专利名称：一种火焰兰的杂交育种和无菌播种方法
技术领域：
本发明涉及植物的杂交育种方法，具体涉及一种火焰兰的杂交育种和无菌播种方法。
背景技术：
火焰兰属(Reanathera)植物全世界约有21种，为附生或半附生植物，分布于东 南亚至喜马拉雅地区，包括华南地区，我国原产3种，其中火焰兰(Ren. Coccinea)产于广 东，海南地区，植株高大生长健旺，云南火焰兰(Ren. imschootiana)和中华火焰兰(Ren. sinica)产于云南。火焰兰生长健旺，花色艳丽，花数众多，远观如火焰般绚丽，具有很高的 园艺应用价值和育种价值，是国际花卉市场上十分流行的高档花卉，在世界上具有大量的 爱好者。而且由于其生长环境为热带、亚热带，适合在华南地区栽培，未来有希望在华南地 区建立其育种和生产基地，形成类似蝴蝶兰、石斛兰的产业。火焰兰已成为世界上濒危的植 物物种之一，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录中而 被禁止贸易。火焰兰杂交种比原生种花型花姿更为优美，生长势和抗逆性强，在花色上比原生 种更为艳丽多彩，也能在国际市场上进行交易，现已成为世界火焰兰产业的主流产品，但我 国火焰兰的杂交育种工作还刚刚起步，火焰兰产业具有广阔的市场前景。火焰兰虽具有很高的杂交亲和性，但在与其他兰科植物杂交时存在花期不遇问 题，同时由于花期不遇而无法进行一些远缘杂交，此外已报道的其他植物的花粉低温保存 时常发生霉变问题而导致花粉保存失败。火焰兰杂交种子由于其种胚发育不完全，自然状 态下萌发率极低，需要无菌播种才能进行种苗生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种火焰兰的杂交育种的方法和萌发率高、成苗快、种苗品 质好的无菌播种的方法。本发明选择具明显特性、观赏价值高的兰科植物作为杂交母本，以火焰兰作为父 本，进行杂交，授粉成功得到的果实在基本成熟而未开裂时，在种子萌发培养基上进行无菌 播种，种子萌发后再转移到壮苗培养基上培养，形成的试管苗经过自然光照下炼苗10 20 天后出瓶栽培，成苗的移栽成活率可达90%以上，从而实现了本发明的目的。本发明的火焰兰的杂交育种和无菌播种的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)人工授粉以兰科植物作为母本，以火焰兰作为父本，采集父本的花粉授于 母本的柱头上，并进行套袋处理，防止外来花粉的干扰；(2)无菌播种当母本结出的杂交蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，将该果 实搽抹干净，依次用体积分数为70 75%酒精溶液浸泡2 3分钟后，置于质量分数为 0. 0. 2%的升汞溶液中消毒20 30分钟，再用无菌水冲冼4 5次，吸干果实表面 的水分，切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，种子萌发先形成原球茎，随后长成小苗，所述的种子萌发培养基为每升含花宝1号1 3. 0g，蛋白胨0. 5 2. 0g，椰 子汁100 150mL,蔗糖20 30g,琼脂6 7g，活性炭0. 5 1. Og,肌醇80 120mg,甘氨 酸1. 5 2. 5mg,盐酸硫胺素0. 05 0. 2mg,盐酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,烟酸0. 4 0. 8mg, 余量为水，pH 5. 4 5. 8 ；自种子接种到种子萌发培养基上培养，一般30 90天种子萌发 形成原球茎，90 180天进一步形成小苗，种子萌发率60 90%，成苗率55 90% ；(3)壮苗培养将无菌播种获得的小苗接种到壮苗培养基上培养，120 180天时 能形成健壮的植株，所述的壮苗培养基为每升含花宝1号1 3. 0g，蛋白胨0. 5 2. Og,萘 乙酸0.5 l.Omg、香蕉勻浆50 100g，椰子汁50 IOOmL,蔗糖15 20g，琼脂6 7g， 活性炭0. 5 2. Og,肌醇80 120mg，甘氨酸1. 5 2. 5mg,盐酸硫胺素0. 05 0. 2mg,盐 酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,烟酸0. 4 0. 8mg,余量为水，pH 5. 4 5. 