专利名称：微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因(Ms-Δ6-FAD)及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(MS-A6-FAD)基因及其制备与用途。
背景技术：
γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)是一种多功能油脂成分。许多研究表明 GLA具有多种重要的生理活性作用，它在机体的物质代谢和生理调控上发挥着十分重要的作用降血脂、抗血栓性心脑血管、预防和治疗高血压、动脉粥样硬化、增强人体的免疫功能，GLA还具有抗革兰氏阴性菌和阳性菌、抗HIV感染、抗肿瘤、抗多种炎症、抗脂质过氧化、 抑制溃疡和增强胰岛素和减肥等方面的作用，参见董杰明等“ Y-亚麻酸的保健作用”《卫生研究》2003，32 (3) :299-301。Δ 6-脂肪酸脱氢酶(Δ 6-FAD)基因是介导GLA合成的关键酶基因。
发明内容
本发明提供一种取自我国特有物种-微孔草的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，以及这种基因的制备方法及用途，该基因表达可以使低温胁迫下的微孔草积累Y-亚麻酸，在转基因植物中的表达使其产生了新性状。微孔草(Microula sikkimensis Hemsl.)系紫草科微孔草属，为二年生草本植物， 主要分布于陕西西南部、甘肃、青海、四川西部、云南西北部、西藏藏东和南部，参见中国科学院中国植物志编辑委员会《中国植物志》北京科学出版社，1990151-175。本发明所涉及的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法是首先提取微孔草的 RNA，再反转录为cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物PI、Ρ2 ；以得到的微孔草cDNA为模板扩增得到微孔草△-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段核苷酸序列；根据测序得到的Ms- Δ 6-FAD基因核心片段序列分别设计微孔草△ -6脂肪酸脱氢酶基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的5’P和5’NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的微孔草△-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的3’ P和3’ NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长翻译区核苷酸序列。在P7、P8引物的5’端分别加入Nco I和Bste II酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。实验表明，冷冻胁迫)进行的96小时期间，微孔草叶片中Y-亚麻酸含量明显上升，低温可以诱导其积累。构建MS-A6-FAD的表达载体，转染烟草后得到的转基因植物产生了新性状野生型烟草叶片和种子中无Y-亚麻酸，而转基因烟草其含量分别占总脂肪酸的16. 3%和4.8%。据报道，不饱和脂肪酸的增加与植物抗生物(病原体、植物病原体互做等)和非生物胁迫(低温、干旱、盐、重金属等)密切相关，参见Robert G. Upchurch "Fatty acid unsaturation, mobilization, and regulation in the response of plants to stress" Biotechnol Lett (2008) 30 :967_977，因此，微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因有可能在这些过程中发挥作用。采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下Pl :5，-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3，Ρ2 5，-ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG-3，Ρ3 :5， -CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3，Ρ4 5' -TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3，5 ’ P 为5 ’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，5， NP 为5， -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3，；Ρ5 :5， -TGGTACCCATTGCTTCTTTCTTATTTGC-3，Ρ6 5，-AATATAATTGTGCATCATTCTCTAAGGC-3，3 ’ P 为5 ’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，3， NP 为5， -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，Ρ7 :5’ -CTCCCATGGATGGCTGCTAAAATC-3’Ρ8 :5’ -GGCGGTCACCTCAGCTAATCTTAACCA-3’其中R= A or G ;Y = C or T ;S = C or G。本发明所涉及的微孔草Δ -6脂肪酸脱氢酶基因(Ms- Δ 6_FAD)的序列为SEQNo 1 或 SEQ No :10ο本发明所涉及的微孔草Δ -6脂肪酸脱氢酶基因(Ms- Δ 6_FAD)可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。微孔草富含Y-亚麻酸(表1)，参见高有为，樊铁“微孔草-一种待开发的富含 Y-亚麻酸的新油源”。《中国粮油学报》1998 13(2) :22-24.表1微孔草和其它植物油的Y -亚麻酸的含量比较
权利要求
1.微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，其特征是SEQNo :1。
2.微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因，其特征是SEQNo :10。
3.权利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法，其特征是将提取的微孔草RNA反转录为cDNA ；利用GenBank中已公布的其它植物的Δ -6脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物Ρ1、Ρ2 ； 以得到的微孔草cDNA为模板扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段核苷酸序列；根据测序得到的HPT基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物5’端外侧引物Ρ3和巢式引物Ρ4，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的5’ P和5’ NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的微孔草△-6脂肪酸脱氢酶基因核心片段序列分别设计微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer 试剂盒中自带的3’ P和3’ NP配对，以微孔草cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因5’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因的全长翻译区核苷酸序列。
4.权利要求3所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因制备方法中所用的相关引物，其特征是上游引物Pl为Pl :5，-TAYAGSAAGCTTGTGTTTGAG-3， 下游引物P2为P2 :5， -ARTTCTTSGGGAGCGGCTTGG-3， P3 :5’ -CGGAAAGACAATTTGCAAACAGAATACC-3’ P4 :5’ -TACCCAAACAGACTCAAAAAACAAAACC-3’ 5’ P 为5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’， 5’ NP 为5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ ； P5 :5， -TGGTACCCATTGCTTCTTTCTTATTTGC-3， P6 :5’ -AATATAATTGTGCATCATTCTCTAAGGC-3， 3’ P 为5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’， 3’ NP 为5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3， P7 5' -CTCCCATGGATGGCTGCTAAAATC-3‘ P8 :5’ -GGCGGTCACCTCAGCTAATCTTAACCA-3’ 其中R = A+G ；Y = C+T ；S = C+G。
5.权利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在油料作物的转基因工作中的应用。
6.权利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在牧草作物的转基因工作中的应用。
7.权利要求1或2所述的微孔草△-6脂肪酸脱氢酶基因在除权利要求4或5所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。
8.权利要求1或2所述的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶基因在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。
全文摘要
本发明公开微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因的制备是用微孔草基因的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的(Ms-Δ6-FAD)基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因的全长翻译区核苷酸序列；本发明的微孔草Δ-6脂肪酸脱氢酶(Ms-Δ6-FAD)基因在微孔草冷冻胁迫过程中累积，与其抗冻性相关；利用转基因技术进行的功能验证说明该基因表达可以使烟草叶片和种子中产生γ-亚麻酸。该基因可用应用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。
文档编号A01H5/00GK102424827SQ20111028104
公开日2012年4月25日 申请日期2011年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者傅华, 吴淑娟, 张丽静 申请人:兰州大学