一种重组酶基因、双元表达载体及其构建方法和应用的制作方法

专利名称：一种重组酶基因、双元表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组酶基因、双元表达载体及其构建方法和应用，尤其涉及一种重组酶ntCre基因和低温诱导删除选择标记基因的植物基因双元表达载体和相关的构建方法及其在转化烟草中的应用。
背景技术：
在植物转基因过程中，为了将转基因细胞和非转基因细胞分开，常常会引入一个选择标记基因，而选择标记基因编码的蛋白可以使植物细胞拥有抵抗抗生素的能力，从而使得转基因细胞在有抗生素的环境中存活下来。由于选择标记基因已经整合到了植物的基因组中，抗性基因可能会在新的生态环境中发生水平转移(基因漂移)和垂直遗传，其潜在的危害性并没有完全探知。同时，转基因植株一旦获得，选择标记基因就没有继续存在的必要。因此，可以或应该用适当的生物技术手段将它们予以淘汰除去。无抗性标记基因的转基因植物不仅可促进转基因技术的发展，而且可排除由之带来的潜在的生物安全问题。根据重组酶基因引入方式，利用位点特异重组介导的标记基因删除技术获得上述无选择标记基因的转基因植株有以下两种方法
第一，间接引入重组酶法，即通过有性杂交或二次转化的方式将重组酶基因引入已获得的转基因植物基因组中，使该转基因植株中位于两个同向重组酶识别位点之间的选择标记基因被删除。有性杂交引入法就是用含有重组酶基因和含有目标基因以及相同或相异选择标记基因的农杆菌，分别转化同一种植物材料，得到转基因植株父本和母本材料，然后通过杂交，将父本中的重组酶基因引入母本，删除母本材料中两个同向重组酶识别位点之间的选择标记基因，然后通过自交分离，除去源自父本的重组酶基因和选择标记基因，最终得到只含有目标基因的转基因植株。二次转化法是先用含有目标基因和选择标记基因(位于两个重组酶识别位点之间)的农杆菌转化植物，得到转基因植株后，再用含有重组酶基因和另一种标记基因的农杆菌进行二次转化，删除第一次转化得到的转基因植株中的选择标记基因，二次转化得到的转基因植株再通过自交分离，除去源自二次转化的重组酶基因和选择标记基因，得到只含目标基因的转基因植株(Dale Ε, Ow D W. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 1991, 88: 10558-10562. )。 1 ] 弓| 入重组酶法所得到的转基因植株都要通过进一步的自交分离才能得到无选择标记基因的转基因植株，选育过程耗时长，程序繁琐，同时只能局限于有性杂交的植物中，这使得其实用性大大降低。尽管如此，间接引入重组酶法在转基因植物研究中还是占有重要的地位。第二，直接引入重组酶法是在两个重组酶识别位点之间引入选择标记基因的同时引入重组酶基因。在构建表达载体(expression vector)时，选择标记基因放在两个同向的重组酶识别位点之间，而目标基因放在它们之外，这样在植物细胞中有重组酶基因表达时，两个同向的重组酶识别位点之间的选择标记基因被删除而识别位点之外的目的基因被保留下来。重组酶基因一般被一个可诱导型的启动子所控制。在转化早期，标记基因赋予
5转基因细胞抗抗生素或除草剂的能力，使其在有选择压力的环境中增殖分化，得到有抗性的转基因植株后，通过一定的条件诱导，使重组酶基因开始表达，在重组酶的作用下，植物体内开始发生位点特异重组反应，从而将选择标记基因删除。现有技术在将选择标记基因和重组酶基因同时引入一个植物双元表达载体的直接引入重组酶法中，控制重组酶基因表达的启动子通常采用热激启动子。Wang等(Wang Y, Chen B, Hu Y, et al. Inducible excision of select able marker gene from transgenic plants by the cre/loxP site-specifie recombination system [J]. Transgenic Res, 2005, 14( :605-614.)构建了用热激蛋白控制重组酶Cre基因表达的载体，导入到农杆菌后转基因烟草、拟南芥、马铃薯等植物，通过高温诱导后，重组酶Cre 表达，成功地删除了两个同向IoxP位点之间的标记基因，得到无标记基因的转基因植物。 本发明人在应用上述热激启动子进行热激删除标记基因研究中发现(1)采用HSP18. 2和 HSP70m等热激启动子的Cre/LxoP重组系统，在拟南芥和烟草中删除选择标记基因的效果可以，但需要近1个月的处理时间，而在番茄中活性低，需要更长的热激删除处理。(2)组织培养室内的温度环境控制要求较严，要防止高温季节内停电，导致培养室内温度达到热激启动子的启动温度而使整合进植物基因组的Cre/LxoP重组系统被激活，从而影响抗性转基因植株的获得。(3)在用30 37°C的热激温度删除抗性或可视性转基因植株的选择标记基因时，培养基容易被蒸发而改变营养成分，对黄瓜和番茄等植物的生长与分化不利。

发明内容
本发明的第一目的在于提供一种重组酶。本发明的第二目的在于提供一种上述重组酶的构建方法。本发明的第三个目的在于提供一种用于低温诱导删除选择标记基因的植物双元表达载体。本发明的第四个目的在于提供一种上述植物双元表达载体的构建方法。本发明的第五个目的在于提供植物双元表达载体在转基因烟草中的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的
一种重组酶，其特征在于它为ntcre基因，其核苷酸序列如SEQ ID. NO. 1所示。由1274个核苷酸组成的带有核定位(nuclear targeted，简写为nt)信号编码序列和内含子的经过改良的重组酶ntCre基因的序列，该基因能在4°C 10°C低温条件下被拟南芥低温诱导基因RD^A的启动子所启动。其中，第四至第52位核苷酸序列为编码核定位信号的序列。第4位至第48位和第605位至第794位核苷酸序列分别为内含子的序列。 第1位至第3位核苷酸序列为ntCre的翻译起始密码子。第1272位至第1274位核苷酸序列为ntCre的翻译终止密码子。由该基因转录成的mRNA序列为SEQ ID. NO. 2 ； 由该基因转译的氨基酸序列为SEQ ID. NO. 3 ；
上述重组酶的制备方法，其特征在于
用序列为SEQ ID. N0. 4的引物和序列为SEQ ID. N0. 5的引物、Prin^tar HS DNA聚合酶 (TaKaRa,日本)从大肠杆菌菌株BM25. 8 (Clontech,美国)基因组DNA中PCR扩增出1040bp大小的源自Pl噬菌体的Cre基因(GenBank accession X03453)，反应条件为95°C预变性 2 min，95°C变性 10 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，3 个循环，95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，27 个循环，最后 72°C延伸 10 min。 用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMD18_T (TaKaRa,日本)，转化大肠杆菌 XLl-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物序列为SEQ ID. NO. 6和序列为 SEQ ID. NO. 7，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec, 72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期898 bp大小的产物， 测序结果显示所克隆的基因同GenBank中公布的序列，得到阳性克隆载体pVCT1251和重组酶Cre基因。用)(ba I和Nco I酶切载体pVCT1251，回收3727 bp片段，弃11 bp片段。将合成的序列SEQ ID. NO. 8和合成的序列SEQ ID. NO. 9于94°C变性3分钟后退火，构成含有拟南芥At4g01735基因内含子和猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信号的编码序列的)(ba I-Nco I接头。将回收片段与接头用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID. NO. 10和SEQ ID. Ν0· 11，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，55°C退火 20 sec，72°C延伸 30 sec，;35 个循环， 最后72°C延伸10 min，电泳检测得到四3 bp预期大小产物。经测序验证，得到阳性克隆载体pVCT1252，使重组酶Cre基因上游带上第一内含子和具有核定位信号编码的序列。用Xba I和Me I酶切载体pVCT2027 (由发明人所在实验室提供)，回收3106 bp 片段，弃1889 bp片段。用)(ba I和Me I酶切载体pVCT1252，回收1096 bp片段，弃17 bp 和沈69 bp片段。将两个片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞， 得Amp抗性重组子，用分别位于热激启动子HSP70m上游的LacZ上和位于Cre基因下游的引物SEQ ID. N0. 5进行PCR扩增筛选，得1315 bp预期大小产物，再经酶切和测序鉴定，得到阳性克隆载体PVCT2136。