专利名称：黄花乌头转基因苗及其获得方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黄花乌头转基因苗及其获得方法。
技术背景
关附甲素是一种治疗心绞痛的特效药品，为一类新药，用量极微就有很好的疗效。 目前，国内主要是从黄花乌头(Aconitum Coreanum(Levi. ) Rapaics)根(关白附)内提取关附甲素供药用。但天然黄花乌头株纤细，高达2米左右，常受气候的影响，且生产的季节性强，易受风害及病害，这会严重影响黄花乌头的产量和质量；加之黄花乌头生长周期长， 需5年才能采收1次，受气候及病虫害影响大，质量不稳定；并且，其根头小，单产低，严重制约黄花乌头在生产上的应用。
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes, Ar.)为根瘤菌科，革兰氏阴性菌，根据来源不同，发根农杆菌分为8196和A4两大类，前者是从苹果树上分离得到的，致毒力较弱， 后者是从玫瑰植株上分离得到的，致毒力较强。A4型菌株导致的转化组织合成各种农杆碱 (agropine)，因此，又通常称之为农杆碱型菌株。发根农杆菌感染植物细胞后产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根(hairy root), 简称为毛根或发根。发根农杆菌细胞内含有Ri质粒(rootinducing plasmid)，其大小为 200 8001Λ。Ri质粒上含有T-DNA，其能转化植物细胞，表现发根性状。Ri质粒具有普通的质粒的特点是细菌染色体外的遗传物质，能独立复制，为闭合环状双链DNA，可自我复制并具有遗传的稳定性，在特殊环境中对细菌的生存起着重要的作用，它具有可转移性、可重组性、可整合性、可消除性等特点，该质粒上存在的RolC基因。发明内容
本发明的目的是提供一种培育黄花乌头苗的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤
1)将黄花乌头发根进行诱导培养，得到愈伤组织；
2)将步骤1)得到的愈伤组织进行脱分化培养，得到黄花乌头苗。
所述黄花乌头发根按照如下方法制备，将含有目的外源基因的重组发根农杆菌导入黄花乌头叶片中(将Ri质粒上rolC转入叶片细胞)，得到黄花乌头发根；所述含有目的外源基因的重组发根农杆菌具体为发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)A4 ；
所述步骤1)和步骤幻中，所述培养的温度均为22°C _25°C，所述培养的光照强度均为10001ux-15001ux，所述培养的光照时间均为11小时/天_13小时/天，所述培养的时间均为30天-50天。
所述步骤1)和步骤幻中，所述培养的温度均为221、231或251，所述培养的光照强度均为10001uxU2001ux或15001ux，所述培养的光照时间均为11小时/天、12小时 /天或13小时/天，所述培养的时间均为30天、40天或50天。
步骤1)中，所述诱导培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、细胞分裂素、水4和1/2MS培养基(产品编号33123533216，济南市中天组培园艺用品供应中心)混合得到培养基，所述萘乙酸在所述诱导培养的培养基中的浓度为0. Olmg · L^1-O. 2mg · 所述细胞分裂素在所述诱导培养的培养基中的浓度为0. 5mg · L4-IOmg · Γ1 ；
步骤2)中，所述脱分化的培养基按照如下方法制备将6-苄氨基嘌呤、水和1/2MS 培养基混合，所述6-苄氨基嘌呤在所述脱分化的培养基中的浓度为0. 5mg · L4-IOmg · L—1。
步骤1)中，所述萘乙酸在所述诱导培养的培养基中的浓度具体为0. Olmg · Γ1、 0. Img · Γ1或0. 2mg · Γ1 ；所述细胞分裂素在所述诱导培养的培养基中的浓度具体为 0. 5mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1
步骤2)中，所述6-苄氨基嘌呤在所述脱分化的培养基中的浓度具体为 0. 5mg · L-1、lmg · L-1、2mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1。
在所述步骤1)前还包括如下步骤将所述黄花乌头发根进行预培养，得到预培养发根。
所述预培养的温度为22°C _25°C，所述预培养的光照强度为10001ux-15001ux，所述预培养的光照时间为11小时/天-13小时/天；所述预培养的时间为30天-60天；
