专利名称：一种花曲柳的微繁方法
技术领域：
本发明涉及一种微繁方法。
背景技术：
花曲柳(Fraxinus rhynchophylla)是木犀科白蜡树属的落叶大乔木，是我国东北东部山地的重要经济硬阔树种。花曲柳抗逆性较强且具有较强的观赏性。花曲柳木材及各种制品在国际及国内市场上供不应求，价格昂贵，具有很高的经济价值。花曲柳用种子繁殖。目前我国尚未有花曲柳采种母树林和种子园，现有的花曲柳母树均为野生状态，且数量不多。生产和科学研究中用播种繁殖的方法培育花曲柳苗木。播种繁殖的方式存在多种缺点1、实生苗生长周期长，成型慢(树木幼龄期长，需要6-8年才结实)；2、采种母树不足，种子数量没有保障(成年后母树具有明显的结实间隔期，间隔期为1-3年)；3、种子收集困难(花曲柳为高大乔木，树高达15米)，种子质量没有保障(种子常有虫害)；4、种子繁殖易产生变异，后代的遗传性状经常不能和母本保持一致，存在苗木长势不齐等问题。因此很难在短时间内繁殖出大量、优质的苗木以满足造林生产实践对花曲柳优质苗木的需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决花曲柳苗木繁殖中繁殖周期长、增殖效率低、后代遗传稳定性差的问题，而提供的一种花曲柳的微繁方法。花曲柳的微繁方法按以下步骤实现一、取花曲柳的种子进行消毒处理，剥离出合子胚，切取合子胚的单片子叶接种到含0. 25 0. 75mg/L细胞分裂素、0. 5 2. Omg/L生长素、100 700mg/L的酸性水解酪蛋白、30 100g/L蔗糖和5 7g/L琼脂的诱导培养基上， 在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、无光照的条件下培养2 4周，得子叶形体细胞胚；二、将子叶形体细胞胚接种到含30 100g/L蔗糖和5 7g/L琼脂的成熟培养基上，在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、光照强度为20 60μπιΟ1 · πΓ2 · s—1、每天光照16 20h的条件下培养3 5周；三、将经过成熟培养的子叶形体细胞胚接种到含30 100g/L蔗糖和5 7g/ L琼脂的萌发培养基上，在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、光照强度为20 60 μ mol · m_2 · 每天光照16 20h的条件下培养1 7周，得再生植株；四、将生根并具有3片以上叶片的再生植株用清水洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为20 30°C、湿度为60% 80%、光照强度为40 80 μ mol · πΓ2 · s—1、每天光照12 18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，得花曲柳苗木，即完成花曲柳的微繁；其中步骤一中诱导培养基为MS1/2培养基(MS培养基中所有成分浓度减半)、MS 培养基、V2MS培养基(MS培养基中大量元素浓度减半)、DKW培养基或WPM培养基，pH值均为5 6 ；步骤一中细胞分裂素为苄基腺嘌呤(BA)、玉米素(ZT)、激动素(KT)或噻苯隆 (TDZ)；步骤一中生长素为2，4-二氯苯氧乙酸0，4-D)、萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)；步骤二中成熟培养基为MS1/2培养基(MS培养基中所有成分浓度减半)、MS培养基、V2MS培养基(MS培养基中大量元素浓度减半)、DKW培养基或WPM培养基，pH值均为 5 6 ；步骤三中萌发培养基为MS1/2培养基(MS培养基中所有成分浓度减半)、MS培养基、V2MS培养基(MS培养基中大量元素浓度减半)、DKW培养基或WPM培养基，pH值均为 5 6 ；步骤四中栽培基质按体积份数比由5份的草炭土、4份的蛭石和1份的珍珠岩组成。本发明花曲柳的微繁(即体细胞胚发生途径的植株再生)，可诱导出同时具有幼根、幼芽的双极性结构——体细胞胚，体细胞胚可直接萌发形成完整的再生植株，比分别诱导出不定芽、不定根的器官发生方式具有遗传稳定、繁殖周期短、再生频率高的特点，更有利于实现苗木的自动化生产。