专利名称：一种脱除崇明水仙病毒的方法
技术领域：
本发明属植物组培脱毒技术领域，涉及一种脱除崇明水仙病毒的方法，具体涉及一种利用医用抗病毒药物脱除崇明水仙病毒的方法。
背景技术：
我国水仙栽培历史悠久，大约1300多年前就开始了引种与栽培。水仙是我国十大名花之一，素有“凌波仙子”之美称，具有重要的观赏价值和经济价值。目前我国水仙的主要产地为福建的漳州、厦门、福州、上海市的崇明岛及浙江的普陀地区。这些地区栽培的水仙均属多花水仙(Narcissus tazetta)变种(N. tazettavar. chinensis Roem)。崇明水仙作为上海的传统花卉之一，在崇明县栽培已有上百年历史，以合兴乡的栽培面积为最大，享有“水仙之乡”的盛名。作为上海地方特色花卉、特色资源，“崇明水仙”是上海唯一具有地理标志性的花卉品种资源，崇明水仙曾经因其浓郁的芳香而著称于国内外花卉市场。但在最近的几十年，崇明水仙的生产数量和品质不断下降，最严重时几乎没有开花种球上市。造成这种局面的主要原因在于长期无性繁殖使得崇明水仙的品种退化。并且，崇明水仙在长期栽培过程中还严重遭受病毒的侵染及其危害，在植株上主要表现为花叶、斑驳、褪绿、黄化、坏死和哑花，或花变小、花剑明显减少、香味淡，以及整个植株矮化畸形、鳞茎变小、生长势差、抗性减弱等缺陷，这已成为影响崇明水仙花品质和产量的主要原因之一。据报道，目前崇明水仙主要存在以下3类病毒①水仙普通潜隐病毒(Narcissuscommon latent virus,简称 NCLV，Genbank 登录号为 EU200454)；②水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus, NDV, GenebankEU200456) ； (3)/^^
(Narcissus mottling-associated virus, fH ^ NMaV, Genebank S 5 ^EU182651)；其中，在36份崇明水仙田间病样中，NCLV、NDV和NMaV检出率分别为11. 1%,13. 9%和 100%。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种脱除崇明水仙病毒的方法，该方法操作简单，成本低，脱毒效果显著，能在短时间内获得大量崇明水仙的脱毒种源，用于快繁和工厂化生产，恢复崇明水仙种源商品性和观赏性，提高种植户的经济效益。本发明的脱除崇明水仙病毒的方法，通过采用植物组织培养脱毒技术，选择试管籽球作为脱毒材料，利用医用抗病毒药物可以将崇明水仙的主要病毒完全脱除或显著降低病毒含量。该方法有效提高了脱毒效率，并且可以立即对脱毒后的种球在无菌条件下进行扩繁，极大提高了脱毒材料的利用率。具体来讲，本发明的脱除崇明水仙病毒的方法，包括如下步骤1、试管鳞茎的病毒脱除将增殖培养产生的崇明水仙鳞茎，选择直径< 0. 5cm的切分成单个鳞茎，接种在含抗病毒药剂的脱毒培养基上。20-25°C，湿度70-80%，8-10h/d、光照条件下进行脱毒培养，光照强度为1500-2000LX，其中，所述脱毒培养基包括MS培养基以及下述组分
蔗糖40 g/L
琼脂4 g/L
6-苄氨基嘌呤(6-BA)1-5 mg/L
萘乙酸(NAA)0.5-2 mg/L
抗病毒药剂10-60 mg/L
pH5.8-6.0 ο2、病毒检测剪取脱毒处理后的崇明水仙试管球上的叶子作为病毒检测材料，RT-PCR进行病毒检测。步骤如下2. 1叶子经液氮研磨后用RNArose Reagent试剂盒提取崇明水仙总RNA，于_70°C冰箱保存备用。2. 2引物设计2. 2. 1水仙斑驳相关病毒(NmaV)检测的寡聚核苷酸引物反转录引物CMV_2(5，-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3‘)。