用EcoRV酶切载体pVCT2136，电泳回收4196 bp片段。采用PCR方法，用引物5，-gtaaatttctagtttttctccttc-3，(位于内含子上游)和引物 5‘-ctgtaactatcatcatcatcatag-3‘(位于内含子下游)、PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa, 日本)从PCAMBIA1301载体DNA中扩增出190 bp大小的内含子序列，并电泳回收。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用分别位于Cre基因两端的引物SEQ N0. 4和SEQ ID. NO. 5 (位于ntCre基因下游)进行PCR扩增鉴定和测序验证，得到阳性克隆载体pVCT2117和预期的ntCre基因。一种植物双元表达载体，其特征在于所述植物双元表达载体的T-DNA结构包括 RD29A: ntCre: :Tnos基因和LoxP序列。其中RD29A为重组酶ntCre的低温诱导特异性启动子，LoxP为重组酶ntCre的识别、切割和重组的序列。本发明所述的植物双元表达载体PVCT2221的T-DNA结构的主要构建元件包括LB (T-DNA左边界)、T3k (CaMV 35S基因的终止子)、LoxP (重组酶ntCre的识别、切割和重组的序列)、nptnm (改造的带有原核启动子和原核终止子的新霉素磷酸转移酶基因II，即卡那霉素抗性基因，具有原核表达特性)、Pnos (胭脂碱合成酶基因的启动子)、TnoS (胭脂碱合成酶基因的终止子)、ntCre(带有核定位信号编码序列和内含子的改良型重组酶Cre基因)、 RD^A(拟南芥低温诱导基因RD^A的启动子)、35S(CaMV 35S基因的启动子)、mGFP(改良型的绿色荧光蛋白基因)、RB (T-DNA右边界)。本发明所述的植物双元表达载体PVCT22M的T-DNA结构的主要构建元件包括LB (T-DNA左边界)、T3k (CaMV 35S基因的终止子)、LoxP (重组酶ntCre的识别、切割和重组的序列)、nptnm (改造的带有原核启动子和原核终止子的新霉素磷酸转移酶基因II，即卡那霉素抗性基因，具有原核表达特性)、Pnos (胭脂碱合成酶基因的启动子)、Tnos (胭脂碱合成酶基因的终止子)、ntCre (带有核定位信号编码序列和内含子的改良型重组酶Cre基因)、R^9A(拟南芥低温诱导基因RD29A的启动子)、35S (CaMV 35S基因的启动子)、ipt (异戊烯基转移酶基因，ipt基因的表达受CaMV 35S基因的启动子35S的控制)、Tipt (异戊烯基转移酶基因的终止子)、RB (T-DNA右边界)。本发明所提供的上述两种具体的植物双元表达载体PVCT2221和pVCT22M的 T-DNA共同结构是在2个同向LoxP识别位点之间，含有Pnos: :nptnm和RD^A: ntCre基因。不同结构是两者分别带有35S::mGFP和35S::ipt基因。植物双元表达载体pVCT2221 和pVCT22M均由商业化载体pCAMBIA1302 (GenBank登陆号为AF2!3^98)演化而来，具有共同的T-DNA外侧序列，即含有原核Kan抗性基因nptIII (新霉素磷酸转移酶基因III)、大肠杆菌复制子ColEl、根癌农杆菌Ti质粒pVSl的农杆菌复制子REP和根癌农杆菌Ti质粒 PVSl的STA区。这些序列是确保双元载体能在大肠杆菌和农杆菌中均能复制，并赋予宿主菌以Kan抗性。具体地说，本发明植物双元表达载体如图Ia或图Ib所示。本发明所提供的植物双元表达载体的构建方法，其特征在于
通过一系列载体的阳性克隆，包括:pVCT1251, pVCT1252, pVCT2006, pVCT2027, PVCT2136, pVCT2117, pCR2. l_AtCBF3，pCR2. lm, pVCT1191, pVCT1202,pVCT2072,pVCT2102, PVCT2231, pVCT1009, pVCT2236, pVCT2020, pVCT2118, pVCT2237, pVCT1243, pVCT2130, PVCT2238，最终构建植物双元表达载体pVCT2221和pVCT22M。(图2) 本发明所述载体PVCT2006的构建步骤如下
用 EcoR I 和 Hind III 酶切载体 pUC18 (Sangon,上海；GenBank accession L08752)，电泳回收沈35 bp, 弃51 bp片段。用相同的酶消化载体pBI121 (GenBank accession AF485783)，回收3032 bp, 弃117 bp片段。将两个回收片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用CaMV 35S启动子上的引物5，-cttgtcgacgtccccagattagccttttc-3，和位于GUS基因中的引物5，-gatagtctgccagttcagttcgt-3，进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，55°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min，电泳检测得到1315 bp预期大小产物，表明35S::⑶5::1^08基因已重组进？肌18载体中，再经EcoR I和Xba I酶切鉴定，得到预期2167 bp和3500 bp大小的产物，得到阳性克隆载体PVCT2006。本发明所述载体pVCT2027的构建步骤如下
用)(ba I和I3St I酶切载体pVCT2006，电泳回收4810 bp,弃870 bp片段。人工合成 HSP70m热激启动子，序列为SEQ ID. NO. 12，用)(ba I和I3St I酶切，回收180 bp,弃7 bp 和8 bp片段。将两个回收片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞， 得Amp抗性重组子，用引物5，-gatttatatcccggtcggtgaatc-3，(位于HSP70m启动子的上游)和 5’ - gatagtctgccagttcagttcgt-3‘(位于 GUS 基因中)进行 PCR 扩增，得 63I bp 预期大小产物，表明得到HSP70m:⑶S: :Tnos基因结构，测序结果显示HSP70m与⑶S基因之间的精确序列，得到阳性克隆载体PVCT2027。本发明所述载体pVCT2136的构建步骤如下
用)(ba I和Mc I酶切载体pVCT2027 (由发明人所在实验室提供)，回收3106 bp片段，弃1889 bp片段。用Xba I和&ic I酶切载体pVCT1252，回收1096 bp片段，弃17 bp 和沈69 bp片段。将两个片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞， 得Amp抗性重组子，用分别位于热激启动子HSP70m上游的LacZ上和位于Cre基因下游的引物SEQ ID. NO. 5进行PCR扩增筛选，得1315 bp预期大小产物，再经酶切和测序鉴定，得到阳性克隆载体PVCT2136。本发明所述载体pVCT2117的构建步骤如下
用EcoRV酶切载体pVCT2136，电泳回收4196 bp片段。采用PCR方法，用引物5，-gtaaatttctagtttttctccttc-3，(位于内含子上游)和引物 5‘-ctgtaactatcatcatcatcatag-3‘(位于内含子下游)、PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa, 日本)从PCAMBIA1301载体DNA中扩增出190 bp大小的内含子序列，并电泳回收。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用分别位于Cre基因两端的引物SEQ NO. 4和SEQ ID. NO. 5 (位于ntCre基因下游)进行PCR扩增鉴定和测序验证，得到阳性克隆载体PVCT2117和预期的ntCre基因。本发明所述载体pCR2. l-AtCBF3的构建步骤如下
采用 PCR 方法，用引物 5，-ccataccaacaaaaaagacagag-3，(位于 AtCBF3 上游)和 5，-g tactaaaaatggaaataataatctgag-3，(位于 AtCBF3 下游)、PrimStar HS DNA 聚合酶(TaKaRa, 日本)从拟南芥生态型 Columbia Urabidopsis thaliana L. Ecotype Columbia)基因组 DNA 中扩增出 755 bp 大小的基因 AtCBF3 (GenBank accession No. AB013815), PCR 反应条件为95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，51°C退火20 sec，72°C延伸1 min，30个循环。 72°C延伸10 min。回收产物经用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pCR2. 1-T0P0 (Invitrogen, US),转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp和Kan抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID. NO. 6和SEQ ID. NO. 7，PCR反应条件为94°C预变性3 min,94°C 变性20 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期898 bp大小的产物，测序结果显示得到了预期的序列，得到阳性克隆载体 pCR2. l-AtCBF3。本发明所述载体pCR2. Im的构建步骤如下