本发明中的技术方法苗木繁殖周期短、繁殖速度快(培养 60 70天即可得到完整的再生植株)，增殖效率高(每1个外植体，即合子胚的单片子叶， 可以产生15 20个体细胞胚)，体细胞胚萌发率高达87% 89. 55 %，再生植株移栽成活率达75% 80%。本发明可以实现缩短繁殖周期、提高繁殖效率的目标，而且本发明可大量生产与母本具有相同优良性状的再生植株。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式花曲柳的微繁方法按以下步骤实现一、取花曲柳的种子进行消毒处理，剥离出合子胚，切取合子胚的单片子叶接种到含0. 25 0. 75mg/L细胞分裂素、0. 5 2. Omg/L生长素、100 700mg/L的酸性水解酪蛋白、30 100g/L蔗糖和 5 7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、无光照的条件下培养2 4周，得子叶形体细胞胚；二、将子叶形体细胞胚接种到含30 100g/L蔗糖和5 7g/L琼脂的成熟培养基上，在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、光照强度为20 60μπιΟ1 · πΓ2 · s—1、每天光照16 20h的条件下培养3 5周；三、将经过成熟培养的子叶形体细胞胚接种到含30 100g/L蔗糖和5 7g/ L琼脂的萌发培养基上，在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、光照强度为20 60 μ mol · m_2 · 每天光照16 20h的条件下培养1 7周，得再生植株；四、将生根并具有3片以上叶片的再生植株用清水洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为20 30°C、湿度为60% 80%、光照强度为40 80 μ mol · πΓ2 · s—1、每天光照12 18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，得花曲柳苗木，即完成花曲柳的微繁；其中步骤一中诱导培养基为MSlA培养基(MS培养基中所有成分浓度减半)、MS 培养基、V2MS培养基(MS培养基中大量元素浓度减半)、DKW培养基或WPM培养基，pH值均为5 6 ；步骤一中细胞分裂素为苄基腺嘌呤(BA)、玉米素(ZT)、激动素(KT)或噻苯隆 (TDZ)；步骤一中生长素为2，4-二氯苯氧乙酸Q，4-D)、萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)；步骤二中成熟培养基为MS 1/2培养基(MS培养基中所有成分浓度减半)、MS培养基、V2MS培养基(MS培养基中大量元素浓度减半)、DKW培养基或WPM培养基，pH值均为 5 6 ；步骤三中萌发培养基为MS1/2培养基(MS培养基中所有成分浓度减半)、MS培养基、V2MS培养基(MS培养基中大量元素浓度减半)、DKW培养基或WPM培养基，pH值均为 5 6 ；步骤四中栽培基质按体积份数比由5份的草炭土、4份的蛭石和1份的珍珠岩组成。本实施方式步骤一中花曲柳的种子为花曲柳不同发育时期的种子，即含有未成熟合子胚的种子和含有成熟合子胚的种子。本实施方式步骤一中合子胚的单片子叶是以与培养基表面平行的方式接种到培养基表面上。本实施方式步骤二中成熟培养基中不添加任何植物生长调节物质。本实施方式步骤三中经过成熟培养的子叶形体细胞胚以子叶向上的方向垂直接种到萌发培养基上。本实施方式步骤四中移植后的培养过程中每天用喷雾器喷水1 2次。本实施方式中涉及的MS培养基、1/2MS培养基、MS1/2培养基、DKW培养基和WPM 培养基的成分如表1所示。表 权利要求