所述预培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述预培养培养基中的浓度为0. 01 0. 2mg · L—1，所述萘乙酸在所述预培养培养基中的浓度具体为0. Olmg · L-1、。· Img · L-1或0. 2mg · L-1 ；
所述预培养的温度为22°C、23°C或25°C，所述预培养的光照强度为lOOOlux、 1200lux或1500lux，所述预培养的光照时间为11小时/天、12小时/天或13小时/天，所述预培养的时间为30天、40天或60天。
所述黄花乌头发根的长为2cm-2. 5cm ；所述黄花乌头发根的长具体为2cm、2. 3cm 或 2. 5cm。
本发明的另一个目的是提供一种用于培育黄花乌头苗的培养基。
本发明提供的培养基，由上述方法中的所述脱分化的培养基、所述诱导培养的培养基和所述脱分化的培养基组成。
本发明的实验证明，本发明利用黄花乌头的发根进行成苗，其成苗率高，且所获得的黄花乌头再生苗在普通的组织培养基中即能进行生长繁殖，繁殖速度快，生产周期短 (约30天左右)，不受自然条件的影响，可以实现工业集约化生产，克服了人工种植黄花乌头时所具有的繁殖速度慢、育种周期长、抗性低、遗传稳定性差等缺陷；此再生苗具有广阔的应用前景和利用价值。
图1为黄花乌头再生苗具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、黄花乌头再生苗的培育
以黄花乌头发根为外植体，在脱分化培养基上，再经芽丛诱导及继代培养，几个月培养后即可获得再生苗无性系。
一、黄花乌头发根的获得
将发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) A4 (Ri质粒的快速提取及rolC基因的克隆，李昌禹，马海琴，赵寿经，臧埔[J]吉林农业大学学报2003，25 C3) :263 沈5， 公众可从李昌禹，王英平，卢淑波，张庆田，孔祥义，徐佳萍，艾军获得，利用上述文献的方法，对发根农杆菌及目的物的PCR检测利用rolC引物，对从农杆菌Ri质粒及黄花乌头再生苗叶片提取的DNA分别进行PCR扩增，获得了同样大小的DNA序列；此菌株内含有Ri 质粒，Ri质粒上含有目的基因rolC，其核苷酸序列为序列1。)转入黄花乌头(Aconitum Coreanum (Levi.) Rapaics)(科技成果黄花乌头无公害规范化生产示范基地建设，中国农业科学院特产研究所，2004-01 2006-12公众可从李昌禹，王英平，卢淑波，张庆田，孔祥义，徐佳萍，艾军获得)叶片，与发根农杆菌A4工程菌液共培养10分钟，具体为将发根农杆菌A4在进行YEB液体培养16小时，再转到新鲜培养液内继续培养3小时后，此培养液即可作为工程菌使用，将黄花乌头叶片切成0. 5cm 1. OcmX 1. 0cm，浸入到农杆菌工程液， 共培养(室温25°C ) 10分钟后，得到黄花乌头发根。
提取黄花乌头发根的基因组DNA，用引物序列5 ‘ CGAAGCTTCTATATTCGCACAACG3 ‘ (5'-上游区 12276) ;5' GCGAATTCGCGATGAAATCAAGTATCC3‘ (3'-下游区 13134)进行扩 ±曾，得到PCR产物，经过测序，其核苷酸序列为序列表中的序列1，说明该发根内含有rolC基因，证明其为所需要获得的黄花乌头发根。
二、黄花乌头再生苗培育
方法1
1)预培养
将上述步骤1获得的黄花乌头发根分别切成2cm长根段，1 2段/发根(共72 段发根)，转移到预培养的培养基上，于22°C、光照强度为lOOOlux，光照时间为12小时/ 天，培养30d (每瓶10段)，得到预培养发根；
所述预培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述预培养培养基中的浓度为0. Olmg · Γ1 ；
2)诱导培养将步骤1)得到的预培养发根接种于诱导培养培养基上，于22°C、光照强度为lOOOlux，光照时间为12小时/天，培养30d直到长出愈伤组织；
所述诱导培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、细胞分裂素、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述诱导培养的培养基中的浓度为0. Img · L—1，所述细胞分裂素在所述诱导培养的培养基中的浓度具体为0. 5mg · L—1。
3)脱分化培养将步骤2、得到的愈伤组织转入脱分化的固体培养基上，于22°C、 光照强度为lOOOlux，光照时间为12小时/天，培养30天，得到18株黄花乌头苗(图1所示)，成苗率为25%。