用EcoR I酶切载体pCR2. l-AtCBF3,电泳回收3890 bp片段，弃773 bp片段。将回收片段纯化后用jM DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp和Kan抗性重组子，经PCR扩增筛选，引物为5，_gtggatccttctagtgtagccgtag -3，(位于ColEl上游) 和 5，_gtaacgccagggttttccca _3，(位于 LacZ 下游)，PCR 反应条件为:94°C预变性 3 min, 94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min，电泳检测得到预期1048 bp大小的产物，再经EcoR I酶切，显示为单位点，表明得到阳性克隆载体 pCR2. lm。本发明所述载体pVCT1191的构建步骤如下
9采用PCR方法，用引物5’ -tcatgaccaaaatccct-3，(位于pCR2. Im载体的原核基因终止子上游)和引物5，-ttcagaagaactcgtcaagaagg -3，(位于pCR2. Im载体的Kan抗性基因 CDS的下游)、PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从pCR2. Im载体DNA中扩增出2919 bp大小的Kan原核抗性基因(nptll，新霉素磷酸转移酶基因)、fl复制子、LacZ基因、大肠杆菌复制子ColEl和原核抗性基因终止子等序列，并除去Amp编码区，PCR反应条件95°C 预变性2 min，95°C变性10 sec，50°C退火20 sec，72°C延伸3 min，30个循环。72°C延伸 10 min0将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得到Kan抗性重组子，表明重组的nptll基因(命名为nptnm，即nptll modified)具有预期Kan抗性功能。经PCR扩增筛选，引物为5，-atactcgagctactgggctatctgg _3，(位于 nptll 原核启动子上游)和 5，-tttctcgagttggtagctcttgatcc _3，(位于 nptll 原核终止子下游)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，3 个循环，94°C变性 20 sec，59°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，32 个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1240 bp大小的产物，证实nptll编码区与原核终止子之间的Amp基因编码区被清除，再经EcoRI酶切，显示为单位点，表明得到阳性克隆载体PVCT1191。该载体使pCR2. Im载体的Amp抗性基因得到删除，并使nptll基因末端带上原核基因终止子，构成nptnm基因，该基因能赋予大肠杆菌Kan抗性。本发明所述载体pVCT1202的构建步骤如下
采用PCR方法，用引物5’ -atactcgagctactgggctatctgg-3，(位于nptI加基因的启动子上游，划线处为 Xho I 位点)与弓I物 5，_cattatacgaagttatcctgcaggcggccgcccagggccc^gg^ RctctUatcc収c-3’ (划线部分与nptllm基因的原核终止子末端ιΗ链序列互补)从PVCT1191 载体DNA中扩增出1265 bp大小的新霉素磷酸转移酶基因nptnm。PCR反应条件为95°C 预变性2 min，95°C变性10 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸1 min 20 sec，3个循环，再经 95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 20 sec，27 个循环，最后 72°C延伸 10 min。用纯化的PCR产物再次进行PCR扩增，引物对为5，-atactcgagctactgggctatctgg-3， (位于nptllm基因的启动子上游，划线处为Xho I位点)禾口 5，_ataacttcgtatagcatacattata cgaagttatcc-3，(划线部分为LoxP位点)，反应条件为95°C预变性2 min，95°C变性10 sec, 46°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 20 sec，3 个循环，再经 95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸1 min 20 sec，27个循环，最后72°C延伸10 min。电泳回收1283 bp片段， 用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMDIS-T中，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp和Kan抗性重组子，表明所克隆的nptnm在大肠杆菌中具有Kan抗性功能。 经PCR扩增筛选，引物为5，-atactcgagctactgggctatctgg -3，(位于nptll原核启动子上游，划线部分为Xho I位点)和5，-gtaacgccagggttttccca _3，(位于LacZ下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec, 35个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1363 bp大小的产物，证实nptnm已得到克隆，且表达方向与IacZ的一致。用Hind III和Xho I酶切，得到预期1302 bp和 2675 bp产物，用Ml I和&ic I，得到预期1314 bp和沈64 bp产物，并证实了插入的方向。测序结果显示得到SEQ ID. NO. 13引物序列和nptnm基因的序列，以及T载体上的多克隆位点，均与预期的序列完全一致，得到阳性克隆载体PVCT1202。本发明所述载体pVCT2072的构建步骤如下用 Xho I 酶切载体 pCAMBIA1302 (GenBank accession No. AF234298)，电泳回收 9455 bp片段，弃1094 bp片段。用Xho I和Ml I酶切载体pVCT1202，回收1284 bp片段(带有nptll-LoxP)，弃沈93 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Kan抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为5’ -atactcg agctactgggctatctgg-3'(位于nptlLii基因的原核启动子上游，划线处为Bio I位点)和 5，-catgagcgaaaccctataggaacc -3，(位于 T35s 真核终止子中)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 20 sec，；35 个循环，最后 72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1362 bp大小的产物，表明带有原核启动子和终止子的 nptnm基因按预期方向插进pCAMBIA1302的Bio I位点。Bio I酶切鉴定，显示为预期的单位点，得到阳性克隆载体PVCT2072。pVCT2072经农杆菌介导转化烟草，得到了具有卡那霉素抗性的植株，结果显示&35S: :nptllm: :T35s基因表达正常，能赋予转基因烟草细胞卡那霉素抗性。本发明所述载体pVCT2102的构建步骤如下
用PmaC I和XbaI酶切载体pVCT2072，电泳回收8475 bp片段，弃413 bp和11 bp 片段。用Not I酶切回收片段，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用EcoRI 酶切，回收2732 bp片段，弃1249 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接， 转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp和Kan抗性重组子，PCR扩增筛选的引物5’ -tcgacgatccagatccggtgca-3‘ ( Pnos inZ^J^T" !)禾口 5，_ acggggagtcaggcaactat-3‘ (位于Amp基因中)，PCR反应条件为:94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，55°C退火20 sec, 72°C延伸1 min 20 sec，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1610 bp大小的产物，表明含有Pnos和Amp基因部分序列，且为预期的结构。酶切鉴定结果显示，Sal I和EcoR I能切出2653 bp和8504 bp预期大小的产物，得到阳性克隆载体pVCT2102。本发明所述载体pVCT2231的构建步骤如下
