专利名称：轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织培养快速繁殖方法，尤其是一种轮叶黑藻组织培养快速 繁殖方法，属于生物技术领域。
背景技术：
轮叶黑藻(Hydrillaverticillata)是水鳌科(Hydrocharitaceae)的一种多年 生沉水草本植物，普遍生长在我国各处水域中，其耐污性强，对水体的富营养化有较强的适 应能力，在受污染严重的水体中也能生长，能够起到净化水体的作用，另外，该植物普遍种 植于鱼塘中，为虾类、鱼类、家禽等提供饵料，大规模、大面积种植此水生植物为农业堆制有 机肥提供有机质。目前市场上对轮叶黑藻种苗需求量很大，有关轮叶黑藻的研究很少，仅集中在净 化水体、鱼虾养殖应用等方面。所需的轮叶黑藻一般打捞来自于自然环境的，打捞过程中容 易破坏轮叶黑藻分布，以及原有的野生环境，而且自然分布的轮叶黑藻有限，难以满足工程 上的大量需求。对轮叶黑藻的快速、大量繁殖技术极为需要。目前关于轮叶黑藻的报道仅 有一篇，而选用的培养成份基较为单一，获得的增殖系数较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种轮叶黑藻组织培养快速繁 殖方法，获得大量室内无菌的轮叶黑藻工程苗，为生态修复净化水体、渔业养殖、有机肥堆 制等提供需要，做到全年、可持续、大规模供应轮叶黑藻组培苗。按照本发明提供的技术方案，所述轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步 骤(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗2 4h后，除去杂 质，放入无菌水中浸泡20 30min，再经无菌水冲洗3 5次，备用；(2)脱毒将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度70% 75%的酒精消毒 4 8s，再用无菌水冲洗4 6次后，放入浓度为0. 1 % 0. 15 %的升汞中灭菌3 5min 后用无菌水冲洗4 6次，置于无菌纸上晾干，切割成1 2cm ；(3)诱导培养将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养25 30天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200 1600Lux， 光照周期为10 12h/d ；(4)增殖培养将轮叶黑藻不定芽切成成1 2cm后，接种在增殖培养基上进行增 殖培养25 35d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200 1600Lux，光照周期为10 12h/d ；(5)生根培养将经增殖培养后得到的不定芽切割成1 2cm，并带有2 3个小 节段，接种在生根培养基上进行生根培养30 35d ；培养室温度为25士2°C，光照强度为 1200 1600Lux，光照周期为10 12h/d ；
(6)将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件 下2 3d进行炼苗，炼苗温度在10 30°C，室内光照强度为1000 1200Lux，取出培养瓶 内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。其中的h是小时，d是天。所述诱导培养基为1/2MS培养基中加入0. 1 0. 3mg/L的6-BA或0. 1 0. 3mg/ L的NAA ；所述增殖培养基为MS培养基加入0. 5 1. Omg/L的6-BA与0. 1 0. 3mg/L的 NAA ；所述生根培养基为MS培养基加入0. 2 0. 4mg/L的6_BA、0. 1 0. 3mg/L的NAA和 0. 2 0. 4mg/L的IBA ；所述MS培养基的成分由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、蔗糖 和琼脂组成。所述MS培养基的成分包括所述大量元素为(I)NH4NO3,1650gm/L； (2) KNO3,1900mg/L ； (3) CaCl ·2Η20，440π^/ L ； (4) MgSO4 · 7H20, 370mg/L ； (5) KH2PO4,170mg/L ；所述微量元素为(I)MnSO4· H2O, 22. 3mg/L ； (2) ZnSO4 · 7H20，8. 6mg/L ； (3) CoCl · 6Η20，0· 025mg/L ； (4) CuSO4 · 5Η20，0· 02mg/L ； (5) H3BO3, 6. 2mg/L ； (6) Na2MO4 · 2H20, 0. 25mg/L ； (7)KI，0. 83mg/L ；所述有机成分为(1)烟酸，0. 5mg/L ； (2)盐酸吡哆醇，0. 5mg/L ； (3)盐酸硫胺素， 0. lmg/L ； (4)肌醇，100mg/L ； (5)甘氨酸，2mg/L ；所述铁盐为(1)FeSO4 · 7H20，28. 7mg/L ； (2) Na2-EDTA, 37. 3mg/L ；所述蔗糖为30000mg/L ；所述琼脂为5800 6200mg/L。所述1/2MS培养基的成分是MS培养基的一半。所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养基在温度为120 121°C、压力为 0. 103 0. 105MPa的条件下灭菌18 20min。本发明利用植物组织培养技术，获得大量室内无菌的轮叶黑藻工程苗，为生态修 复净化水体、渔业养殖、有机肥堆制等提供需要，做到全年、可持续、大规模供应轮叶黑藻组 培苗；本发明改进了轮叶黑藻初代培养时灭菌方式，降低了初代培养时的污染，提高初代诱 导的成活率，使成活率达70%以上，并且改良了基本培养基，以及在培养基中加入不同的激 素，添加一定浓度的激素使得在培养过程中诱导不定芽更多，在增殖培养时，每个小芽可以 诱导16个芽以上，在生根培养中添加不同激素的一定浓度，使得生根过程中，生根数增更 多，每个芽生根在10条以上，而且根粗壮。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明使用的诱导培养基为1/2MS培养基中加入0. 1 0. ;3mg/L的6-BA或0. 1 0. 3mg/L的NAA ；增殖培养基为MS培养基加入0. 5 1. Omg/L的6-BA与0. 1 0. 3mg/L的 NAA ；生根培养基为MS培养基加入0. 2 0. 4mg/L的6_BA、0. 1 0. 3mg/L的NAA和0. 2 0. 4mg/L的IBA ；所述MS培养基的成分由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、蔗糖和琼脂 组成。所述MS培养基的成分包括