所述脱分化的培养基按照如下方法制备将6-苄氨基嘌呤、水和1/2MS培养基混合，所述6-苄氨基嘌呤在所述脱分化的培养基中的浓度为0. 5mg · L—1。
方法2
1)预培养与方法1基本相同，不同的是将黄花乌头发根分别切成2. 3cm长根段 (1000段)，于23°C、光照强度为12001UX，光照时间为11小时/天，培养40d ；6
所述预培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述预培养培养基中的浓度为0. Img · Γ1 ；
2)诱导培养
与方法1基本相同，不同的是于23°C、光照强度为12001UX，光照时间为11小时/ 天，培养40d；
所述诱导培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、细胞分裂素、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述诱导培养的培养基中的浓度为0. Olmg · L—1，所述细胞分裂素在所述诱导培养的培养基中的浓度具体为5mg · L—1 ；
3)脱分化培养
与方法1基本相同，不同的是于23°C、光照强度为12001UX，光照时间为11小时/ 天，培养40d；
所述脱分化培养的培养基按照如下方法制备将6-苄氨基嘌呤、水和1/2MS培养基混合，所述6-苄氨基嘌呤在所述脱分化的培养基中的浓度为5mg · L—1。
得到23株黄花乌头苗，成苗率为2.3%。
方法3
1)预培养与方法1基本相同，不同的是将黄花乌头发根分别切成2. 5cm长根段 (2000段)，于25°C、光照强度为15001UX，光照时间为13小时/天，培养60d ；
所述预培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述预培养培养基中的浓度为0. 2mg · Γ1 ；
2)诱导培养
与方法1基本相同，不同的是于25°C、光照强度为15001UX，光照时间为13小时/ 天，培养50d；
所述诱导培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、细胞分裂素、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述诱导培养的培养基中的浓度为0. 2mg · L—1，所述细胞分裂素在所述诱导培养的培养基中的浓度具体为IOmg · L—1 ；
3)脱分化培养
与方法1基本相同，不同的是于25°C、光照强度为15001UX，光照时间为13小时/ 天，培养50d；
所述脱分化培养的培养基按照如下方法制备将6-苄氨基嘌呤、水和1/2MS培养基混合，所述6-苄氨基嘌呤在所述脱分化的培养基中的浓度为IOmg · Γ1。
得到48株黄花乌头苗，成苗率为2.4%。
三、黄花乌头苗的扩大、快繁培养
分别将上述步骤二的方法一得到的黄花乌头苗置于1/2MS固体培养基上，进行培养(于25°C、光照强度为15001UX，光照时间为11小时/天，培养60d)，每30d转继代1次， 繁殖系数均为5 (黄花乌头的繁殖系数为5 7为好)。
将上述步骤二的方法一得到的18株黄花乌头苗在培养瓶内(1/2MS固体培养基) 生根培养(于25°C、光照强度为15001UX，光照时间为11小时/天，培养30d)，平均生根率为90%，得到组培苗。
于25°C、自然光下，组织苗培养育苗钵里，置于小温棚内，湿度保持在95%以上，栽培基质为根层为河沙1cm，沙以下为田园土，培养20d后，逐渐撤去温棚，转入正常培养管理，移栽成活率为80%，此苗自然休眠后那为成品苗，得苗率为70%。于次年带土坨定植到田间即可。
观察成品苗木，其平均株高为0. 5m,已达到2 3年生状态，将其继续栽培次年可开花，且开花率为70%，地下部即可分生多数小子根(小子根数量平均为6，大小平均为 Icm) ο
采用同样的方法检测方法二和三获得的黄花乌头苗，结果与方法一无显著差异。
而现有的黄花乌头的繁殖都是采用种子繁殖，种子繁殖的育种率低，种子萌发率在20%，第一年只长出子叶，第二年才能长出真叶，因此繁殖速度慢。
权利要求