8 ；(4)试管苗移栽当小苗长成的植株5 8cm高时，将培养瓶转移到自然光下炼 苗10 20天，然后将其取出，洗净根部的培养基，移入兰石木屑树皮按体积比为2 3 1 2 1 2的混合基质中培养；常规管理，保持适当的通风和足够的湿度，移栽的 成活率可达90%以上；上述步骤⑵和(3)中的培养条件为培养温度M ^°C，光照度1500 20001x，光照12 16小时/天。在所述的人工授粉步骤，当母本和父本花期相同时，在母本花朵展开后2 4天， 取父本的花粉直接授于母本的柱头上。在所述的人工授粉步骤，当母本和父本的花期不遇时，在父本火焰兰的盛花期采 集花粉块，采集时机选择在火焰兰花朵花瓣刚展开时，采集时间选择在上午8 9时，采集 花粉置于无菌的塑料管中，密封置于4°C避光保存，当母本开花时，将低温保存的父本花粉 在15 35°C的条件下解冻20 30min，再往放置花粉的塑料管中加入无菌水进行浸泡回 湿花粉20 30min，然后将有生活力的花粉授于母本柱头上。按照上述方法进行火焰兰的 花粉的保存，火焰兰花粉的保存时间可达3 10个月。花粉生活力的测试可采用氯化三苯 四氮唑染色法测定花粉生活力，确认花粉有活力后将其授于母本的柱头上。采用的上述洁 净低温保存的具有生活力的火焰兰花粉、授粉前对花粉进行解冻和回湿处理等技术解决了 花粉保存时的霉变问题以及不同花期的品种和植株的杂交授粉阻碍，从而为火焰兰新品种 选育打下基础。所述的采集花粉置于无菌的塑料管中，密封置于4°C避光保存，优选，步骤为应 用无菌的牙签轻轻挑掉花的药帽，再用无菌牙签将花粉块粘连在牙签尖上并迅速将花粉块 放至洁净无菌的Iml离心管中，每管放入1朵花的花粉块，将放置了花粉块的离心管再用一 无菌的玻璃瓶集中装起来，并密封好，置于4°C避光保存。不同火焰兰杂交种果实在授粉后的成熟期不同，但大部分火焰兰杂交种子在授粉 后4个月时就能萌发，到5 6个月时达到萌发高峰，然后下降，但与兰属杂交的火焰兰杂 种的果实发育成熟需要10 12个月时间。一般火焰兰杂交种子最佳的萌发期是在果实发 育基本成熟而果实未开裂时。在步骤O)的无菌播种步骤，优选将种子萌发先形成的原球茎接种到分化培养基 上，使原球茎在分化培养基上形成小苗，所述的分化培养基是在种子萌发培养基的基础上 每升添加6-卞基腺嘌呤5. Omg,培养条件为培养温度M ，光照度1500 20001x，光照12 16小时/天。所述的母本兰科植物优选为五唇兰(Doritis pulcherrima)、小花万代兰 (Vandacoerulescens)或彩心建兰(Cymbidium ensifolium)。步骤( 和C3)培养基中使用的花宝1号可从市场上购得。本发明具有杂交成功率高的特点，特别是对一些与火焰兰杂交亲本花期不遇的具 明显特性、观赏价值高的兰科植物为杂交亲本时十分有效。本发明采用独特的培养基和培 养方法，使得火焰兰杂交种子的萌发率高、成苗快、种苗品质好。本发明具有操作性强，育种 效率和应用价值高等优点。
具体实施例方式以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例中使用的花宝1号(HYPONeX 1)为美国生产，台湾台和园艺企业股份有限 股份有限公司分装产品。实施例1 五唇兰(Doritis pulcherrima)禾口云南火焰兰(Renanthera imschootiana)的杂 交育种和种苗繁殖(1)人工授粉云南火焰兰于3月初开花，在其单花花瓣刚展开时采集花粉，于上 午8 9时应用已灭菌的牙签轻轻挑掉花的药帽，再用牙签将花粉块粘连在牙签尖上并迅 速将花粉块放至洁净无菌的Iml EP管(离心管)内，每管放入1朵花的花粉块，将放置了花 粉块EP管再用一无菌的玻璃瓶集中装起来并密封好，最后将装满花粉的玻璃瓶放置于4°C 条件下避光保存。火焰兰花粉保存的时间达3个月后，当母本五唇兰于当年6月初开花时， 对低温保存的火焰兰的花粉进行解冻和回湿处理，以恢复和提高花粉的生活力。先将低温 保存的火焰兰花粉的在室温(35°C)条件下解冻20分钟后，再往放置花粉块的EP管内加几 滴无菌水进行回湿处理20分钟，最后采用氯化三苯四氮唑染色法测定花粉生活力，确定花 粉有活力，将其授于母本的柱头上。授粉后摘除母本的唇瓣后套袋，约1星期后去袋，要挂 上标签，标签上具有父、母本名称、杂交日期和授粉人等信息。注意观察其发育情况，3个月 时统计授粉的成功率，结实率均达90%以上，等果实变成橙黄色，达到基本成熟而未开裂时 可采集进行无菌播种。