巢式PCR 第一轮引物NmaV-P0L 简并引物(5，-CARTCNGCHAWDKCTAA-3，)(R = Aor G ;N = A，C，G or T ;ff = A or T ;H = A, T or C ;D = A, T or G) ；CMV-2 (5，-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3’ )。巢式PCR 第二轮引物NmaV-l (5，-CTGTCAAGCGTGATGCTACCC-3，) ；NmaV-2 (5，-CTCCATCTCCACCAGCTTCCT-3')。2. 2. 2水仙退化病毒(NDV)检测的寡聚核苷酸引物反转录引物M4T(5，-GTTTTCCCAGTCACGAC (T) 16-3，)。PCR 扩增引物Sprimer (5，-GGXAAYAAYAGYGG XCAZCC-3，) (X = A，G，C or T ;Y =T or C ;Z = A or G) ；M4(5，-GTTTTCCCAGTCACG AC-3，)。2. 2. 3水仙潜隐病毒(NCLV)检测的寡聚核苷酸引物反转录引物M4T(5，-GTTTTCCCAGTCACGAC (T) 16-3，)。PCR 扩增引物pCar-l (+) (5，-ATGCCNCTNAM XCCXC C_3，)(N = A 或 T ;M = C 或G ;X = A，T，C 或 G ;Y = T 或 C ;Z = A 或 G) ；M4(5' -GTTTTCCCAGTCACG AC-3')。2. 3cDNA合成以所提的总RNA为模板，检测病毒样本均以各自下游引物为起始引物，用M-MLV反转录酶合成病毒第一链cDNA。取一新的0. 5mL离心管，依次加入以下试剂Rnase Free H2O5 χ RT Buffer
dNTP Mixture (10 mM/L)Rnase Inhibitor (10 u/pL)下游起始引物(lOpmoL&L)模板RNA
ReverTra Ace(100 ii/pL)
总体积
0.5-2 μ 2-8 μL1-4 μ 0.5-2 μL0.5-2 μL5-20 μL0.5-2 μL10-40 μ .按以下条件进行反转录反应42°C、1. 5h ；99°C、5. Omin ；4°C、5. Omin ；瞬间离心。互补链cDNA合成后加入40 μ L dd H2O,置于冰上或4°C下保存，作为进一步PCR扩增的cDNA模板。2. 4PCR 扩增PCR 扩增体系cDNA 模板 1 μ L，上、下游引物(IOpmol/ μ L)各 2 μ L，10 X PCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (lOmM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(1-5U/ μ L) 0· 1 μ L，ddH20 8· 9μ L。PCR 扩增程序94 °C l-3min ；94°C 30_60s，55°C 0_lmin，52°C 0_lmin，45°C，
0-lmin，47°C0-lmin 72°C l_3min，30 次循环；最后 72°C延伸 lOmin。2. 5PCR产物检测PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳，观察PCR是否扩增出目标片段。阳性表明有病毒存在；阴性没检测到病毒。3、脱毒种源的试管保存将经检测已脱除病毒的脱毒种源转移到脱毒种源保存培养基上进行试管保存。每
1-2个月更换一次新培养基。保存培养条件为20-25°C，湿度70%，8-10h/d光照条件下进行培养，光照强度为1500-2000LX。其中，上述方法中，所述的抗病毒药剂选自阿昔洛韦注射液或片剂(9-[(2_羟基乙氧基)甲基]鸟嘌呤)、利巴韦林注射液或片剂(Ι-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酰胺)、盐酸吗啉胍注射液或片剂(N-(2-胍基-乙亚氨基)-吗啉)中的一种或多种。所述的脱毒种源保存培养基包括MS培养基以及下述组分 所述的崇明水仙试管鳞茎在进行病毒脱除前需经过外植体选择及消毒、诱导培养