用EcoR I和Sal I酶切载体pVCT2072，电泳回收8504 bp片段，弃54 bp和2563 bp片段。用相同的酶切载体PVCT2117，回收1732 bp片段，弃沈53 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子。PCR扩增筛选，引物为5，- atcgcaagaccggcaacagg-3’ (位于Tnos终止子中)和 5，-gagctctaatcgccatcttccagca-3，(位于 ntCre 基因下游)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec，；35个循环，最后 72°C 延伸10 min,电泳检测得到预期1610 bp大小的产物，表明ntCre基因插入进pVCT2102中。 酶切鉴定结果显示，SalI和EcoRI能切出1731 bp和8504 bp, NcoI能切出2613 bp和 7570 bp的目的带，表明结构正确。测序结果显示了 Pnos启动子上游与Tnos终止子下游之间以及Tnos上游与ntCre基因下游的精确连接，得到阳性克隆载体pVCT2231。本发明所述载体pVCT1009的构建步骤如下
用引物5，-ctgcaagaatctcaaacacgg-3，(位于RD29A低温诱导启动子上游)和引物 5，-tccaatagaagtaatcaaaccct-3，(位于 RD29A 低温诱导启动子下游)、PfuDNA 聚合酶 (Sangon,上海)从拟南芥生态型 Columbia Clra^iiZop1Si1S thaliana L. Ecotype Columbia) 基因组DNA中PCR扩增出891 bp大小的AtRD^Am温诱导启动子(GenBank accession No. 013044)，用1~叫DNA聚合酶加“A，，尾后，TA克隆进T载体pUCm-T (Sangon，上海)，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选和测序验证，得到阳性克隆载体 PVCT1009。本发明所述载体pVCT2236的构建步骤如下
用I^st I和)(ba I酶切载体pVCT2117，电泳回收4196 bp片段，弃188 bp片段。用相同酶切载体PVCT1009，回收927 bp片段，弃16 bp和2721 bp片段。将回收片段纯化后用 T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5，-ctgcaagaatctcaaacacgg_3，(位于RD29A低温诱导启动子上游)和5，_aacc ttcaaaatcaatccaagtatggacc-3，(位于Cre基因的第一内含子上)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，M°C退火20 86(；，721延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸 10 min,电泳检测得到预期957 bp大小的产物，表明重组子中同时含有R^9A: :Cre序列， 且按预期的结构排列。酶切鉴定结果显示，Hind III和Xba I酶切得943 bp和4188 bp大小的预期产物，得到阳性克隆载体PVCT2236。本发明所述载体pVCT2020的构建步骤如下
用 Pnos 上游引物 5，-cggaattcagggagtcacgttatgac-3‘(划线处为 EcoR I 位点)和 nptll 下游引物 5，-cgctcgagtcccgctcagaagaac-3，(划线处为 Β ο I 位点)、PfuDNA 聚合酶 (Sangon，上海)从载体 pBIN19(GenBank accession U09365)中 PCR 扩增出 1116 bp 大小的 Pnos: :nptll基因片段，EcoR I和Xho I酶切后，回收1107 bp片段，弃3 bp和7 bp片段。 用相同的酶消化载体 pCAMBIA1302(GenBank accession AF234298)，回收 8425 bp 片段，弃 1030 bp和1094 bp片段。将两个回收片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue 感受态细胞，得Kan抗性重组子，用I^nos上游引物5，-cgg^M￡agggagtcacgttatgac-3，和位于 CaMV 35S 终止子 pA 上的引物 5，- catgagcgaaaccctataggaacc-3，进行 PCR 扩增， 得1184 bp预期大小产物，表明I^nos: :nptll末端已连接上终止子pA。EcoR I和Xho I酶切鉴定显示，得到预期1107 bp和8425 bp大小的产物，而且Mc I和BstE II均为单位点，得到9532 bp大小的阳性克隆载体PVCT2020。本发明所述载体pVCT2118的构建步骤如下
用EcoR I和+ Hind III酶切载体pVCT2020，电泳回收9481 bp片段，弃51 bp片段。用相同的酶切载体PVCT2136，回收1559 bp片段，弃沈35 bp片段。将回收片段纯化后用jM DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子， PCR扩增筛选的引物为5’ - tcgacgatccagatccggtgca-3’(位于Pnos启动子下游)和 5，-accatggccaatttactgaccgtacacc -3，.(位于 Cre 基因上游)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，55°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 50 sec，；35 个循环，最后 72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1609 bp大小的产物，表明重组子中同时含有Pnos启动子和Cre基因序列，且按预期的结构排列。酶切鉴定结果显示，BstE II和BamH I酶切得到2135 bp和8905 bp大小的预期产物，得到阳性克隆载体pVCT2118。该载体可用于杂交后热激删除受体转基因植物中的选择标记基因。本发明所述载体pVCT2237的构建步骤如下
用Hind III和&ic I酶切载体pVCT2118，电泳回收9756 bp片段，弃1284 bp片段。 用相同的酶切载体PVCT2236，回收22 bp片段，弃四02 bp片段。将回收片段纯化后用 T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，PCR扩增筛选的弓I物为 5，- tcgacgatccagatccggtgca-3，(位于 Pnos 启动子下游)禾口 5，-accatggcca atttactgaccgtacacc-3，.(位于 Cre 基因上游)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C 变性 20 sec，55°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 50 sec，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min, 电泳检测得到预期1799 bp大小的产物，表明重组子中同时含有Pnos启动子和Cre基因序列，且按预期的结构排列。酶切鉴定结果显示，EcoR I和Hind III酶切得到M96 bp和 9481 bp大小的预期产物，得到阳性克隆载体pVCT2237。该载体可用于杂交后低温诱导删除受体转基因植物中的选择标记基因。本发明所述载体pVCT1243的构建步骤如下
采用PCR方法，用引物5’ -accatggatctgcgtctaattttcgg-3‘(位于ipt基因编码区上游，划线处为Nco I位点)和引物5，- cgttcgatgacgaaaatggaag-3，(位于ipt基因终止子的下游)、Prin^tar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从根癌农杆菌U^ro力acieriws tumefaciensV^% C58菌体中扩增位于pTiC58载体上的异戊烯基转移酶基因ipt (GenBank accession No. NC_003308)，反应条件为95 °C 预变性 2 min，95°C 变性 10 sec, 55°CM 火20 86(；，721延伸1 min 10 sec，30个循环，最后72 °C延伸10 min。电泳回收1001 bp片段，用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMD18-T (TaKaRa,日本)，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子。PCR扩增筛选的引物为5’ -ac catggatctgcgtctaattttcgg-3‘(位于ipt基因编码区上游，划线处为Nco I位点)和 5，-gtaacgccagggttttccca-3，(位于 LacZ 的下游)，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min, 94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min，电泳检测得到预期1078 bp大小的产物，表明重组子中同时含有ipt基因序列，且按预期的结构排列。酶切鉴定结果显示，^boR I、Afc0 I、Xho I均为预期的单酶切位点。测序验证得到了 ipt基因克隆，得到阳性克隆载体pVCT1243。本发明所述载体pVCT2130的构建步骤如下
