专利名称：一种利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法
技术领域：
本发明属于黄芩苷的人工培育及生产技术领域，涉及一种利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法。
背景技术：
黄芩苷为黄芩的主要有效成分，是评价黄芩质量重要的指标之一。现代药理学研究表明，黄芩苷具有清除氧自由基及抗氧化、免疫调节、抗炎、抗菌与抗肿瘤作用，特别是近年国际上关于黄芩苷在抗HIV方面的研究，使得黄芩苷的产品开发呈上升之势。随着对黄芩苷研究的深入，市场需求不断扩大。利用生物技术生产黄芩苷，保护黄芩野生资源，满足市场需求具有广阔的前景。研究表明黄芩属黄芩毛状根可以有效合成黄芩苷等药用成分。 进行黄芩毛状根离体培养生产次生代谢产物黄芩苷，是黄芩苷产品可持续发展的有效途径之一。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，提高黄芩毛状根的生物生成量，经过提取之后获得高纯度的黄芩苷，为药用成分黄芩苷工业化生产提供新技术。本发明是通过以下技术方案来实现一种利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，包括以下步骤1)按照5 8g/L的接种量，将黄芩毛状根接种到种子培养基，110r/min、25 28°C避光培养15 40d，获得黄芩毛状根种子；所述的种子培养基为添加30 50g/L葡萄糖或蔗糖、0 0. 3mmol/L苯丙氨酸的MS培养液；再按照5 10g/L接种量，将毛状根种子接种于发酵培养基，110r/min,20 28°C 避光培养20 30d，收获黄芩毛状根；所述的发酵培养基为添加0. 4 0. 7mmol/L苯丙氨酸、50 70g/L蔗糖或葡萄糖的MS培养液；2)将收获的黄芩毛状根加入到其质量10 20倍的水中，煎煮90 120min，过滤收集滤液并浓缩，然后调节其pH为1. 5 2. 0,60 80°C保温30min，静置后过滤；将沉淀物用水溶解并调节pH为6. 5 7. 0，再添加1 3倍体积的乙醇，过滤收集滤液并调节pH为7. 5 8. 5，静置后过滤；将滤液调PH为1. 5 2. 0，60 80°C保温30min，静置，过滤，乙醇洗涤沉淀物，干
燥后得到黄芩苷。所述的黄芩毛状根种子培养级数由发酵培养的规模确定，分为两级培养按照5 8g/L的接种量，将黄芩毛状根接种到种子一级培养基，110r/min、25 28°C避光培养15 20d，获得黄芩毛状根一级种子；按照5 10g/L的接种量，将黄芩毛状根一级种子接种到种子二级培养基，110r/min、25 28°C避光培养15 18d获得毛状根二级种子；
所述的种子一级培养基为添加30 50g/L葡萄糖或蔗糖的MS培养液，种子二级培养基为添加30 50g/L葡萄糖或蔗糖、0. 1 0. 3mmol/L苯丙氨酸的MS培养液。所述的毛状根种子接种于发酵培养基之后，在前18 22d在26 28°C培养，在后 2 12d在20 22°C培养。所述的将黄芩毛状根煎煮之后的滤液浓缩1/3 2/3。与现有技术相比，本发明具有以下技术效果1、本发明公开的黄芩毛状根生产黄芩苷的工艺，首先通过培养条件的优化，尤其是有利于黄芩苷生长的前体苯丙氨酸的添加和碳源的改善，大大的提高了黄芩次生代谢产物产量，且不受自然条件影响、不占用土地、产品质量可控，无农药残留；然后再通过碱提酸沉的提取工艺进行黄芩苷的提取，能够获得高产量、高纯度的黄芩苷黄芩苷提取率为 15 18 %，精制后黄芩苷纯度为85 95 %。2、本发明公开的黄芩毛状根生产黄芩苷的工艺，所得黄芩毛状根黄芩苷的含量高达17. 60 21. 45%，显著高于文献报道的黄芩道地药材(产地河北承德)黄芩苷的最高含量12. 05士 1.73%，也显著高于2010版药典中药用黄芩含黄芩苷(C21H18O11)不得少于 9.0%的规定。3、本发明公开的黄芩毛状根生产黄芩苷的工艺，由于其培养条件的改善，黄芩毛状根生产周期较短(为50 68d/批)，在工业生产中可操作性强，通过毛状根生产黄芩苷产量为2. 58kg/m3 ·月。
