生更为普遍。一般减产10%-30%，严重可达50%以上。白叶枯的防治措施包括选育抗 病品种、加强检疫、农田管理、预警预报、化学防治和生物防治等。在以往及可预见的将来， 植物病害仍主要采用化学方法进行防治，由此引起的药物残留、环境污染、病菌抗药性等问 题仍将困扰着我们，因此发明新的有效的生化试剂来抵抗这种病害非常有必要。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，通常将脱乙酰度大于55%的甲壳素 称作壳聚糖，其学名为聚氨基葡萄糖，化学名(1，4) -2-氨基-2-脱氧-β -D-葡萄糖，广泛 存在于虾、蟹等动物外壳和藻类、真菌的细胞壁中。壳聚糖是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、酵母菌和真菌等均有不同程度的 抑制作用。壳聚糖具有良好的生物相溶性，可生物降解性以及无毒副作用，其分子内含 有-OH和-NH2-活性基团，易与多种有机物发生反应，目前广泛应用在工业、农业、医药、化 工、环境保护和水处理等领域。
发明内容
本发明提供了一种壳聚糖在防治水稻白叶枯病中的应用，解决了现有药剂少、防 效差的问题。壳聚糖在防治水稻白叶枯病中的应用。
本发明还提供了壳聚糖在提高水稻抗白叶枯病性能、降低水稻白叶枯发病病率和 病害程度以及抑制水稻白叶枯病病原菌(Xanthomonas oryzaepv. oryzae)生长中的应用。本发明还提供了一种防治植物白叶枯病的药剂，该种药剂分别以壳聚糖为主要成 份，添加常规的药用赋形剂，如水、乙酸等，制成水剂、粉剂等剂型。所述的壳聚糖的脱乙酰度优选大于85%，易获得，成本低。本发明还提供了一种上述药剂的制备方法，包括以下步骤将壳聚糖粉末溶于体积百分比为的乙酸溶液中，然后添加水配制成浓度为 5mg/mL的壳聚糖溶液。NaOH调节pH至6. 0，使得壳聚糖溶解，其用量和浓度可以根据需要 进行调整。采用上述壳聚糖溶液不仅在离体条件下能抑制Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)的生长，而且在水稻活体上能有效降低白叶枯病的发生率和病害程度。壳聚糖对水稻无毒害作用，而且能显著减小水稻白叶枯病的发病率以及病斑直 径，同时还能增强其抗白叶枯病的性能。
图1为实施例3中不同浓度的壳聚糖溶液对Xoo BLB-Ol生长的影响；图2为实施例5中浓度为0. 20mg/mL的壳聚糖对水稻病害发生率的影响；图3为实施例5中浓度为0. 20mg/mL的壳聚糖对水稻病斑直径的影响；
具体实施例方式实施例1制备壳聚糖溶液将脱乙酰度为85%的壳聚糖粉末溶解于体积百分比为的乙酸中，配制成浓度 为5mg/mL的壳聚糖溶液，用NaOH调节pH至6. 0，在室温下摇M小时，用高压灭菌锅121°C 灭菌20分钟，待用。实验以pH为6. O的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。实施例2离体条件下检测壳聚糖对Xoo生长的影响本实施例的Xoo BLB-Ol由浙江大学生物技术研究所提供，该菌株为试验材料，其 特性对试验结果没有影响。本实施例采用计数法检测壳聚糖对Xoo生长的影响，具体方法 如下Xoo在琼脂培养基中，28°C培养48小时，用无菌水制得菌悬液(109CFU/mL)。10倍 梯度稀释，吸取各浓度的Xoo菌悬液10 μ L到平板上，处理后的平板置于温箱培养48 小时。实验以PH为6. O的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照，每个处理设六个重复。实
验重复两次。实施例3检测壳聚糖不同浓度时的抑菌活性在实施例1制得的5mg/mL的壳聚糖溶液里加入无菌的去离子水配制成浓度为 0. 05，0. 10，和0. 20mg/mL的壳聚糖溶液。在各处理中接种Xoo菌悬液(108CFU/mL)，160" minJ8°C条件下振荡培养4小时，收集样本按实施例2检测菌体数。实验以pH为6. O的无 菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。如图1所示，壳聚糖溶液在不同浓度时对Xoo表现出显著的抑菌活性，而且随时浓 度的增加抑菌活性逐渐增强。与对照相比，壳聚糖溶液在浓度0. 05mg/mL时细菌数量下降了 1. 40Log CFU/mL，在浓度 0. 10mg/mL 时细菌数量减少了 1. 66Log CFU/mL，在浓度 0. 20mg/ mL时细菌数量下降了 3. 30Log CFU/mL,因此壳聚糖溶液在0. 20mg/mL时抑菌活性最高。实施例4检测壳聚糖在不同接种时间下的抑菌活性吸取实施例1制得的5mg/mL的壳聚糖溶液100 μ L，加入4. 9mL无菌去离子水配制 浓度为0. 20mg/mL的壳聚糖溶液。同实施例3，在各处理中接种Xoo菌悬液(108CFU/mL)， 160r/min、28°C条件下振荡培养0，2，4，6，12，24小时后检测Xoo的生长情况。实验以pH为 6. O的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。结果显示，作为对照的无菌去离子水中接种Xoo BLB-012小时后细菌数量下降了 0. 02Log CFU/mL，接下来菌量保持稳定。而处理组壳聚糖溶液中Xoo细菌数量随着处理时 间的增长显著下降，在O 12小时内逐渐降低，在处理M小时后细菌数量比12小时有所 增加。与对照相比，接种2小时后，壳聚糖溶液中的细胞数量减少了 1.97Log CFU/mL，在接 种12小时后，壳聚糖溶液中的细胞数量减少了 4. 03Log CFU/mL(见表1)。表1壳聚糖溶液不同接种时间对Xoo BLB-Ol的抑菌活性