用EcoR I和Nco I酶切载体pVCT1243，电泳回收3657 bp片段，弃38 bp片段。用相同的酶切载体 PCAMBIA1302 (GenBank accession No. AF234298)，回收 813 bp 的 CaMV 35S启动子片段，弃9736 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接， 转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5’ -cccaagcttcatggagtcaaagattc-3，(位于 CaMV 35S 启动子上游，划线处为 HindIII 位点)和 5’ -ctaatacattccgaatggatgacc-3’(位于ipt编码区的下游，划线部分为ipt基因的翻译终止密码子)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，55°C退火20 sec, 72°C 延伸1 min 20 sec，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1277 bp大小的产物，表明重组子中同时含有CaMV 35S启动子和ipt基因序列，且按预期的结构排列。酶切鉴定结果显示，HindIII酶切得到1783 bp和沈86 bp大小的预期产物，得到阳性克隆载体PVCT2130。本发明所述载体pVCT2238的构建步骤如下
用引物5，- cccaagcttcatggagtcaaagattc-3，(位于CaMV 35S启动子上游，划线处为 HindIII位点)和引物5，-cgttcgatgacgaaaatggaag-3，(位于ipt基因终止子的下游)、 PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa，日本)从pVCT2130载体DNA中扩增出!35S: ipt基因片段，反应条件为95°C预变性2 min，95°C变性10 sec，55°C退火20 sec，72°C延伸1 min 40sec，30个循环，最后72°C延伸10 min。电泳回收1552 bp片段，用HindIII酶切后，回收 1547 bp片段，弃4 bp片段。用HindIII和PmaC I酶切载体pVCT2237，回收10464 bp片段，弃413 bp和1100 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接(使ipt基因的下游与Tnos上游连在一起)，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子。PCR 扩增筛选的引物为5，-accatggatctgcgtctaattttcgg-3‘(位于ipt基因编码区上游，划线处为Nco I位点)和引物5’ -atcgcaagaccggcaacagg-3，(位于Tnos终止子中)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，57°C退火20 sec，72°C延伸1 min，;35个循环， 最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1094 bp大小的产物，表明重组子中同时含有ipt 基因下游与iTnos相连。酶切鉴定结果显示，Sac I为预期的单位点，EcoR I和MlI酶切得到3091 bp和8921 bp大小的预期产物。测序结果显示了重组的ipt基因与Tnos终止子的序列以及两者精确重组结合处序列，得到阳性克隆载体PVCT2238。本发明所述植物双元表达载体pVCT2221的构建步骤如下(图10)
用Sal I酶切载体pVCT2231，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Sac I酶切，电泳回收8779 bp片段，弃1456 bp片段。用BstEII酶切载体pVCT2237，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Me I酶切，回收3744 bp片段，弃8233 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan 抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5，-ctgcaagaatctcaaacacgg-3，(位于RD29A低温诱导启动子上游)和5，-ctgtaactatcatcatcatcatag-3，(位于内含子下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec, 35 循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1719 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 RD29A: :ntCre 序列。用弓|物 5，-cggaattcagggagtcacgttatgac-3，(位于 Pnos 启动子上游)禾口 5，- catgagcgaaaccctataggaacc-3，(位于 CaMV 35S 终止子 pA 中)，PCR 反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，59°C退火20 sec，72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1664 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 Pnos: :ntpllm: :pA序列。再用弓I物 5，- atgacgcacaatcccactatcc-3，(位于 CaMV 35S 启云力子中)和5，-atcgcaagaccggcaacagg-3‘(位于iTnos终止子中)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，56°C退火20 86(；，721延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸 10 min,电泳检测得到预期1004 bp大小的产物，表明重组子中同时含有35S: :mGFP: :Tnos 序列。酶切鉴定结果显示，EcoR I和Hind III酶切得到M96 bp和10032 bp大小的预期产物。经测序验证，得到阳性克隆植物双元表达载体PVCT2221。本发明所述植物双元表达载体pVCT22M的构建步骤如下(图11)
用Sal I酶切载体pVCT2231，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Sac I酶切，电泳回收8779 bp片段，弃1456 bp片段；用BstEII酶切载体pVCT2238，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Me I酶切，回收3779 bp片段，弃8233 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan 抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5，-ctgcaagaatctcaaacacgg-3，(位于RD29A低温诱导启动子上游)和5，-ctgtaactatcatcatcatcatag-3，(位于内含子下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec, 35 循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1719 bp大小的产物，表明重组子中同时含