图1是从黄芩毛状根中提取黄芩苷的工艺流程图。
具体实施例方式本发明公开一种利用黄芩毛状根生产黄芩苷的工艺，选取黄芩毛状根进行种子扩大培养后接种到毛状根发酵培养基培养黄芩毛状根，收获毛状根迅速灭酶后提取分离黄芩毛状根中的黄芩苷。下面结合具体的发酵工艺、黄芩苷提取分离工艺及黄芩苷的含量测定对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例1参见图1，利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，包括以下步骤1)选取优良黄芩毛状根株系，按照5g/L的接种量，接种到种子培养基，110r/min, 25°C避光培养20d获得毛状根种子，种子培养级数由发酵培养的规模确定；所述的种子培养基为添加40g/L葡萄糖、0. 2mmol/L苯丙氨酸的MS培养液；再按照10g/L接种量，将毛状根种子接种到毛状根发酵培养基，110r/min、20 28°C变温(第0 18d 28°C，第19 23d 20°C )、避光培养23d收获黄芩毛状根；所述的发酵培养基为添加0. 5mmol/L苯丙氨酸、60g/L葡萄糖的MS培养液；2)将收获的黄芩毛状根加入到其质量18倍的水中，煎煮llOmin，过滤收集滤液并浓缩，然后调节其pH为1. 5 2. 0，80°C保温30min，静置后过滤；将沉淀物用水溶解并调节pH为6. 5 7. 0，再添加2倍的乙醇，过滤收集滤液并调节pH为7. 5 8. 5，静置后过滤；
将滤液调pH为1. 5 2. 0，80°C保温30min，静置，过滤，乙醇洗涤沉淀物，干燥后得到黄芩苷。实施例2参见图1，利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，包括以下步骤1)选取优良黄芩毛状根株系，按照8g/L的接种量，接种到种子一级培养基，IlOr/ min、28°C避光培养15d获得毛状根一级种子，按照10g/L接种量将一级毛状根种子接种到种子二级培养基，110r/min、25°C避光培养18d获得毛状根二级种子，种子培养级数由发酵培养的规模确定；所用的一级种子培养基为添加40g/L葡萄糖的MS培养液；所用的二级种子培养基为添加50g/L蔗糖、0. 3mmol/L苯丙氨酸的MS培养液。再按照10g/L接种量，将毛状根二级种子接种到毛状根发酵培养基，llOr/min、 20 28°C变温(0 22d 28°C，23 30d 20°C )、避光培养30d收获黄芩毛状根；所述的发酵培养基为添加0. 4mmol/L苯丙氨酸、70g/L葡萄糖的MS培养液；2)将收获的黄芩毛状根加入到其质量20倍的水中，煎煮两次，每次50min，过滤， 合并收集的滤液并浓缩，然后调节其pH为1. 5 2. 0，80°C保温30min，静置后过滤；将沉淀物用水溶解并调节pH为6. 5 7. 0，再添加等体积的乙醇，过滤收集滤液并调节pH为7. 5 8. 5，静置后过滤；将滤液调pH为1. 5 2. 0，60°C保温30min，静置，过滤，乙醇洗涤沉淀物，干燥后得到黄芩苷。实施例3参见图1，利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，包括以下步骤1)选取优良黄芩毛状根株系，按照8g/L的接种量，接种到种子培养基，110r/min, 25°C避光培养18d获得毛状根种子，种子培养级数由发酵培养的规模确定；所述的种子培养基为添加50g/L蔗糖、0. lmmol/L苯丙氨酸的MS培养液；再按照8g/L接种量，将毛状根种子接种到毛状根发酵培养基，在110r/min、20 28°C变温(0 20d 28°C，21 26d 20°C )、避光培养26d收获黄芩毛状根；所述的发酵培养基为添加0. 