(2)无菌播种将授粉后5个月的果实先用酒精棉花搽抹干净果实表面污物，接着 用体积分数为70%酒精溶液浸泡2分钟后，置于质量分数为0. 1 %的升汞溶液中消毒30分 钟，无菌水漂洗5次后，用无菌滤纸吸干果实表面的水分，切开果实，将粉末状种胚接种到 种子萌发培养基上，消毒成功率95 %以上，20天时可见种子膨大转绿，30天时种子萌发形 成原球茎，90天进一步形成小苗。种子萌发率90%，成苗率90%。种子萌发培养基为每升 含花宝1号2. Og,蛋白胨2. Og,椰子汁IOOmL,蔗糖20g,琼脂6g，活性炭1. Og,肌醇80mg,甘 氨酸2. 5mg，盐酸硫胺素0. 05mg，盐酸吡哆醇0. 8mg，烟酸0. 4mg，余量为水，pH 5. 8。(3)壮苗培养将无菌播种获得的小苗接种到壮苗培养基上培养，120天时能形成 健壮的植株。所述的壮苗培养基为每升含花宝1号3. 0g，蛋白胨2. 0g，萘乙酸lmg、香蕉勻 浆80g，椰子汁50mL，蔗糖15g，琼脂6g，活性炭2. Og,肌醇80mg，甘氨酸2. 5mg，盐酸硫胺素 0. 05mg，盐酸吡哆醇0. 8mg，烟酸0. 4mg，余量为水，pH 5. 8。
(4)试管苗移栽当植株约5-8厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗15天，然 后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石木屑树皮按体积比为2 :1:1 的混合基质中，常规管理，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95%以上。在步骤⑵和步骤(3)中的培养条件为培养温度，光照度20001x，光照12小
时/天。实施例2 小花万代兰(Vanda coerulescens)禾口云南火焰兰(Renanthera imschootiana) 的杂交育种和种苗繁殖(1)人工授粉云南火焰兰于3月初开花，在其单花花瓣刚展开时采集花粉，于上 午8 9时应用已灭菌的牙签轻轻挑掉花的药帽，再用无菌牙签将花粉块粘连在牙签尖上 并迅速将花粉块放至洁净无菌的ImlEP管内，每管放入1朵花的花粉块，将放置了花粉块EP 管再用一无菌的玻璃瓶集中装起来并密封好，最后将装满花粉的玻璃瓶放置于4°C条件下 避光保存。火焰兰花粉保存的时间达6个月后，当母本小花万代兰于当年9月初开花时，对 低温保存的火焰兰的花粉进行解冻和回湿处理，以恢复和提高花粉的生活力。先将低温保 存的火焰兰花粉的在室温条件下(30°C )解冻25分钟后再往放置花粉块的EP管内加几滴 无菌水进行回湿处理25分钟，最后采用氯化三苯四氮唑染色法测定花粉生活力，确定花粉 有活力，将其授于母本的柱头上。授粉后摘除母本的唇瓣后套袋，约1星期后去袋，要挂上 标签，标签上具有父、母本名称、杂交日期和授粉人等信息。注意观察其发育情况，3个月时 统计授粉的成功率，结实率均达80%以上，等果实变成橙黄色，基本成熟未开裂时可采集进 行无菌播种。(2)无菌播种将授粉后5个月的果实先用酒精棉花搽抹干净果实表面污物，接着 用体积分数为75%酒精浸泡3分钟后，置于质量分数为0. 2%的升汞溶液中消毒20分钟， 无菌水漂洗4次后，用无菌滤纸吸干果实表明的水分，切开果实，将粉末状种胚接种到种子 萌发培养基上，消毒成功率达100%，30天时可见种子萌发，60天时种子萌发形成原球茎， 120天进一步形成小苗。种子萌发率80%，成苗率60%。种子萌发培养基为每升含花宝 1号3. Og,蛋白胨1. 5g，椰子汁150mL，蔗糖30g，琼脂7g，活性炭0. 5g，肌醇120mg，甘氨酸 1. 5mg,盐酸硫胺素0. 2mg,盐酸吡哆醇0. 4mg,烟酸0. 8mg,余量为水，pH 5. 4。(3)壮苗培养将无菌播种获得的小苗接种到壮苗培养基上培养，150天时能形成 健壮的植株。所述的壮苗培养基为每升含花宝1号2. 0g，蛋白胨1. 5g，萘乙酸0. 5mg、香蕉 勻浆100g，椰子汁IOOmL,蔗糖20g，琼脂7g，活性炭1. Og,肌醇120mg，甘氨酸1. 5mg,盐酸硫 胺素0. 2mg,盐酸吡哆醇0. 4mg,烟酸0. 8mg,余量为水，pH 5. 4。(4)试管苗移栽当植株约5 8厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗20 天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石木屑树皮按体积比为 1:1: 1的混合基质中，常规管理，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达 90%以上。步骤(2)和(3)的培养条件为培养温度，光照度15001x，光照14小时/天。实施例3 彩心建兰(Cymbidium ensifolium)和云南火焰兰(Renanthera imschootiana) 的杂交育种和种苗繁殖