14有 Ι ^9Α: :ntCre 序列。再用引物 5，- atgacgcacaatcccactatcc-3，(位于 CaMV 35S 启动子中)和5’ -cgttcgatgacgaaaatggaag-3’ (位于ipt基因终止子的下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，55°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min，;35 个循环， 最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1088 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 35S::ipt序列。酶切鉴定结果显示，BstE II和EcoR I为预期的单位点，Sal I和Me I 酶切得到观16 bp和9747 bp大小的预期产物。测序结果显示了 CaMV 35S终止子pA、LoxP 和nptnm相连的序列。经测序验证，得到阳性克隆植物双元表达载体PVCT22M。上述植物双元表达载体在转基因烟草方面的应用。本发明所构建的RD^A: :ntCre和LoxP以不同方式所构成的低温诱导删除选择标记基因系统与目的基因、选择标记基因及其相关启动子等其它构建元件融合成新的基因的方式可以采用本领域常用的方式，并可以将融合成的新的基因转入到本领域常用的载体中构建成表达载体再转化到植物中。本发明所指的“植物双元表达载体”是指不含有Vir区、而含有T-DNA的微型质粒 (或微型Ti载体)，包括由T-DNA左边界(LB)和右边界(RB)界定的T-DNA结构和T-DNA外侧结构，其T-DNA结构中带有能在植物中表达的选择标记基因和目的基因，而T-DNA外侧带有原核抗性基因、大肠杆菌复制子和农杆菌复制子。该载体是一种既能在大肠杆菌又能在农杆菌中复制的穿梭载体，并能经农杆菌介导，将T-DNA中的基因导入植物基因组。本发明所指的“转基因烟草”是指通过分子生物学、生物技术等手段，将其它生物的基因通过植物双元表达载体转移到烟草基因组中，从而使被改造的烟草的某些遗传性状得到改造和表达，用于改造的目的基因可以来源于植物、动物以及微生物或者人工合成的基因。本发明具有如下的有益效果
本发明提供的重组酶ntCre基因，在诱导型启动子RD^A的低温诱导下表达，含所述重组酶ntCre基因的本发明双元表达载体，将该表达载体转化宿主中解决了现有的标记基因删除所存在的都要通过自交分离才能得到无选择标记基因的转基因植株，选育过程耗时长，程序繁琐，同时只能局限于有性杂交的植物中的问题；具体地，利用低温诱导启动子RD29A来控制ntCre/LxoP重组系统表达，在重组酶的作用下，植物体内发生位点特异重组反应从而将选择标记基因删除，从而改变了现有技术中采用HSP70m热激启动子删除标记基因时间较长、对转基因植物生长不利等存在的一些问题，同时方便在夏季利用ntCre/ LxoP重组系统在低温条件下来删除转基因植株中的选择标记基因，避免了因高温季节意外停电而影响获得抗性或可视性转基因植株。本发明所提供的植物双元表达载体的构建方法高效地切除了选择标记基因和重组酶基因自身，避免了重组酶过量表达带来对植物生长的潜在危害，从而获得无标记基因的转基因植株。


图1是低温诱导删除选择标记基因的双元表达载体T-DNA结构； 图2是植物双元表达载体pVCT2221和pVCT22M的构建示意图3为低温诱导删除选择标记基因的双元表达载体PVCT2221的工作原理；图4为低温诱导删除选择标记基因的双元表达载体PVCT22M的工作原理； 图5为转基因烟草的⑶S活性组织染色； 图6为转基因烟草的不同组织⑶S活性组织染色； 图7为pVCT2221转化烟草后的低温诱导删除选择标记基因的功能验证； 图8为pVCT22M转化烟草后的低温诱导删除选择标记基因的功能验证； 图9是携带目的基因的低温诱导删除选择标记基因的双元表达载体T-DNA结构； 图10为双元表达载体pVCT2221的构建和鉴定； 图11为双元表达载体PVCT22M的构建和鉴定。
具体实施例方式以下实施例是结合附图对本发明进行的进一步说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何尝试对本发明的改变和变形，只要不超出本发明的目的与精神，均应视为属于本发明所附权利要求所定义的范围。实施例一重组酶ntCre基因的制备、植物基因双元表达载体pVCT2221的T-DNA 的构建、转化进根癌农杆菌EHA105中，转化植物并获得转基因植物(烟草)及应用效果
1、具有核定位信号编码序列的重组酶ntCre基因的制备方法
用引物 SEQ ID. 4.和引物 SEQ ID. NO. 5,PrimStar HS DNA 聚合酶(TaKaRa，日本)从大肠杆菌菌株BM25. 8(Clontech,美国)基因组DNA中PCR扩增出1040 bp大小的源自Pl噬菌体的Cre基因(GenBank accession X03453)，反应条件为95°C预变性2 min，95°C变性 10 sec，50°C退火 20 86(；，721延伸1 min 10 sec，3 个循环，95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸1 min 10 sec，27个循环，最后72°C延伸10 min。用Taq DNA聚合酶加“A” 尾后，TA克隆进T载体pMD18-T (TaKaRa,日本)，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp 抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID. NO. 6和SEQ ID. NO. 7，PCR反应条件为-MV 预变性3 min，94°C变性20 sec，52°C退火20 sec，72°C延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期898 bp大小的产物，测序结果显示所克隆的基因同GenBank 中公布的序列，得到阳性克隆载体PVCT1251和重组酶Cre基因。用Xba I和Nco I酶切载体pVCT1251，回收3727 bp片段，弃11 bp片段。将合成的序列SEQ ID. NO. 8和合成的序列SEQ ID. NO. 9于94°C变性3分钟后退火，构成含有拟南芥 At4g01735基因内含子和猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信号的编码序列的)(ba I-Nco I接头。经测序验证，将回收片段与接头用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID. NO. 10和SEQ ID. NO. 11, PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，55°C退火20 sec，72°C延伸30 sec，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到四3 bp预期大小产物。经测序验证，得到阳性克隆载体pVCT1252，使重组酶Cre基因上游带上第一内含子和具有核定位信号编码的序列。2、植物基因双元表达载体pVCT2221的T-DNA的构建方法(图2，图10)
用Sal I酶切载体pVCT2231，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Sac I酶切，电泳回收8779 bp片段，弃1456 bp片段。用BstEII酶切载体pVCT2237，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Me I酶切，回收3744 bp片段，弃8233 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5’ -ctgcaagaatctcaaacacgg-3，(位于RD29A低温诱导启动子上游)和5，-ctgtaactatcatcatcatcatag-3，(位于内含子下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec, 35 循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1719 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 RD29A: :ntCre 序列。用弓丨物 5，-cggaattcagggagtcacgttatgac-3，(位于 Pnos 启动子上游)禾口 5，- catgagcgaaaccctataggaacc-3，(位于 CaMV 35S 终止子 pA 中)，PCR 反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，59°C退火20 sec，72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1664 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 Pnos: :ntpllm: :pA序列。再用弓I物atgacgcacaatcccactatcc-3‘(位于CaMV 35S启云力子中)和5，-atcgcaagaccggcaacagg-3‘(位于iTnos终止子中)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，56°C退火20 sec，72°C延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸 10 min,电泳检测得到预期1004 bp大小的产物，表明重组子中同时含有35S: :mGFP: :Tnos 序列。酶切鉴定结果显示，EcoR I和Hind III酶切得到M96 bp和10032 bp大小的预期产物。经测序验证，得到阳性克隆植物双元表达载体PVCT2221。3、转化进根癌农杆菌EHA105中，转化植物并获得转基因植物(烟草)及应用效果经农杆菌EHA105介导，植物双元表达载体pVCT2221的T-DNA整合进烟草基因组后，将