琼脂
6-苄氨基嘌呤(6-BA)萘乙酸(NAA)
蔗糖
活性炭(AC)pH
4g/L
1-5 mg/L0.5-2 mg/L30-60 g/L0-1.0 g/L5.8-6.0。和增殖培养步骤。分别如下a、外植体选择及消毒选取健康、4_6°C左右冷处理4-6周后的崇明水仙的鳞茎，去掉干枯鳞叶、老根及鳞茎盘底部，自来水冲洗6-lOmin，剥去两层外部鳞叶，进行消毒处理。b、试管鳞茎的诱导培养经消毒处理后，在无菌滤纸上，将消毒处理的鳞茎分切为8mmX 5mm左右，带2 3片基部鳞片的小块接种在诱导培养基上，诱导试管鳞茎。诱导培养条件为诱导培养条件为温度20-25°C，湿度70-80%。暗培养10_15d后，再转入8_12h/d光照培养，光照强度为1500-2000LX。C、试管鳞茎的增殖培养将诱导产生的试管鳞茎切分后，接种增殖培养基上。增殖培养条件为20-25°C，湿度70-80 %，8-10h/d光照条件下进行增殖培养，光照强度为1500-2000LX。所述外植体的消毒过程为将鳞茎上部切除3/4后，再纵切成4块，用500-1000mg/L头孢拉定溶液浸泡2_4h。处理后，用75%酒精浸泡30_60s，再用0. 升汞浸泡10-15min，无菌水冲洗3_5遍。所述诱导培养基为MS+BAl-2mg/L+NAA l-2mg/L+ 蔗糖 30_40g/L+ 琼脂 4_6g/L，ρΗ5· 8-6. O0所述增殖培养基为MS+BA3-5mg/L+NAA l-2mg/L+ 蔗糖 30_40g/L+ 琼脂 4_6g/L，ρΗ5· 8-6. O0RT-PCR检测结果表明经本发明所述脱毒方法脱毒的崇明水仙试管鳞茎的NMaV病毒特异性普带亮度明显减低，而且未发现NCLV、NDV两种病毒的特异性普带。可见，本发明所述利用医用抗病毒药物脱除崇明水仙病毒的方法能有效降低崇明水仙NMaV病毒含量，并能完全脱除崇明水仙携带的NCLV、NDV病毒。本发明的有益效果1、首次在崇明水仙上运用医用抗病毒药物脱除病毒，操作简便快捷，既符合崇明水仙无茎尖的特有性状(不能通过茎尖培养脱毒)，又避免反复切割剖取茎尖带来的污染。节省了人力物力的同时，又为其他植物的脱毒提供一条有效参考途径。2、使用医用抗病毒药物代替传统的高纯度试验用进口试剂作为脱毒药剂，价格低廉，药剂也容易获得，能大幅节省生产脱毒种源的成本。3、对脱毒试管鳞茎提出了试管保存的方法，解决了脱毒种源的保存问题，既能保证脱毒种源的优良性状，又避免种源露地栽培后遭受病毒再次侵染，减少了反复脱毒带来的资源浪费。
图1为本发明诱导的崇明水仙试管鳞茎。图2为本发明RT-PCR技术病毒检测NMaV病毒结果，其中，1_9为脱毒处理后待检测样品的代码，CK为未经脱毒处理的叶片PCR普带，即阳性对照。图3为本发明RT-PCR技术病毒检测NCLV病毒结果，其中，1_9为脱毒处理后待检测样品的代码，CK为未经脱毒处理的叶片PCR普带，即阳性对照。
图4为本发明RT-PCR技术病毒检测NDV病毒结果，其中，1-9为脱毒处理后待检测样品的代码，CK为未经脱毒处理的叶片PCR普带，即阳性对照。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不限于此。本发明下述实施例所用的各种药剂和材料，如阿昔洛韦注射液或片剂、利巴韦林注射液或片剂、盐酸吗啉胍注射液或片剂、头孢拉定溶液、RNAroseReagent试剂盒、MS、ΒΑ、NAA> TaqDNA ^ ^ B|> RNase Free H2O> dNTPMixture>5 X RT Buffer> RNase Inhibitor>ReverTra Ace等均为常规市售产品。实施例11、外植体选择及消毒选取健康、4°C左右冷处理4周后的崇明水仙的鳞茎，去掉干枯鳞叶、老根及鳞茎盘底部，自来水冲洗6min，剥去两层外部鳞叶，将鳞茎上部切除3/4后，再纵切成4块，用1000mg/L头孢拉定溶液浸泡池。