(1)人工授粉云南火焰兰于3月初开花，在其单花花瓣刚展开时采集花粉，于上 午8 9时应用已灭菌的牙签轻轻挑掉花的药帽，再用无菌牙签将花粉块粘连在牙签尖上 并迅速将花粉块放至洁净无菌的ImlEP管内，每管放入1朵花的花粉块，将放置了花粉块EP 管再用一无菌的玻璃瓶集中装起来并密封好，最后将装满花粉的玻璃瓶放置于4°C条件下 避光保存。火焰兰花粉保存的时间达9个月后，当母本彩心建兰于当年12月初开花时，对 低温保存的火焰兰的花粉进行解冻和回湿处理，以恢复和提高花粉的生活力。先将低温保 存的火焰兰花粉，在室温(15°C )条件下解冻30分钟后，再往放置花粉块的EP管内加几滴 无菌水进行回湿处理30分钟，最后采用氯化三苯四氮唑染色法测定花粉生活力，确定花粉 有活力，将其授于母本的柱头上。授粉后摘除母本的唇瓣后套袋，约1星期后去袋，要挂上 标签，标签上具有父、母本名称、杂交日期和授粉人等信息。注意观察其发育情况，3个月时 统计授粉的成功率，结实率达30 %，等果实变成橙黄色，基本成熟未开裂时可采集进行无菌 播种。(2)无菌播种将授粉后12个月的果实先用酒精棉花搽抹干净果实表面污物，接 着用体积分数为70%酒精浸泡2. 5分钟后，置于质量分数为0. 2%的升汞溶液中消毒25分 钟，无菌水漂洗5次后，用无菌滤纸吸干果实表面的水，切开果实，将粉末状种胚接种到种 子萌发培养基上，消毒成功率达100%，90天时可见种子萌发，120天时种子萌发形成根状 茎，将根状茎接种培养于分化培养基中，60天可分化形成小苗。种子萌发率60 %，成苗率 55%。种子萌发培养基每升含花宝1号lg，蛋白胨0. 5g，椰子汁120mL，蔗糖25g，琼脂6. 5g， 活性炭0. 7g，肌醇lOOmg，甘氨酸ang，盐酸硫胺素0. Img,盐酸吡哆醇0. 5mg,烟酸0. 5mg,余 量为水，PH 5. 6。分化培养基为在种子萌发培养基的基础上每升添加6-卞基腺嘌呤5. Omg0(3)壮苗培养将根状茎分化获得的小苗接种到壮苗培养基上培养，150天时能形 成健壮的植株。所述的壮苗培养基为每升含花宝1号1. 0g，蛋白胨0. 5g，萘乙酸0. 7mg、香 蕉勻浆50g，椰子汁75mL，蔗糖18g，琼脂6. 5g，活性炭0. 5g，肌醇lOOmg，甘氨酸ang，盐酸硫 胺素0. lmg，盐酸吡哆醇0. 5mg，烟酸0. 5mg，余量为水，pH 5.6。(4)试管苗移栽当植株约5 8厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗10 天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石木屑树皮按体积比为 3:1: 2的混合基质中，常规管理，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达 95%以上。步骤(2)在种子萌发培养基和分化培养基中培养以及步骤( 的培养条件为培养 温度^°C，光照度18001X，光照16小时/天。
权利要求
1.一种火焰兰的杂交育种和无菌播种的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)人工授粉以兰科植物作为母本，以火焰兰作为父本，采集父本的花粉授于母本 的柱头上，并进行套袋处理；(2)无菌播种当母本结出的杂交蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，将该果实搽抹 干净，依次用体积分数为70 75%酒精溶液浸泡2 3分钟后，置于质量分数为0. 0. 2%的升汞溶液中消毒20 30分钟，再用无菌水冲冼4 5次，吸干果实表面的水分，切 开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，种子萌发先形成原球茎，随后长成小 苗，所述的种子萌发培养基为每升含花宝1号1 3. 