专利名称：一种东哥阿里发状根系的制备与培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物发状根系的制备与培养方法，特别涉及一种东哥阿里状根系的制备与培养方法，属生物细胞工程技术。
背景技术：
东哥阿里(TongkatAli)的学名是 Eurycoma longifolia Jack,属于苦木科(Simaroubaceae)。东哥阿里是一种生长缓慢的热带雨林灌木植物,主要分布于马来西亚、菲律宾、印度尼西亚和泰国等东南亚国家和地区。其根入药，常用于治疗疟疾、痢疾、口腔溃疡、猩红热、头痛等疾病，还具有增强男性性功能的功效，被称为“马来西亚人参”。近来研究表明，从该植物种提取的苦木碱(quassinoids)还有很好的抗肿瘤和抗HIV效果。东哥阿里属于雌雄异株植物。由于东哥阿里是世界著名的滋阴补阳药物植物，以及陆续发现新的药用功能，目前世界医药市场对原材料的需求量急剧上升；加上东哥阿里的生境属于热带雨林第五，分布面积较小，所以使东哥阿里产量不能满足市场需求。利用现代细胞工程技术制备药用植物发状根，并对发状根进行离体规模化培养，可以快速大量地提取植物体中有效化学成分，也是进行药用植物资源可持续发展的有效途径之一。由于发状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官化水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物质合成能力，并且发状根培养不受环境、生态、气候等条件的限制。因此，利用发状根培养技术标准化生产东哥阿里替代野生资源，可以缓解日益增长的市场需求，而且也将解决依赖进口原材料、提取物等花费大量外汇的问题。因此，建立东哥阿里发状根培养系统，大量生产东哥阿里替代原材料具有重要意义。目前，用发根农杆菌诱导形成的植物发状根涉及到31科100余种双子叶植物，而露水草(Cyanotis arachnoidea C. B. Clarke)是迄今单子叶植物中发状根诱导成功的唯一例子。发状根培养与传统栽培获得中草药原材料相比具有如下优点(I)发状根中染色体和次生代谢产物的生物合成相对稳定；(2)发状根不仅生长速度快，而且次生代谢产物含量高，(3)不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；(4)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效地回收与利用，简化了分离与纯化步骤；(5)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分；(6)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程 手段探索与创造新的合成路线，得到价值更高的产品；(7)节省大量用于种植原料的农田。正是由于发状根的上述优点，为其工业化、规模化生产优质中草药原材料提供了基础，成为继组织培养、细胞培养之后当代生物技术领域重要的研究和开发热点。利用植物发状根进行天然产物的生产进入了一个崭新的发展阶段，植物细胞培养技术生产的次生代谢产物被人类广泛应用。通过发状根培养可以生产的次生代谢产物有生物碱类(如莨菪烷生物碱、喹啉生物碱)、甙类、黄酮类、醌类和一些重要的酶(如超氧化物歧化酶)等。人参发状根的生长速度大大快于常规激素诱导根生长速度，而且组织中人参阜苷积累效率高(Yu et al, 2005 ；Murthy et al, 2005 ;Sivakumar et al, 2005);通过培养条件优化使莨菪发状根生长速度提高几倍至数十倍，而且发状根中莨菪碱的合成效率是原植物的 2 倍以上，(Rothe et al, 2001 ；Palazon et al, 2003 ；Dechaux & Boitel-Conti,2005 ；IMano etal，1986);我国学者对青蒿发状根进行了大量研究，结果表明优化培养条件可以改善青蒿素的合成与积累，发状根培养30d后生物量干重和青篙素产量分别达到
13.7g/L和0. 23g/L(ffang et al，2002 ;刘春超等，1999);郑明智等(2002)研究发现栝楼发状根生产天花粉蛋白克鲜重含量到8. 16毫克。这些研究表明，发状根培养体系正在成为生产次生代谢产物的重要生物技术之一，有些药用植物发状根已经进行了工业化和商业化阶段。目前利用生物细胞工程技术制备东哥阿里发状根系还未见相关文献报道。
发明内容
本发明目的是提供一种利用生物细胞工程技术高效制备、培养东哥阿里发状根系的方法。为实现本发明目的，本发明东哥阿里发状根系制备与培养方法通过如下步骤实现 取东哥阿里幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜东哥阿里愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(DC-AR2)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在东哥阿里愈伤组织处生长出东哥阿里发状根；抑菌培养后将具有发状根的外植体放入扩增培养基中进行发状根的扩大培养。所述东哥阿里幼嫩茎脱分化处理方法如下取I 2cm东哥阿里幼嫩茎段置于MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培养基中，25 °C ±3下暗培养10 35d，获得新鲜东哥阿里愈伤组织；所述发根农杆菌与东哥阿里愈伤组织共培养前，发根农杆菌先在固体YEB培养基中25°C ±3下暗培养I 6d ;然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于MS液体培养基中混匀；所述发根农杆菌与东哥阿里愈伤组织共培养培养基为含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基,共培养时间为Id ;所述诱导培养基为含有400mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基；所述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25V ±1暗黑培养，每2 9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；所述将抑菌处理后具有发状根的外植体放入发状根扩增培养是在25°C ±1暗黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素MS液体基本培养基；所述振荡培养箱摇床转速为100 IlOr mirT1。