处理后，用75%酒精浸泡30s，再用0. 1 %升汞浸泡12min，无菌水冲洗5遍，备用。2、试管鳞茎的诱导外植体经消毒处理后，在无菌滤纸上，将材料分切为8mmX 5mm左右大小，带2 3片基部鳞片的小块接种在MS+BAlmg/L+NAAlmg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L (pH5. 8)诱导培养基上，诱导试管鳞茎。诱导培养条件为培养条件为温度25C，湿度70%。暗培养IOd后，再转入12h/d光照培养，光照强度为2000LX。培养2个月。诱导产生的崇明水仙鳞茎状态参见图1。3、试管鳞茎的增殖将诱导产生的试管鳞茎单个分开，切去叶子，纵切成2个，均需带鳞茎盘。切好后，接种在MS+BA 5mg/L+NAA lmg/L+蔗糖40g/L+琼脂4g/L (pH5. 8)增殖培养基上。增殖培养条件为25°C，湿度70%，10h/d光照条件下进行增殖培养，光照强度为2000LX。培养1个月。4、试管鳞茎的病毒脱除将增殖培养产生的崇明水仙鳞茎，选择直径< 0.5cm的小试管鳞茎，切分成单个鳞茎，切除所有叶片，接种在MS+BA 5mg/L+NAA lmg/L+阿昔洛韦注射液(或片剂)30mg/L (有效浓度)+利巴韦林注射液(或片剂)30mg/L (有效浓度)+蔗糖40g/L+琼脂4g/L(pH5. 8)脱毒培养基上。培养条件为25°C，湿度70%，10h/d光照条件下进行培养，光照强度为2000LX。培养1个月。5、脱毒处理后的病毒检测5. 1脱毒处理后，剪取0. 1克试管鳞茎上的叶子作为病毒检测材料，用RT-PCR技术进行病毒检测。5. 2叶子液氮研磨后用RNArose Reagent试剂盒(上海华舜生物公司)提取崇明水仙总RNA，最后于-70°C冰箱保存备用。5. 3RT-PCR 相关引物5. 3. 1水仙斑驳相关病毒(NMaV)检测的寡聚核苷酸引物
反转录引物CMV_2(5'-TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3 ‘)。巢式PCR 第一轮引物匪aV-POL 简并引物(5' -CARTCNGCHAWDKCTAA-3 ‘ ) (R = Aor G ;N = A，C，G or T ;ff = A or T ;H = A, T or C ;D = A, T or G) ；CMV-2 (5' -TTTAGCCGTAAGCTGGATGGA-3')。巢式PCR 第二轮引物NMaV-I (5' -CTGTCAAGCGTGATGCTACCC-3' );WaV_2(5'-CTCCATCTCCACCAGCTTCCT-3')。5. 3. 2水仙退化病毒(NDV)检测的寡聚核苷酸引物反转录引物M4T(5'-GTTTTCCCAGTCACG AC(T) 16-3')。PCR扩增弓丨物Sprimer(5' -GGXAAYAAYAGYGG XCAZCC-3‘ ) (X = A，G，C or T ；Y = T or C ;Z = A or G) ；M4(5' -GTTTTCCCAGTCACG AC_3')。5. 3. 3水仙潜隐病毒(NCLV)检测的寡聚核苷酸引物反转录引物M4T(5'-GTTTTCCCAGTCACG AC(T) 16-3')。 PCR 扩增引物:pCar-l (+) (5 ‘ -ATGCCNCTNAM XCCXC C-3 ‘ ) (N = A 或 T ;M = C 或G ;X = A, T，C 或 G ;Y = T 或 C ;Z = A 或 G) ;Μ4 (5 ‘ -GTTTTCCCAGTCACG AC-3 ‘)。5. ^DNA合成以所提的总RNA为模板，检测病毒样本均以各自下游引物为起始引物，用M-MLV反转录酶(Τ0Υ0Β0公司)合成病毒第一链cDNA。取一新的0. 5mL离心管，依次加入以下试剂互补链cDNA合成后加入40 μ L dd H2O,置于冰上或4°C下保存，作为进一步PCR扩增的cDNA模板。5. 5PCR 扩增5. 5. 1水仙斑驳相关病毒