赋予转化细胞具有卡那霉素抗性和显示出绿色荧光，同时获得低温诱导删除选择标记基因的转基因烟草。经低温诱导表达能定位到细胞核内的Cre重组酶，并通过Cre重组酶删除两个同向的LoxP之间的序列，最终结果将残留1个LoxP，以及源于T-DNA上的和Tnos 终止子(图3)。具体应用方法及效果验证如下
将pVCT2221表达载体中的T-DNA导入烟草核基因组，在MS附加2. 5 mg/L BA的固体培养基上得到抗150 mg/L卡那霉素(Kan)的试管苗，在50 mg/L卡那霉素的培养基上能够正常生根(图7A)。在荧光显微镜的400 nm光下，Kan抗性的烟草植株根呈现明亮的绿色荧光(图7B)。经4°C左右的低温处理8周后，一部分植株转移到含有150 mg/L卡那霉素的培养基上，原本抗卡那霉素呈现白化(图7C)，即不再抗卡那霉素，表明转基因植株中的卡那霉素抗性基因被删除，而另一部分转基因植株转移到不加卡那霉素的培养基上，能够正常生长和诱导生根，所生成的根在在荧光显微镜下不再具有绿色荧光(图7D)，表明mGFP基因也被删除。实施例二 植物双元表达载体PVCT22M的T-DNA的构建方法、转化进根癌农杆菌 EHA105中，转化烟草并获得转基因烟草及应用效果
1、植物双元表达载体PVCT22M的T-DNA的构建方法(图2，图11) 用Sal I酶切载体pVCT2231，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Sac I酶切，电泳回收8779 bp片段，弃1456 bp片段。用BstEII酶切载体pVCT2238，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用Me I酶切，回收3779 bp片段，弃8233 bp片段。将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan 抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5，-ctgcaagaatctcaaacacgg-3，(位于RD29A低温诱导启动子上游)和5，-ctgtaactatcatcatcatcatag-3，(位于内含子下游)，PCR反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec, 35循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1719 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 Ι ^9Α: :ntCre 序列。再用引物 5，- atgacgcacaatcccactatcc-3，(位于 CaMV 35S 启动子中)和5’ -cgttcgatgacgaaaatggaag-3’ (位于ipt基因终止子的下游)，PCR反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，55°C退火20 sec，72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1088 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 35S::ipt序列。酶切鉴定结果显示，BstE II和EcoR I为预期的单位点，Sal I和Me I 酶切得到观16 bp和9747 bp大小的预期产物。测序结果显示了 CaMV 35S终止子pA、LoxP 和nptnm相连的序列，得到阳性克隆植物双元表达载体pVCT22M。2、转化进根癌农杆菌EHA105中，转化烟草并获得转基因烟草及应用效果
经农杆菌EHA105介导，植物双元表达载体pVCT22M的T-DNA整合进烟草基因组后，将赋予转化细胞具有卡那霉素抗性，且因促进了细胞分裂素合成而使得转基因试管苗呈现畸形、失去顶端优势和不能生根。将这种卡那霉素抗性的可视转基因植株转移到不含卡那霉素的植物培养基上，并置于冰箱内于4°C左右的低温处理2-4周，并重复1-2代。诱导表达能定位到细胞核内的Cre重组酶，并通过Cre重组酶删除两个同向的LoxP之间的序列， 最终结果将残留1个LoxP，以及源于T-DNA上的和Tnos终止子(图4)，使本来畸形的转基因植株在形态上恢复正常。最后通过PCR检测确认不再含有nptllm、ntCre和ipt 基因，从而使转基因植株的选择标记基因得到删除。具体应用方法及效果验证如下
用农杆菌菌株EHA105 (pVCT2224)转化烟草。在不加任何激素的MS培养基上得到大量畸形的抗150 mg/L卡那霉素的丛生试管苗(图8A)。畸形试管苗可以适当长高，但顶端优质不明显、易生侧枝、节间缩短、叶片狭长、不能生根(图8B，图8C)。经4°C左右低温处理 8周后，一部分植株转移到含有150 mg/L卡那霉素的培养基上，原本抗卡那霉素呈现白化 (图8D)，即不再抗卡那霉素，表明转基因植株中的卡那霉素抗性基因被删除，而另一部分转基因植株转移到不加卡那霉素的培养基上，能够正常生长和诱导生根(图8E，图8F)，表明 ipt基因也被删除。用位于和Tnos上的引物，经高保真PCR扩增后结果显示与 Tnos之间不存在pVCT22M的nptnm、ntCre和ipt基因，TA克隆进pMD18_T后测序证实， 整合进烟草基因组的T-DNA内的2个LoxP之间发生了精确重组，删除了其间的所有序列， 并残留1个LoxP，此结果完全同预期。实施例三本发明双元表达载体转化烟草后，RD29A启动子的功能验证。将含有RD^A:⑶S报告基因的载体通过农杆菌EHA105介导转基因烟草，得到整合RD^A:⑶S基因的卡那霉素抗性植株。通过常温和低温处理转基因和非转基因植株，进行⑶S活性组织的化学染色分析，结果显示未经低温处理的转基因单株叶片经X-Gluc染色后，用70%乙醇充分脱色，只观察到极少数蓝斑或无蓝斑出现，表明RD29A启动子在常温下不具有启动下游基因表达的功能。经4°C左右低温过夜处理的转基因单株，经X-Gluc染色后，用70%乙醇充分脱色，能明显观察到蓝斑的出现，表明pRD29A启动子在低温下能启动下游基因的表达，是一个低温诱导型启动子。而非转基因单株不论是常温还是低温处理，经 X-Gluc染色后，用70%乙醇充分脱色，均不能观察到蓝斑出现，表明非转基因植株不具有本底效应。见图5。镜检观察到烟草转基因植株的根、茎、叶、叶柄均被X-Glue溶液染成蓝色，但花瓣
18未染成蓝色，说明基因在植株的根、茎、叶、叶柄中均有表达，在花瓣中不表达。在根中，根尖部分⑶S基因不表达，从根的横切面看，根的髓部⑶S活性较强，而在皮层⑶S基因表达较弱。茎中维管束部分有较高的GUS活性。而皮层及髓部GUS基因几乎没有表达。在叶中， GUS基因活性以叶脉的维管束较高，叶毛管GUS基因表达也较强。在叶柄中，GUS基因表达也较强。表明RD29A启动子不是组织特异性启动子。(见图6)
RD29A启动子在4°C低温处理下所有转基因植株均有表达，不同的转基因单株表达启动温度的实验结果表明单株Tci-Sjci-H-11、1^-15在10°C才开始表达。
本发明pVCT2221和pVCT22M植物双元载体只是为验证低温诱导删除选择标记基因的效果而构建。为用于将目的基因导入植株，可将目的基因插入到右边的LoxP位点与最右边的Tnos之间(图Ia和图lb)，从而在删除选择标记基因的同时，存留目的基因，获得无选择标记基因的、仅含目的基因的转基因植株。例如，图9中的pVCT2291和pVCT2297分别为由PVCT2221和pVCT22M衍生出的表达载体。
权利要求
1.一种重组酶，其特征在于它为ntCre基因，其具有如SEQ ID No. 1序列。
2.如权利要求1所述重组酶的制备方法，其特征在于用引物SEQ ID. 4和引物SEQ ID. NO. 5、PrimStar HS DNA聚合酶从大肠杆菌菌株BM25. 8 基因组DNA中PCR扩增出1040 bp大小的源自Pl噬菌体的Cre基因(GenBank accession Χθ;3453)，反应条件为95°C预变性 2 min，95°C变性 10 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，3 个循环，95°C变性 10 sec，60°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 10 sec，27 个循环，最后72°C延伸10 min;用Taq DNA聚合酶加“A”尾后，TA克隆进T载体pMD18_T，转化大肠杆菌)CL1-Blue感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID. NO. 6 和 SEQ ID. NO. 7，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec，52°C退火 20 sec, 72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期898 bp大小的产物， 测序结果显示所克隆的基因同GenBank中公布的序列，得到阳性克隆载体pVCT1251和重组酶Cre基因；用Xba I和Nco I酶切载体pVCT1251，回收3727 bp片段，弃11 bp片段；将合成的序列SEQ ID. NO. 8和合成的序列SEQ ID. NO. 9于94°C变性3分钟后退火，构成含有拟南芥At4g01735基因内含子和猴SV40病毒外壳蛋白T抗原核定位信号的编码序列的)(ba I-Nco I接头；将回收片段与接头用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue 感受态细胞，Amp抗性重组子经PCR扩增筛选，引物为SEQ ID. NO. 10和SEQ ID. Ν0· 11，PCR 反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，55°C退火20 sec，72°C延伸30 sec, 35 个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到四3 bp预期大小产物，得到阳性克隆载体 PVCT1252，使重组酶Cre基因上游带上第一内含子和具有核定位信号编码的序列；用)(ba I和&ic I酶切载体pVCT2027，回收3106 bp片段，弃1889 bp片段；用Xba I和&ic I酶切载体pVCT1252，回收1096 bp片段，弃17 bp和洸69 bp片段； 将两个片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用分别位于热激启动子HSP70m上游的LacZ上和位于Cre基因下游的引物SEQ ID. NO. 5 进行PCR扩增筛选，得1315 bp预期大小产物，再经酶切和测序鉴定，得到阳性克隆载体 PVCT2136 ；用EcoRV酶切载体pVCT2136，电泳回收4196 bp片段；采用PCR方法， 用引物5，-gtaaatttctagtttttctccttc-3，(位于内含子上游)和引物 5'-ctgtaactatcatcatcatcatag-3'(位于内含子下游)、PrimStar HS DNA聚合酶(TaKaRa, 日本)从PCAMBIA1301载体DNA中扩增出190 bp大小的内含子序列，并电泳回收；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Amp抗性重组子，用分别位于Cre基因两端的引物SEQ N0. 4和SEQ ID. NO. 5 (位于ntCre基因下游)进行PCR 扩增鉴定和测序验证，得到阳性克隆载体PVCT2117和预期的ntCre基因。
3.含权利要求1所述重组酶的植物双元表达载体，其特征在于所述植物双元表达载体的T-DNA结构包括Ι ^9Α: ntCre: :Tnos基因和LoxP序列；其中RD^A为重组酶ntCre 的低温诱导特异性启动子，LoxP为重组酶ntCre的识别位点、切割和重组的序列。
4.如权利要求3所述的植物双元表达载体，其特征在于所述的植物双元表达载体为 PVCT2221，其 T-DNA 结构的主要构建元件包括LB、T35s, LoxP, nptllm、Pnos、Tnos、ntCre、 RD29A,35S,mGFP 和 RB 序列。
5.如权利要求3所述的植物双元表达载体，其特征在于所述的植物双元表达载体为PVCT2224,其 T-DNA 结构的主要构建元件包括LB、T35s, LoxP, nptllm、Pnos、Tnos、ntCre、 RD29A、35S、ipt、Tipt 和 RB 序列。
6.如权利要求3所述的植物双元表达载体，其特征在于所述植物双元表达载体具有如图Ia或图Ib所示的结构。
7.如权利要求3 6任一项所述植物双元表达载体的构建方法，其特征在于所述构建方法是通过如下载体的阳性克隆pVCT1251，pVCT1252，pVCT2006，pVCT2027，PVCT2136, pVCT2117,pCR2. l_AtCBF3，pCR2. lm,pVCT1191,pVCT1202,pVCT2072,pVCT2102, PVCT2231, pVCT1009, pVCT2236, pVCT2020, pVCT2118, pVCT2237, pVCT1243, pVCT2130, PVCT2238，最终构建植物双元表达载体pVCT2221和pVCT22M。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，按以下步骤进行用Sal I酶切载体pVCT2231，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用 Sac I酶切，电泳回收8779 bp片段，弃1456 bp片段；用BstEII酶切载体pVCT2237， Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用&ic I酶切，回收3744 bp片段，弃 8233 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5，-ctgcaagaatctcaaacacgg-3’和 5，-ctgtaactatcatcatcatcatag-3，，PCR 反应条件为94°C 预变性 3 min，94°C 变性 20 sec，50°C退火 20 sec，72°C延伸 1 min 40 sec，；35 个循环，最后 72°C延伸 10 min，电泳检测得到预期1719 bp大小的产物，表明重组子中同时含有RD^A: :ntCre序列；用引 ^J 5' -cggaattcagggagtcacgttatgac-3‘ 禾口 5，_ catgagcgaaaccctataggaacc_3，，PCR 反应条件为94°C预变性3 min，94°C变性20 sec，59°C退火20 sec，72°C延伸1 min， 35个循环，最后72°C延伸10 min,电泳检测得到预期1664 bp大小的产物，表明重组子中同时含有 Pnos: :ntpllm: :pA 序列；再用弓I 物 5' - atgacgcacaatcccactatcc-3‘禾口 5，-atcgcaagaccggcaacagg-3，，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec, 56°C 退火20 sec，72°C延伸1 min，35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1004 bp 大小的产物，表明重组子中同时含有35S: :mGFP: :Tnos序列；酶切鉴定结果显示，EcoR I和Hind III酶切得到对96 bp和10032 bp大小的预期产物，得到阳性克隆植物双元表达载体PVCT2221。
9.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，按以下步骤进行用Sal I酶切载体pVCT2231，Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用 Sac I酶切，电泳回收8779 bp片段，弃1456 bp片段；用BstEII酶切载体pVCT2238， Klenow Fragment酶补平，过DNA回收柱去酶，再用&ic I酶切，回收3779 bp片段，弃 8233 bp片段；将回收片段纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞，得Kan抗性重组子，PCR扩增筛选的引物为5，-ctgcaagaatctcaaacacgg-3’和 5，-ctgtaactatcatcatcatcatag-3，，PCR 反应条件为94°C预变性 3 min，94°C变性 20 sec, 50°C退火20 sec，72°C延伸1 min 40 sec，；35个循环，最后72°C延伸10 min，电泳检测得到预期1719 bp大小的产物，表明重组子中同时含有RD^A: :ntCre序列；再用引物5’ -atgacgcacaatcccactatcc-3 ‘禾口 5，-cgttcgatgacgaaaatggaag-3 ‘，PCR:94°Cf|i变性3 min，94°C变性20 sec，55°C退火20 sec，72°C延伸1 min，；35个循环，最后72°C延伸 10 min，电泳检测得到预期1088 bp大小的产物，表明重组子中同时含有35S: ipt序列；酶切鉴定结果显示，BstE II和EcoR I为预期的单位点，Sal I和Me I酶切得到观16 bp 和9747 bp大小的预期产物，测序结果显示了 CaMV 35S终止子pA、LoxP和nptnm相连的序列，得到阳性克隆植物双元表达载体PVCT22M。
10.如权利要求3 6任一项所述植物双元表达载体在转基因烟草方面的应用。
全文摘要
一种重组酶，它为ntCre基因，其具有如SEQIDNo.1序列；含所述重组酶的双元表达载体，其T-DNA结构包括RD29A::ntCre::Tnos基因和LoxP序列；其中RD29A为重组酶ntCre的冷诱导特异性启动子，LoxP为重组酶ntCre的识别、切割和重组的序列。本发明提供的重组酶ntCre基因，在诱导型启动子RD29A的低温诱导下表达；含所述重组酶ntCre基因的本发明双元表达载体转化植物后，能通过低温诱导高效删除选择标记基因及RD29A::ntCre::Tnos基因自身，得到无选择标记基因的转基因植株。
文档编号A01H5/00GK102443574SQ20111040369
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者宋波, 张兴国, 张香琴, 杜小兵, 苏承刚, 陈吉裕 申请人:西南大学