接种时间Ch)细菌数量(Log 10 CFU/mL)对照壳聚糖O8.71 ±0.14 cι 8.71 ±0.15 f28.69 ±0.15 cι 6.74 ± 0.20 e48.66 ±0.18 cι 6.15±0.10d68.66 ±0.20 cι 5.86 ±0.16 c128.59 ±0.14 cι 4.68 ± 0.12 b248.63 ±0.21 cι 4.82 ±0.14 a实施例5壳聚糖处理过的水稻幼苗上接种Xoo BLB-Ol在温室条件下测定了壳聚糖对水稻白叶枯病的发生率和病害程度的抑制作用。具 体方法如下1、将水稻种子播种于盛有稻田土壤的塑料盆(直径8. 5cm,高7. 5cm)内，每盆10 粒种子，每处理重复4次；2,Xoo菌株BLB-Ol在营养琼脂液体培养基中过夜培养，并调节浓度至108CFU/mL ；3、3个星期后，用浓度为0. 20mg/mL的壳聚糖溶液喷洒到水稻幼苗，每盆喷洒5ml， 用等量灭菌蒸馏水喷洒做对照试验；4、风干后，将上述步骤2的菌液喷洒接种到步骤3中的水稻幼苗上，每盆喷洒 5mL ；5、用塑料袋覆盖所有接种过的幼苗Mh以保持高湿环境，在生长箱中培养，温度 设置为，相对湿度90%，每天光照黑暗交替，光照16h，黑暗他；6、接种后7d，观察和记录病害发生率和病斑的平均直径大小，整个试验重复2次。试验结果表明在没有喷洒壳聚糖的对照处理中，水稻幼苗在接种白叶枯病菌5d 后表现出病害症状，经壳聚糖处理后，病害症状出现推迟了 Id。在对照处理中，水稻幼苗在 接种后7d病害发病率达到84. 15%，平均病斑直径为35. 5mm(见图2和图幻；然而，经壳聚 糖处理后，水稻幼苗接种7d后病害发生率减少34. Ol %，病斑直径减少47. 72% (见图2和 图3)，与对照相比差异显著。并且经壳聚糖处理后，水稻白叶枯病的发生率和病斑直径在接种7d后保持稳定。未经接种白叶枯病病菌的水稻幼苗则不表现病害症状。实施例6壳聚糖处理对水稻苗酶活性的影响水稻幼苗酶活性的测定具体方法如下1.根据实施例5水稻叶片在接种白叶枯病菌后的0，12，M，48，72，96，120h后采 集，每盆水稻幼苗采集Ig叶片(鲜重)，_70°C保存。2.酶液提取将1中采集的样品每份称取0. 5g水稻叶片，加入3ml磷酸缓冲液 (50mmol/L ；pH 7. 8 ；含 0. 2mol/L EDTA, 1% PVP)研磨均勻。12000rpm 离心 20min。取上清 用于测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)，过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性。3. PAL活性的测定在试管中依次加入0. 05mol/L的硼酸缓冲液(pH8. 8) ImL,蒸馏 水lmL，上述步骤2中的酶液lmL。空白不加酶液，以沸水煮过的酶液代替。均勻混合，30°C 水浴30min后加ImL 6mol/L的HCl终止反应。测^Onm波长下的吸光值0D29(1。以每克鲜 重每分钟内的OD改变0. 01为一个酶活性单位。4. POD活性的测定在试管中依次加入0. 05mol/L磷酸缓冲液2. 9mL，2%的双氧水 lmL，上述步骤2中的酶液lmL，0. 05mol/L愈创木酚lmL。空白不加酶液，以沸水煮过的酶液 代替。均勻混合后立即在470nm波长下比色，测定aiiin。5. PPO活性的测定在试管中依次加入0. 05mol/L磷酸缓冲液1. 5mL,邻苯二酚 1. 5mL,上述步骤2中的酶液20 μ L。空白不加酶液，以沸水煮过的酶液代替。均勻混合，30°C 水浴30min后加ImL 6mol/L的HCl终止反应。测420nm波长下的吸光值0D42(1。以每克鲜 重每分钟内的OD改变1为一个酶活性单位。实验结果显示经壳聚糖处理过的水稻幼苗，三种酶的活性在接种条斑病菌后的 初始阶段与对照没有明显的差别，但是在接种白叶枯病菌1 后除了 PPO的活性，PAL和 POD的活性都显著的高于对照，且在48h时达到最高峰，此时，壳聚糖处理过的水稻幼苗 PAL, POD和PPO活性分别比对照提高了 25. 75，3. 2和10. 31 % (见表2)。表2壳聚糖处理对水稻酶活性的影响
权利要求
1.壳聚糖在防治水稻白叶枯病中的应用。
2.壳聚糖在提高水稻抗白叶枯病性能中的应用。
3.壳聚糖在降低水稻白叶枯病发病率和病害程度中的应用。
4.壳聚糖在抑制水稻白叶枯病病原菌(Xanthomonasoryzae pv. oryzae)生长中的应
全文摘要
本发明公开了壳聚糖在防治水稻白叶枯病中的应用。本发明壳聚糖制剂能显著降低水稻白叶枯病的发生率和病斑的大小，且能显著提高水稻幼苗中苯丙氨酸解氨酶，过氧化物酶和多酚氧化酶的活性，从而增强水稻的抗病能力。采用本发明壳聚糖制剂防治水稻白叶枯病简单易行，成本较低。
文档编号A01N43/16GK102138556SQ20111000726
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者刘宝平, 唐乔梅, 李斌, 石雨, 谢关林, 陶中云 申请人:浙江大学