RNase Free H2O5xRT Buffer
dNTP Mixture (10 mM/L)RNase Inhibitor (10 u/pL)下游起始引物(lOpmoL&L)模板RNA
ReverTra Ace(100 ii/pL)TotaL Volume
IpL4μΙ2μLIpLIpLIOpL
1 μ ν
20μΙ^ο
99°C、v5.0min
ψ
4。C、 5.0 miψ
瞬间离心
5.0 min
8
巢式第一轮PCR反应cDNA 模板 1 μ L, NMaV-POL (1 Opmol/ μ L) 2 μ L, CMV-2 (lOpmol/μ L) 2 μ L，10XPCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L，dNTP (lOmM/L) 2 μ L，LA TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 1 μ L,ddH20 8. 9 μ L。扩增程序为94°C2min ；94°C 30s，55°C lmin，45°C lmin，72°C 2min，30 次循环；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 产物大小631bp巢式第二轮PCR反应cDNA 模板 1 μ L, NMaV-I (lOpmol/μ L) 2 μ L，NMaV-2 (lOpmol/μ L) 2 μ L，10XPCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (lOmM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(IU/ μ L) 0· 4 μ L，ddH20 8· 6μ L。扩增程序为94°C2min ；94°C 30s，52°C lmin，72°C lmin，30 次循环；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 产物大小500bp5. 5. 2水仙退化病毒cDNA 模板 1 μ L, Sprimer (lOpmol/μ L) 2 μ L, M4 (lOpmol/μ L) 2 μ L, IOXPCRBuffer2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (10mM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(IU/ μ L) 0· 4 μ L，ddH208· 6 μ L0扩增程序为94°C2min ；94°C 30s，47°C lmin，72°C 3min，30 次循环；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 产物大小156^3Ρ5. 5. 3水仙潜隐病毒cDNA 模板 IyL, pCar-1 (+) (lOpmol/μ L) 2 μ L, M4 (lOpmol/μ L) 2 μ L, 10XPCRBuffer 2 μ L，MgCl2 (25mM/L) 2 μ L, dNTP (10mM/L) 2 μ L, TaqDNA 聚合酶(IU/ μ L) 0· 4 μ L，ddH20 8· 6μ L。扩增程序为94°C2min ；94°C 30s，47°C lmin，72°C 3min,30 次循环；最后 72°C延伸 IOmin0PCR 产物大小1800bp5. 6PCR产物的检测PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳，观察PCR是否扩增出目标片段。阳性表明有病毒存在；阴性没检测到病毒。根据PCR检测结果可以看出=NMaV病毒特异性普带亮度明显减低，肉眼几乎难以分辨(参看图2)，并且未发现NCLV、NDV两种病毒的特异性普带(参看图3、4)。