所述大量元素为(I)NH4NO3,1650gm/L； (2) KNO3,1900mg/L ； (3) CaCl ·2Η20，440π^/ L ； (4) MgSO4 · 7H20, 370mg/L ； (5) KH2PO4,170mg/L ；所述微量元素为(I)MnSO4· H2O, 22. 3mg/L ； (2) ZnSO4 · 7H20，8. 6mg/L ； (3) CoCl · 6Η20，0· 025mg/L ； (4) CuSO4 · 5Η20，0· 02mg/L ； (5) H3BO3, 6. 2mg/L ； (6) Na2MO4 · 2H20, 0. 25mg/L ； (7)KI，0. 83mg/L ；所述有机成分为(1)烟酸，0. 5mg/L ； (2)盐酸吡哆醇，0. 5mg/L ； (3)盐酸硫胺素， 0. lmg/L ； (4)肌醇，100mg/L ； (5)甘氨酸，2mg/L ；所述铁盐为(1)FeSO4 · 7H20，28. 7mg/L ； (2) Na2-EDTA, 37. 3mg/L ；所述蔗糖为30000mg/L ；所述琼脂为5800 6200mg/L。所述1/2MS培养基的成分是MS培养基的一半。所述诱导培养基、增殖培养基和生根培养基均在温度为120 121°C、压力为 0. 103 0. 105MPa的条件下灭菌18 20min。实例一一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗池后，除去杂质，放 入无菌水中浸泡20min，再经无菌水冲洗3次，备用；(2)脱毒将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度70%的酒精消毒4s，再用 无菌水冲洗4次后，放入浓度为0. 1 %的升汞中灭菌:3min后用无菌水冲洗4次，置于无菌纸 上晾干，切割成Icm;(3)诱导培养将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养25 天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200LUX，光照周期为 10h/d ；污染率在10%以内，初代诱导诱导率达80%以上；(4)增殖培养将轮叶黑藻不定芽切成成Icm后，接种在增殖培养基上进行增殖培 养25d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200LUX，光照周 期为10h/d ；(5)生根培养将经增殖培养后得到的不定芽切割成1cm，并带有2 3个小节段， 接种在生根培养基上进行生根培养30d ；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200LUX，光照 周期为10h/d ；(6)轮叶黑藻茎段经生根培养出大量的根，生根在10个以上根系发达，而且长势 也比较好，轮叶黑藻长度在5cm左右，将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打 开，放置于室内自然条件下2d进行炼苗，炼苗温度在10°C，室内光照强度为lOOOLux ；取出 培养瓶内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。实例二 一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗4h后，除去杂质，放 入无菌水中浸泡30min，再经无菌水冲洗5次，备用；(2)脱毒将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度75%的酒精消毒8s，再用 无菌水冲洗6次后，放入浓度为0. 15%的升汞中灭菌5min后用无菌水冲洗6次，置于无菌 纸上晾干，切割成2cm;(3)诱导培养将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养30天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1600LUX，光照周期为 12h/d ；污染率在20%以内，初代诱导诱导率达90%以上；(4)增殖培养将轮叶黑藻不定芽切成成2cm后，接种在增殖培养基上进行增殖培 养35d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1600LUX，光照周 期为12h/d ；(5)生根培养将经增殖培养后得到的不定芽切割成2cm，并带有3个小节段，接种 在生根培养基上进行生根培养35d ；培养室温度为25士2°C，光照强度为1600LUX，光照周期 为 12h/d ；(6)轮叶黑藻茎段经生根培养出大量的根，生根在10个以上根系发达，而且长势 也比较好，轮叶黑藻长度在5cm左右，将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打 开，放置于室内自然条件下3d进行炼苗，炼苗温度在30°C，室内光照强度为1200LUX ；取出 培养瓶内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。实例三一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗池后，除去杂质，放 入无菌水中浸泡25min，再经无菌水冲洗4次，备用；(2)脱毒将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度75%的酒精消毒6s，再用 无菌水冲洗5次后，放入浓度为0. 15%的升汞中灭菌^iin后用无菌水冲洗5次，置于无菌 纸上晾干，切割成1 2cm;(3)诱导培养将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养25 天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1500LUX，光照周期为 12h/d ；污染率在15%以内，初代诱导诱导率达85%以上；(4)增殖培养将轮叶黑藻不定芽切成成1 2cm后，接种在增殖培养基上进行增 殖培养30d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1400LUX，光 照周期为12h/d ；(5)生根培养将经增殖培养后得到的不定芽切割成1 2cm，并带有2 3个小节 段，接种在生根培养基上进行生根培养30d ；培养室温度为25士2°C，光照强度为HOOLux， 光照周期为Uh/d ；(6)轮叶黑藻茎段经生根培养出大量的根，生根在10个以上根系发达，而且长势 也比较好，轮叶黑藻长度在5cm左右，将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打 开，放置于室内自然条件下3d进行炼苗，炼苗温度在20°C，室内光照强度为1200LUX ；取出 培养瓶内的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。