6mmol/L苯丙氨酸、60g/L葡萄糖的MS培养液；2)将收获的黄芩毛状根加入到其质量15倍的水中，煎煮120min，过滤收集滤液并浓缩，然后调节其pH为1. 5 2. 0，80°C保温30min，静置后过滤；将沉淀物用水溶解并调节pH为6. 5 7. 0，再添加3倍体积的乙醇，过滤收集滤液并调节pH为7. 5 8. 5，静置后过滤；将滤液调pH为1. 5 2. 0，80°C保温30min，静置，过滤，乙醇洗涤沉淀物，60°C干燥后得到。实施例4参见图1，利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，包括以下步骤1)选取优良黄芩毛状根株系，按照8g/L的接种量，接种到种子一级培养基，IlOr/ min、25°C避光培养20d获得毛状根一级种子，按照5g/L接种量将一级毛状根种子接种到种子二级培养基，110r/min、25°C避光培养15d获得毛状根二级种子，种子培养级数由发酵培养的规模确定；
所用的一级种子培养基为添加30g/L蔗糖的MS培养液；所用的二级种子培养基为添加40g/L蔗糖、0. lmmol/L苯丙氨酸的MS培养液。再按照8g/L接种量，将毛状根二级种子接种到毛状根发酵培养基，llOr/min、 20 28°C变温(第0 20d 28°C，第10 25d 20°C )、避光培养25d收获黄芩毛状根；所述的发酵培养基为添加0. 5mmol/L苯丙氨酸、60g/L葡萄糖的MS培养液；2)将收获的黄芩毛状根加入到其质量20倍的水中，煎煮两次，每次50min，过滤， 合并收集的滤液并浓缩至1/3体积，然后调节其pH为1. 5 2. 0，60°C保温45min，静置后过滤；将沉淀物用水溶解并调节pH为6. 5 7. 0，再添加2倍体积的乙醇，过滤收集滤液并调节pH为7. 5 8. 5，静置后过滤；将滤液调pH为1. 5 2. 0，60°C保温45min，静置，过滤，乙醇洗涤沉淀物，60°C干燥后得到黄芩苷。实施例5参见图1，利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，包括以下步骤1)选取优良黄芩毛状根株系，按照6g/L的接种量，接种到种子一级培养基，IlOr/ min、26°C避光培养18d获得毛状根一级种子，按照8g/L接种量将一级毛状根种子接种到种子二级培养基，110r/min、26°C避光培养18d获得毛状根二级种子，种子培养级数由发酵培养的规模确定；所用的一级种子培养基为添加50g/L葡萄糖的MS培养液；所用的二级种子培养基为添加45g/L蔗糖、0. 2mmol/L苯丙氨酸的MS培养液。再按照8g/L接种量，将毛状根二级种子接种到毛状根发酵培养基，llOr/min、 20 28°C变温(第0 22d 28°C，第22 30d 20°C )、避光培养30d收获黄芩毛状根；所述的发酵培养基为添加0. 6mmol/L苯丙氨酸、65g/L蔗糖的MS培养液；2)将收获的黄芩毛状根加入到其质量15倍的水中，煎煮两次，每次60min，过滤， 合并收集的滤液并浓缩至2/3体积，然后盐酸调节其pH为1. 5 2. 0，80°C保温30min，静置后过滤；将沉淀物用水溶解并调节pH为6. 5 7. 0，再添加2倍体积的乙醇，过滤收集滤液并调节pH为7. 5 8. 5，静置后过滤；将滤液调pH为1. 5 2. 0，60°C保温30min，静置，过滤，乙醇洗涤沉淀物，60°C干燥后得到黄芩苷。对于所提取的黄芩苷采用高效液相色谱法测定其含量检测方法采用药典所规定的方法，用色谱柱为化学键合型十八烷基柱(SCiClS色谱柱)，检测器为PUMP K-1001、K-1501，流动相为甲醇水磷酸=50 50 0.2，检测波长为274nm，柱温为室温，流速为lmL/min。