由此说明本发明方法灵敏度高，证实了脱毒结果的可靠性。6、脱毒种源的试管保存经检测已脱除病毒的试管鳞茎，转移到MS+BA lmg/L+NAA lmg/L+蔗糖40g/L+琼脂4g/L(pH5.8)脱毒种源保存培养基上进行试管保存。每1-2个月更换一次新培养基。20°C，湿度70%，8h/d光照条件下进行脱毒种源培养，光照强度为1500LX。将该试管保存的鳞茎再次种植栽培，生长迅速，鳞茎圆润，叶片未出现病毒侵染症状。从上述方法可以看出本发明通过利用医用抗病毒药物脱除崇明水仙病毒的方法能有效降低崇明水仙NMaV病毒含量，完全脱除携带的NCLV、NDV病毒。本发明对脱除崇明水仙的几种主要侵染病毒具有良好的效果。实施例2本实施例中脱毒培养基为MS+BA 5mg/L+NAA lmg/L+盐酸吗啉胍注射液(或片剂)10mg/L+利巴韦林注射液(或片剂)30mg/L (有效浓度)+蔗糖40g/L+琼脂4g/L(pH5. 8)，其余工艺步骤均同实施例1。经RT-PCR检测后，检测结果同实施例1近似，NMaV病毒特异性普带亮度明显减低，肉眼几乎难以分辨，而且未发现NCLV、NDV两种病毒的特异性普带。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
权利要求
1. 一种脱除崇明水仙病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤1)试管鳞茎的病毒脱除将增殖培养产生的崇明水仙鳞茎，选择直径< 0. 5cm的切分成单个鳞茎，接种在含抗病毒药剂的脱毒培养基上，20-250C，湿度70-80 %，8_10h/d、光照条件下进行脱毒培养，光照强度为1500-2000LX，其中，所述脱毒培养基包括MS基本培养基以及下述组分蔗糖琼脂6-苄氨基嘌呤萘乙酸抗病毒药剂40 g/L4g/L1-5 mg/L0.5-2 mg/L10-60 mg/L5.8-6.0。■检测材料，采用RT-PCR技术进pH2)病毒检测剪取脱毒处理后的崇明水仙试管球上的叶子作为病；行病毒检测；3)脱毒种源的试管保存将经检测病毒已脱除的脱毒种源转移到脱毒种源保存培养基上进行试管保存；每1-2个月更换一次新培养基，20-25C,湿度70 %，8-10h/d光照条件下进行保存培养，光照强度为 1500-2000LX。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗病毒药剂选自阿昔洛韦注射液或片剂、利巴韦林注射液或片剂、盐酸吗啉胍注射液或片剂中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱毒种源保存培养基包括:MS基本培养基以及下述组分琼脂4 g/L6-苄氨基嘌呤1-5 mg/L萘乙酸0.5-2 mg/L蔗糖30-60 g/L活性炭0-1.0 g/LpH5.8-6.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，崇明水仙试管鳞茎在进行病毒脱除前还需经外植体选择及消毒、诱导培养和增殖培养步骤。
全文摘要
本发明公开了一种脱除崇明水仙病毒的方法，包括试管鳞茎的病毒脱除、病毒检测，以及脱毒种源的试管保存。本发明首次在崇明水仙上运用医用抗病毒药物脱除病毒，操作简单，成本低，脱毒效果显著，并且对脱毒试管鳞茎提出了试管保存的方法，解决了脱毒种源的保存问题，既能保证脱毒种源的优良性状，又避免种源露地栽培后遭受病毒再次侵染，减少了反复脱毒带来的资源浪费。能在短时间内提供大批崇明水仙的脱毒种源，能用于快繁和工厂化生产，恢复了崇明水仙种源商品性和观赏性，提高了经济效益。
文档编号A01H4/00GK102550408SQ201110446929
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者张永春, 方丽华, 朱春美, 杨柳燕, 汤庚国, 许晓岗 申请人:上海市农业科学院