本发明东哥阿里发状根系诱导与培养方法具体为(I)将东哥阿里幼嫩茎剪成I 5cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理6 13min,酒精浸泡5 IOs,无菌水冲洗3 8遍后转入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C ±3下暗培养10 35d，获得东哥阿里愈伤组织。(2)将发根农杆菌DC-AR2菌株用无菌水稀释后，将其菌液涂布在YEB固体培养基上，25°C ±3下暗培养I 6d，长出克隆菌体，获得发根农杆菌A4克隆菌体。(3)挑取发根农杆菌A41单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25°C ±3振荡培养，培养12小时，OD值为0. 3 I. 2，取Iml菌液置于100ml YEB液体培养基中振荡培养，培养8h，OD值为0. 3 0. 9，收集菌液，3500rpm下离心5 15分钟收集菌体。(4)将步骤(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中并混匀。
(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染东哥阿里愈伤组织10 30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的东哥阿里愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、
0.7%琼脂的MS固体培养基中I 3d。(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将步骤(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25°C ±1暗黑培养，每2 9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)用无激素MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的诱导出来的发状根放入扩增培养基中，25°C ±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100 IlOr mirT1。本发明利用生物细胞工程技术建立东哥阿里发状根培养系统，制备东哥阿里发状根系，发状根生长速度快、无激素培养、不依赖气候和季节、自动化/管道化生长控制、节省人力，实现了标准化生产东哥阿里，替代野生资源，缓解了东哥阿里日益增长的市场需求，而且解决了东哥阿里依赖进口问题。对药用植物发状根的工业化和商业化开发具有重要意 义。
图I东哥阿里愈伤组织照片；图2本发明发根农杆菌介导Ri质粒转化东哥阿里愈伤组织产生发根的照片；图3本发明东哥阿里发状根扩增后悬浮培养的照片。
具体实施例方式下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实施例I甘露碱纸层析分析(I)材料本发明新诱导出的东哥阿里发根(NTR);经过继代培养的本发明发根(TR);器官根(NR)、叶片(L)或愈伤细胞(C)，发根农杆菌A4菌液；(2)农杆碱的提取分别取Ig上述样品，加Iml (0. 1M)HC1室温研磨，12，OOOrpm离心5min，取上清液lOiil，以微量进样器点样。(3)层析层析滤纸的制备将层析滤纸裁成8X8 (cm)规格，浸泡于0. 4mol/L的HCl溶液中24h，然后用蒸馏水淋洗，再依次用乙醇、乙醚洗涤后，平放在托盘上，30°C下凉
干，备用。(4)样品点样距层析滤纸底边I I. 5cm处划一直线，铅笔标记出等距离的点样线.以微量进样器点上5iU样品，边滴加边吹干。(5)层析展开干燥滤纸垂直置入密闭的已饱和层析罐，待液体上限距上边缘2 4cm时取出。(6)显色将滤纸吹干后，浸入0. 2% AgNO3丙酮液lmin，取出风干；然后浸入1%NaOH-甲醇液2 3min,最后用5%硫代硫酸钠液固定,观察并摄影。(7)结果对东哥阿里毛状根的农杆碱纸层分析，毛状根样品与农杆碱标准品点板斑点位置相近，此位置东哥阿里原植物及东哥阿里未侵染愈伤组织均没有此斑点。说明发根农杆菌基因已经存在植物基因组中并表达。实施例2
(I)将东哥阿里幼嫩茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理7min，酒精浸泡6s，无菌水冲洗4遍后转入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C ±2下暗培养12d，获得东哥阿里愈伤组织。(2)将发根农杆菌DC-AR2菌株用I ii L无菌水稀释后，将其菌液涂布在20mL YEB固体培养基上，25°C ±3下暗培养4d长出单克隆，获得发根农杆菌A4克隆菌体。(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C ±2振荡培养，OD值为
0.5，取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 5，收集菌液，3000rpm下离心7min收集菌体。(4)将步骤(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中并混匀。 (5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染东哥阿里愈伤组织12min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的东哥阿里愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中2d。(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将步骤