1.一种培育黄花乌头苗的方法，包括如下步骤1)将黄花乌头发根进行诱导培养，得到愈伤组织；2)将步骤1)得到的愈伤组织进行脱分化培养，得到黄花乌头苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述黄花乌头发根按照如下方法制备将含有目的外源基因的重组发根农杆菌导入黄花乌头叶片中，得到黄花乌头发根；所述含有目的外源基因的重组发根农杆菌具体为发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)A4 ；所述步骤1)和步骤幻中，所述培养的温度均为22°c -25°C，所述培养的光照强度均为 10001ux-15001ux，所述培养的光照时间均为11小时/天-13小时/天，所述培养的时间均为30天-50天。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤1)和步骤幻中，所述培养的温度均为22°C、23°C或25°C，所述培养的光照强度均为10001ux、12001ux或15001UX，所述培养的光照时间均为11小时/天、12小时/天或13小时/天，所述培养的时间均为30、40或50天。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述诱导培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、细胞分裂素、 水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述诱导培养的培养基中的浓度为0. Olmg ^r1-O. ang·!/1，所述细胞分裂素在所述诱导培养的培养基中的浓度为 0. 5mg · IZ1-IOmg · L-1 ；步骤中，所述脱分化的培养基按照如下方法制备将6-苄氨基嘌呤、水和1/2MS培养基混合，所述6-苄氨基嘌呤在所述脱分化的培养基中的浓度为0. 5mg · L4-IOmg · L—1。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述萘乙酸在所述诱导培养的培养基中的浓度具体为0. Olmg ·Ι^、 0. Img · L—1或0. 2mg · L—1，所述细胞分裂素在所述诱导培养的培养基中的浓度具体为 0. 5mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1 ；步骤2)中，所述6-苄氨基嘌呤在所述脱分化的培养基中的浓度具体为0. 5mg · L—1、 Img · L-1、2mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于在所述步骤1)前还包括如下步骤将所述黄花乌头发根进行预培养，得到预培养发根。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述预培养的温度为22°C _25°C，所述预培养的光照强度为10001UX-15001UX，所述预培养的光照时间为11小时/天-13小时/天；所述预培养的时间为30天-60天；所述预培养的培养基按照如下方法制备将萘乙酸、水和1/2MS培养基混合得到培养基，所述萘乙酸在所述预培养培养基中的浓度为0. Olmg · L^1-O. 2mg · L—1，所述萘乙酸在所述预培养培养基中的浓度具体为0. Olmg · L-1、。· Img · L-1或0. 2mg · L-1。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述预培养的温度为22°C、23°C或25°C，所述预培养的光照强度为lOOOlux、12001ux 或15001ux，所述预培养的光照时间为11小时/天、12小时/天或13小时/天，所述预培养的时间为30天、40天或60天。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述黄花乌头发根的长为2cm-2. 5cm ；所述黄花乌头发根的长具体为2cm、2. 3cm或 2. 5cm0
10.一种用于培育黄花乌头苗的培养基，由权利要求1-9所述方法中的所述脱分化的培养基、所述诱导培养的培养基和所述脱分化的培养基组成。
全文摘要
本发明公开了一种黄花乌头苗及其获得方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)将黄花乌头发根进行诱导培养，得到愈伤组织；2)将步骤1)得到的愈伤组织进行脱分化培养，得到黄花乌头苗。本发明的实验证明，本发明利用黄花乌头的发根进行成苗，其成苗率高，且所获得的黄花乌头再生苗在普通的组织培养基中即能进行生长繁殖，繁殖速度快，生产周期短(约30天左右)，不受自然条件的影响，可以实现工业集约化生产，克服了人工种植黄花乌头时所具有的繁殖速度慢、育种周期长、抗性低、遗传稳定性差等缺陷；此再生苗具有广阔的应用前景和利用价值。
文档编号A01H4/00GK102499078SQ20111031720
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者卢淑波, 孔祥义, 张庆田, 徐佳萍, 李昌禹, 王英平, 艾军 申请人:卢淑波, 孔祥义, 张庆田, 徐佳萍, 李昌禹, 王英平, 艾军