0g，蛋白胨0. 5 2. 0g，椰子汁100 150mL，蔗糖20 30g，琼脂6 7g，活性炭0. 5 1. Og,肌醇80 120mg，甘氨酸1. 5 2. 5mg，盐酸硫胺素0. 05 0. 2mg,盐酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,烟酸0. 4 0. 8mg,余量为水， pH 5. 4 5. 8 ；(3)壮苗培养将无菌播种获得的小苗接种到壮苗培养基上培养，所述的壮苗培养基 为每升含花宝1号1 3. 0g，蛋白胨0. 5 2. 0g，萘乙酸0. 5 1. Omg、香蕉勻浆50 100g, 椰子汁50 IOOmL,蔗糖15 20g,琼脂6 7g，活性炭0. 5 2. Og,肌醇80 120mg,甘 氨酸1. 5 2. 5mg,盐酸硫胺素0. 05 0. 2mg,盐酸吡哆醇0. 4 0. 8mg,烟酸0. 4 0. 8mg, 余量为水，PH 5. 4 5. 8 ；(4)试管苗移栽当小苗长成的植株5 8cm高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗 10 20天，然后将其取出，洗净根部的培养基，移入兰石木屑树皮按体积比为2 31 21 2的混合基质中培养；上述步骤( 和(3)中的培养条件为培养温度M ^°C，光照度1500 20001x，光 照12 16小时/天。
2.根据权利要求1所述的火焰兰的杂交育种和无菌播种的方法，其特征在于，在所述 的人工授粉步骤，当母本和父本花期相同时，在母本花朵展开后2 4天，取父本的花粉直 接授于母本的柱头上。
3.根据权利要求1所述的火焰兰的杂交育种和无菌播种的方法，其特征在于，在所述 的人工授粉步骤，当母本和父本的花期不遇时，在父本火焰兰的盛花期采集花粉块，采集时 机选择在火焰兰花朵花瓣刚展开时，采集时间选择在上午8 9时，采集花粉置于无菌的塑 料管中，密封置于4°C避光保存，当母本开花时，将低温保存的父本花粉在15 35°C的条件 下解冻20 30min，再往放置花粉的塑料管中加入无菌水进行浸泡回湿花粉20 30min， 然后将有生活力的花粉授于母本柱头上。
4.根据权利要求3所述的火焰兰的杂交育种和无菌播种的方法，其特征在于，所述的 采集花粉置于无菌的塑料管中，密封置于4°C避光保存，步骤为应用无菌的牙签轻轻挑掉 花的药帽，再用无菌牙签将花粉块粘连在牙签尖上并迅速将花粉块放至洁净无菌的Iml离 心管中，每管放入1朵花的花粉块，将放置了花粉块的离心管再用一无菌的玻璃瓶集中装 起来，并密封好，置于4°C避光保存。
5.根据权利要求1所述的火焰兰的杂交育种和无菌播种的方法，其特征在于，在步骤 (2)的无菌播种步骤，将种子萌发先形成的原球茎接种到分化培养基上，使原球茎在分化培 养基上形成小苗，所述的分化培养基是在种子萌发培养基的基础上每升添加6-卞基腺嘌 呤5. Omg,培养条件为温度M ，光照度1500 20001x，光照12 16小时/天。
6.根据权利要求1所述的火焰兰的杂交育种和无菌播种的方法，其特征在于，所述的 母本兰科植物为五唇兰(Doritis pulcherrima)、小花万代兰(Vanda coerulescens)或 彩心建兰(Cymbidium ensifolium)。
全文摘要
本发明公开了一种火焰兰的无菌播种和杂交育种的方法。它是选择具明显特性、观赏价值高的兰科植物作为杂交母本，以火焰兰作为父本，进行杂交，授粉成功得到的果实在基本成熟而未开裂时，在种子萌发培养基上进行无菌播种，种子萌发后再转移到壮苗培养基上培养，形成的试管苗经过自然光照下炼苗10～20天后出瓶栽培，成苗的移栽成活率可达90％以上。本发明具有杂交成功率高的特点，特别是对一些与火焰兰杂交亲本花期不遇的具明显特性、观赏价值高的兰科植物为杂交亲本时十分有效。本发明采用独特的培养基和培养方法，使得火焰兰杂交种子的萌发率高、成苗快、种苗品质好。本发明具有操作性强，育种效率和应用价值高等优点。
文档编号A01G31/02GK102144536SQ20111005682
公开日2011年8月10日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者吴坤林, 唐源江, 张建霞, 曾宋君, 段俊, 陈之林 申请人:中国科学院华南植物园