对黄芩毛状根培养，以50 68d为一个周期，黄芩毛状根产量为10 12kg/m3 周期，黄芩苷含量达毛状根干重的17. 60 21. 45% ；显著高于文献报道的黄芩道地药材(产地河北承德)黄芩苷的最高含量12. 05士 1.73%。也显著高于2010版药典中药用黄芩含黄芩苷(C21H18O11)不得少于9.0%的规定。黄芩苷提取分离工艺得黄芩苷提取率为15 18%，精制后黄芩苷纯度为85 95 %，可满足高纯度黄芩苷的需求。
权利要求
1.一种利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，其特征在于，包括以下步骤1)按照5 8g/L的接种量，将黄芩毛状根接种到种子培养基，110r/min、25 28°C避光培养15 40d，获得黄芩毛状根种子；所述的种子培养基为添加30 50g/L葡萄糖或蔗糖、0 0. 3mmol/L苯丙氨酸的MS培养液；再按照5 10g/L接种量，将毛状根种子接种于发酵培养基，110r/min、20 28°C避光培养20 30d，收获黄芩毛状根；所述的发酵培养基为添加0. 4 0. 7mmol/L苯丙氨酸、 50 70g/L蔗糖或葡萄糖的MS培养液；2)将收获的黄芩毛状根加入到其质量10 20倍的水中，煎煮90 120min，过滤收集滤液并浓缩，然后调节其pH为1. 5 2. 0,60 80°C保温30 45min，静置后过滤；将沉淀物用水溶解并调节pH为6. 5 7. 0，再添加1 3倍的乙醇，过滤收集滤液并调节pH为7. 5 8. 5，静置后过滤；将滤液调pH为1. 5 2. 0,60 80°C保温30 45min，静置，过滤，乙醇洗涤沉淀物， 干燥后得到黄芩苷。
2.如权利要求1所述的利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，其特征在于，所述的黄芩毛状根种子培养级数由发酵培养的规模确定，分为两级培养按照5 8g/L的接种量，将黄芩毛状根接种到种子一级培养基，110r/min、25 28°C 避光培养15 20d，获得黄芩毛状根一级种子；按照5 10g/L的接种量，将黄芩毛状根一级种子接种到种子二级培养基，110r/min、25°C避光培养15 18d获得毛状根二级种子；所述的种子一级培养基为添加30 50g/L葡萄糖或蔗糖的MS培养液，种子二级培养基为添加30 50g/L葡萄糖或蔗糖、0. 1 0. 3mmol/L苯丙氨酸的MS培养液。
3.如权利要求1所述的利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，其特征在于，所述的毛状根种子接种于发酵培养基之后，在前18 22d在26 28°C培养，在后2 12d在20 22°C培养。
4.如权利要求1所述的利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，其特征在于，所述的将黄芩毛状根煎煮之后的滤液浓缩1/3 2/3。
全文摘要
本发明公开了一种利用黄芩毛状根生产黄芩苷的方法，选取黄芩毛状根进行种子扩大培养后，接种到毛状根发酵培养基培养黄芩毛状根，收获毛状根后提取分离黄芩毛状根中的黄芩苷。本发明培养的黄芩毛状根产量为10～12kg/m3·周期，黄芩苷含量达毛状根干重的17.60～21.45％；黄芩苷提取分离工艺得黄芩苷提取率为15～18％，精制后黄芩苷纯度为85～95％。
文档编号A01H4/00GK102311469SQ20111027634
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者张雯, 李雅, 郭乐康, 陈秀清, 齐香君 申请人:陕西科技大学