1.一种花曲柳的微繁方法，其特征在于花曲柳的微繁方法按以下步骤实现一、取花曲柳的种子进行消毒处理，剥离出合子胚，切取合子胚的单片子叶接种到含0. 25 0. 75mg/L细胞分裂素、0. 5 2. Omg/L生长素、100 700mg/L的酸性水解酪蛋白、30 100g/L蔗糖和5 7g/L琼脂的诱导培养基上，在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、 无光照的条件下培养2 4周，得子叶形体细胞胚；二、将子叶形体细胞胚接种到含30 100g/L蔗糖和5 7g/L琼脂的成熟培养基上， 在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、光照强度为20 60μπιΟ1 · πΓ2 · s—1、每天光照 16 20h的条件下培养3 5周；三、将经过成熟培养的子叶形体细胞胚接种到含30 100g/L蔗糖和5 7g/ L琼脂的萌发培养基上，在温度为20 30°C、湿度为40% 70%、光照强度为20 60 μ mol · m_2 · 每天光照16 20h的条件下培养1 7周，得再生植株；四、将生根并具有3片以上叶片的再生植株用清水洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中并浇透水，在温度为20 30°C、湿度为60% 80%、光照强度为40 IOOymol ·πΓ2 · s—1、每天光照12 18h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，得花曲柳苗木，即完成花曲柳的微繁；其中步骤一中诱导培养基为MS1/2培养基、MS培养基、1/2MS培养基、DKW培养基或WPM 培养基，PH值均为5 6;步骤一中细胞分裂素为苄基腺嘌呤、玉米素、激动素或噻苯隆；步骤一中生长素为2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸或吲哚丁酸；步骤二中成熟培养基为MS1/2培养基、MS培养基、1/2MS培养基、DKff培养基或WPM培养基，pH值均为5 6 ；步骤三中萌发培养基为MS1/2培养基、MS培养基、1/2MS培养基、DKff培养基或WPM培养基，pH值均为5 6 ；步骤四中栽培基质按体积份数比由5份的草炭土、4份的蛭石和1份的珍珠岩组成。
2.根据权利要求1所述的一种花曲柳的微繁方法，其特征在于步骤一中消毒处理的过程为剥除包被在种子外面的果皮，流水冲洗种子20 40min，用体积浓度70% 80%的酒精浸泡种子30 120s，然后用体积浓度2% 6%的Natno浸泡种子10 20min进行体表灭菌，再用无菌水冲洗浸泡后的种子3 7次。
3.根据权利要求1所述的一种花曲柳的微繁方法，其特征在于步骤一中在温度为 25°C、湿度为50%、无光照的条件下培养2周，得子叶形体细胞胚。
4.根据权利要求1所述的一种花曲柳的微繁方法，其特征在于步骤二中在温度为 25°C、湿度为60%、光照强度为40 μ mol · πΓ2 · s—1、每天光照18h的条件下培养4周。
5.根据权利要求1所述的一种花曲柳的微繁方法，其特征在于步骤三中在温度为 27°C、湿度为70%、光照强度为50 μ mol ·πΓ2 · s_\每天光照20h的条件下培养3周，得再生植株。
6.根据权利要求1所述的一种花曲柳的微繁方法，其特征在于步骤四中在温度为 25°C、湿度为80%、光照强度为70μπιΟ1 · m_2 · s_\每天光照16h的条件下用塑料薄膜覆盖容器口培养至新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，得花曲柳苗木。
全文摘要
一种花曲柳的微繁方法，它涉及一种微繁方法。它解决了花曲柳苗木繁殖中繁殖周期长、增殖效率低、后代遗传稳定性差的问题。方法一、取花曲柳种子进行消毒处理，取合子胚的单片子叶进行培养并得到子叶形体细胞胚；二、子叶形体细胞胚进行成熟培养；三、经过成熟培养的子叶形体细胞胚进行萌发培养，得再生植株；四、将再生植株移植到栽培基质中培养至新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜即完成。本发明苗木繁殖周期短、繁殖速度快(培养60～70天即可)，增殖效率高(每1个外植体可产生15～20个体细胞胚)，体细胞胚萌发率高达87％～89.55％，再生植株移栽成活率达75％～80％，且可大量生产与母本具有相同优良性状的再生植株。
文档编号A01H4/00GK102228001SQ20111010895
公开日2011年11月2日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者单琳, 杨玲, 沈海龙 申请人:东北林业大学, 杨玲, 沈海龙