(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每7(1继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)把无激素MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的发状根外植体放入该扩增培养基中，25°C ±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100 IlOr mirT1。实施例3(I)将东哥阿里幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理lOmin，酒精浸泡8s，无菌水冲洗7遍后转入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，25°C ±2下暗培养30d，获得东哥阿里愈伤组织。 (2)将发根农杆菌DC-AR2菌株用I y L无菌水稀释后，将其菌液涂布在20mL YEB固体培养基上，25°C ±3下暗培养5d长出单克隆，获得发根农杆菌A4克隆菌体。。(3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，25°C ±2振荡培养，OD值为1，取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 7，收集菌液，3000rpm下离心IOmin收集菌体。(4)将步骤(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中并混匀。(5)用步骤(4)混匀后得到的菌液浸染东哥阿里愈伤组织25分钟，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的东哥阿里愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中2d。(6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将步骤
(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；每4(1继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。(7)把无激素MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的发状根外植体放入该扩增培养基中，25°C ±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100 IlOr mirT1。
权利要求
1.一种东哥阿里发状根系的制备与培养方法，其特征在于，通过如下步骤实现取东哥阿里幼嫩根茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜东哥阿里愈伤组织，将愈伤组织与与含有Ri质粒的发根农杆菌共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在东哥阿里幼茎表面生长出东哥阿里发状根；抑菌培养后将具有发状根的外植体放入扩增培养基中进行发状根的扩大培养。
2.如权利要求I所述的东哥阿里发状根系制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述东哥阿里幼嫩茎脱分化处理时，是取I 2cm东哥阿里幼嫩茎段置于MS+6-BAQ.5mg/jNAAQ.3mg/L培养基中，25°C ±3下暗培养10 35d，获得新鲜东哥阿里愈伤组织。
3.如权利要求I所述的东哥阿里发状根系制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述发根农杆菌与东哥阿里愈伤组织共培养前，发根农杆菌先在固体YEB培养基中25°C ±3下暗培养I 6d ;然后选取单克隆到液体YEB培养基中振荡培养，菌液离心收集菌体；将菌体置于MS液体培养基中混匀。
4.如权利要求I所述的东哥阿里发状根系制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述发根农杆菌与东哥阿里愈伤组织共培养培养基为含lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，共培养时间为Id ;所述诱导培养基为含有400mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基。
5.如权利要求I所述的东哥阿里发状根系制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述介导转化的外植体放入抑菌培养基中于25°C 土 I暗培养，每3 6d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净。
6.如权利要求I所述的东哥阿里发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法中所述将抑菌处理后具有发状根的外植体放入发状根扩增培养是在25°C ±1暗黑振荡培养；所述扩增培养基为无激素MS液体基本培养基，所述振荡培养箱摇床转速为100 IlOr mirf1。
7.如权利要求1-6任何一种所述的东哥阿里发状根系的制备与培养方法，其特征在于，该方法为 (1)将东哥阿里幼嫩茎剪成I 5cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理6 13min，酒精浸泡5 IOs,无菌水冲洗3 8遍后转入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，250C ±3下暗培养10 35d，获得东哥阿里愈伤组织； (2)将发根农杆菌DC-AR2菌株用无菌水稀释后，将其菌液涂布在YEB固体培养基上，250C ±3下暗培养I 6d，长出克隆菌体，获得发根农杆菌A4克隆菌体； (3)挑取发根农杆菌A4单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25°C±3振荡培养，培养12小时，OD值为0. 3 I. 2，取Iml菌液置于100ml YEB液体培养基中振荡培养，培养8h，OD值为0. 3 0. 