权利要求
1.一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，其特征是，包括以下步骤(1)于春季从野外湖泊中采集轮叶黑藻茎段，在自来水中冲洗2 4h后，除去杂质，放 入无菌水中浸泡20 30min，再经无菌水冲洗3 5次，备用；(2)脱毒将经步骤(1)处理过的轮叶黑藻茎段用浓度70% 75%的酒精消毒4 8s， 再用无菌水冲洗4 6次后，放入浓度为0. 1 % 0. 15%的升汞中灭菌3 5min后用无菌 水冲洗4 6次，置于无菌纸上晾干，切割成1 2cm ；(3)诱导培养将切割后的轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养25 30 天，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200 1600LUX，光照 周期为10 12h/d ；(4)增殖培养将轮叶黑藻不定芽切成成1 2cm后，接种在增殖培养基上进行增殖 培养25 35d，进一步培养出大量的不定芽；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200 1600Lux，光照周期为10 12h/d ；(5)生根培养将经增殖培养后得到的不定芽切割成1 2cm，并带有2 3个小节段， 接种在生根培养基上进行生根培养30 35d ；培养室温度为25士2°C，光照强度为1200 1600Lux，光照周期为10 12h/d ；(6)将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件下 2 3d进行炼苗，炼苗温度在10 30°C，室内光照强度为1000 1200Lux，取出培养瓶内 的组培苗，洗净，转至自然条件下的池塘中养殖。
2.如权利要求1所述的轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，其特征是所述诱导培养基 为1/2MS培养基中加入0. 1 0. 3mg/L的6-BA或0. 1 0. 3mg/L的NAA ；所述增殖培养基 为MS培养基加入0. 5 1. Omg/L的6-BA与0. 1 0. 3mg/L的NAA ；所述生根培养基为MS 培养基加入0. 2 0. 4mg/L的6-BA、0. 1 0. 3mg/L的NAA和0. 2 0. 4mg/L的IBA ；所述 MS培养基的成分由大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、蔗糖和琼脂组成。
3.如权利要求2所述的轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，其特征是所述MS培养基的 成分包括所述大量元素为(I)NH4NO3,1650gm/L ； (2)KNO3,1900mg/L ； (3)CaCl · 2H20，440mg/L ； (4) MgSO4 · 7H20, 370mg/L ； (5) KH2PO4,170mg/L ；所述微量元素为(I)MnSO4 · H2O, 22. 3mg/L ； (2) ZnSO4 · 7H20，8. 6mg/L ； (3) CoCl · 6H20, 0. 025mg/L ； (4) CuSO4 · 5Η20，0· 02mg/L ； (5) H3BO3,6. 2mg/L ； (6) Na2MO4 · 2Η20，0· 25mg/L ； (7) ΚΙ,Ο. 83mg/L ；所述有机成分为⑴烟酸，0. 5mg/L;⑵盐酸吡哆醇，0. 5mg/L;⑶盐酸硫胺素， 0. lmg/L ； (4)肌醇，100mg/L ； (5)甘氨酸，2mg/L ；所述铁盐为(I)FeSO4 · 7H20，28. 7mg/L ； (2) Na2-EDTA, 37. 3mg/L ；所述蔗糖为30000mg/L ；所述琼脂为5800 6200mg/L。
4.如权利要求2所述的轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，其特征是所述1/2MS培养 基的成分是MS培养基的一半。
5.如权利要求1所述的轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，其特征是所述诱导培养基、 增殖培养基和生根培养基在温度为120 121°C、压力为0. 103 0. 105MPa的条件下灭菌.18 20min。
全文摘要
本发明涉及一种轮叶黑藻组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤(1)采集轮叶黑藻茎段；(2)脱毒将轮叶黑藻茎段进行消毒；(3)诱导培养将轮叶黑藻茎段接种入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养出轮叶黑藻不定芽；(4)增殖培养将轮叶黑藻不定芽接种在增殖培养基上进行增殖培养，进一步培养出大量的不定芽；(5)生根培养将经增殖培养后得到的不定芽接种在生根培养基上进行生根培养；(6)将经生根培养后的带有根须的轮叶黑藻的培养瓶打开，放置于室内自然条件下进行炼苗，取出培养瓶内的组培苗，洗净，转至池塘中养殖。本发明为生态修复净化水体、渔业养殖、有机肥堆制等提供需要，做到全年、可持续、大规模供应轮叶黑藻组培苗。
文档编号A01H4/00GK102124952SQ20111002419
公开日2011年7月20日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者王远 申请人:江苏九久环境科技有限公司