9，收集菌液，3500rpm下离心5 15分钟收集菌体； (4)将(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0.7%琼脂的MS固体培养基中并混勻； (5)用(4)混匀后得到的菌液浸染东哥阿里愈伤组织10 30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的东哥阿里愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中I 3d; (6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25°C ± I暗黑培养，每2 9d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净； (7)用无激素MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的诱导出来的发状根放入扩增培养基中，25°C ±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100 IlOr HiirT1。
8.如权利要求7所述的东哥阿里发状根的制备与培养方法，其特征在于，该方法为 (1)将东哥阿里幼嫩根茎剪成2cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理7min，酒精浸泡6s，无菌水冲洗4遍后转入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，26°C ±1下暗培养12d，获得东哥阿里愈伤组织； (2)将发根农杆菌DC-AR2菌株用无菌水稀释后，将其菌液涂布在YEB固体培养基上，26°C ± I下暗培养4d长出单克隆，获得发根农杆菌A4克隆菌体； (3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，26°C± I振荡培养，OD值为0.5，取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 5，收集菌液，3，500rpm下离心7min收集菌体； (4)将(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0.7%琼脂的MS固体培养基中并混勻； (5)，用(4)混匀后得到的菌液浸染东哥阿里愈伤组织12min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的东哥阿里愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中2d ； (6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25°C ±1暗黑培养，每7d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净； (7)把无激素MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的发状根外植体放入该扩增培养基中，25°C ±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100 IlOr HiirT1。
9.如权利要求7所述的东哥阿里发状根的制备与培养方法，其特征在于，该方法为 (1)将东哥阿里幼嫩茎剪成4cm的小段，无菌操作台中用HgCl2处理lOmin，酒精浸泡8s，无菌水冲洗7遍后转入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培养基中，26°C ±1下暗培养30d，获得东哥阿里愈伤组织； (2)将发根农杆菌DC-AR2菌株用无菌水稀释后，将其菌液涂布在YEB固体培养基上，26°C ± I下暗培养4d长出单克隆，获得发根农杆菌A4克隆菌体； (3)挑取发根农杆菌A4克隆菌体置于YEB培养基中，26°C±1振荡培养，OD值为1，取Iml菌液置于IOOmlYEB液体培养基中振荡培养，OD值为0. 7，收集菌液，3，500rpm下离心12min收集菌体； (4)将(3)收集的菌体置于IOOml含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0.7%琼脂的MS固体培养基中并混勻； (5)用(4)混匀后得到的菌液浸染东哥阿里愈伤组织20min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的东哥阿里愈伤组织接入到含有lOOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%琼脂的MS固体培养基中2d ； (6)把含有400mg/L头孢噻肟钠的无激素MS固体培养基作为诱导培养基，将(5)浸染后的愈伤组织接入该诱导培养基中，进行抑菌继代培养；25°C ±1暗黑培养，每5d继代培养一次，至少五次的抑菌培养处理，直至将菌除净；(7)把无激 素MS液体基本培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后的发状根外植体放入该扩增培养基中，25°C ±1暗黑悬浮振荡培养，振荡摇床转速为100 IlOr HiirT1。
全文摘要
本发明公开了一种东哥阿里状根系的制备与培养方法，属生物细胞工程技术。该方法取东哥阿里幼嫩茎为外植体进行脱分化处理，获得新鲜东哥阿里愈伤组织，将愈伤组织与含有Ri质粒的发根农杆菌(DC-AR2)共培养，以无菌纸吸取多余菌液后转入到诱导培养基中诱导培养，在东哥阿里愈伤组织处生长出东哥阿里发状根；抑菌培养后将具有发状根的外植体放入扩增培养基中进行发状根的扩大培养。本发明利用生物细胞工程技术建立东哥阿里发状根培养系统，制备东哥阿里发状根系，实现了标准化生产东哥阿里，替代野生资源，缓解了东哥阿里日益增长的市场需求，而且解决了东哥阿里依赖进口问题。对药用植物发状根的工业化和商业化开发具有重要意义。
文档编号A01H4/00GK102754594SQ201110108319
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者于振艳, 刘同祥, 叶乾堂, 张宗申 申请人:张宗申, 河南省海乐森药用细胞工程技术有限公司