专利名称：一种杜鹃花无性系品种的育种方法
技术领域：
本发明涉及到林木育种技术领域，具体指利用现代生物技术(物理诱变)手段获得杜鹃花优良无性系品种即一种杜鹃花无性系品种的育种方法。
背景技术：
西洋杜醇(Rhododendron simsii Planch),简称西醇，又名比利时杜醇。西洋杜匿$ 是我国优良的观花植物，其品种多样，花色丰富，形态各异。鉴于杜鹃自身的生物学特性，它具有极高的观赏和园林应用价值。目前，国内外对杜鹃花良种的选育方法主要是对野生资源进行引种驯化，并与栽培品种进行杂交来选育新品种，但是这种方法较为复杂、获得优良品种的成功概率较低。随着现代生物技术的发展，使用组织培养技术、诱变技术、分子标记技术和转基因技术等新型育种技术培育新品种已经成为可能，但成功报道的例子甚少。自然界西洋杜鹃容易产生芽变，目前栽培中部分优良品种由自然芽变选择培育成功，但自然芽变概率较低，利用人工诱变可以大大提高西洋杜鹃的变异概率，是选育西洋杜鹃优良品种的良好途径，但是利用人工诱变育种西洋杜鹃的方法还鲜有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的状况，提供一种西洋杜鹃无性系品种选育的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种西洋杜鹃无性系品种选育的方法，主要采用人工物理诱变的方式，获得观赏价值高、开花期早的优良单株，该方法包括育种目标的确定、育种材料的选取、物理诱变剂量的选择、苗木的管理、变异单株的筛选、变异性状的分子鉴别等，具体包括下述步骤(I)育种目标的确定以抗病、较高的观赏价值(如不同的花型、花色，较长的开花期等)为主要育种目标；(2)育种材料的选取选择具有较高观赏价值的品种(系)、生长健壮且已进入开花盛期的植株为母株(一般秋季或春季母株的果实果皮变为褐色或黄褐色时便可采集；浙江省一般在早春蒴果开裂前采集)，从母株上采集种子后，选择饱满的、发育良好的种子，分为辐射处理组和对照组；具体为900 1000粒种子为一组，共分为6组，其中I组为对照 (不采用辐射处理)，5组用于辐照处理；(3)物理诱变剂量的选择通过预备试验，采用50、100、150、200、250Gy分别对五
组(一组对应一个剂量)用于辐照处理的种子进行6tlCo Y射线的急性辐射，以无辐射处理组为对照，剂量率为IOGy/min ；(4)种子的播种种子播种于25 30cm、高度20 25cm的塑料容器中，基质为泥炭和谷壳的混合物(体积比为6 4)，基质装盆(塑料容器)前用高压灭菌锅进行消毒，盆土量为800 1500g,基质含有有机质35 45g · kg4,碱解氮100 120mg · kg4,速效磷 80 95mg · kg \速效钟200 250mg · kg \ pH6. O 6· 5 ;基质上面平铺O. 8 I. 2厘米
4厚剪碎的苔藓，然后浇透水；将辐射处理和对照的种子均匀播种于苔藓上，每盆180 200 粒；容器苗置于连栋大棚内，大棚内的温度保持在20 25°C，种子萌芽期间大棚内的空气相对湿度保持90 95%，以促萌芽，种子萌发后降至65 75%，以减少病害；播种后土壤保持湿润，土壤相对湿度保持65 75% ;(5)苗木的管理播种后14 15天发芽，当小苗长至2 3叶时移植于小容器中， 选用无纺布网袋容器单株定植，容器直径为4 5cm,高度8 IOcm,基质同步骤⑷中基质；容器苗同样置于连栋大棚内，大棚内的温度保持在20 25°C，温度过高用遮阳网遮荫， 土壤相对湿度保持在65 75% ;根据苗木的生长状况第2年以后进行换盆，培育3 6年后植株开花；(6)变异单株的筛选在苗木生长期间，仔细观测不同处理的生物学、植物学性状，选择与对照(对照组)在抗性、植物生长势、花(花色、花型、花期等)方面有明显差异的单株；(7)变异性状的分子鉴别选择优良单株，采集该优良单株与对照组单株的幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取西洋杜鹃植物基因组DNA，利用SRAP标记技术进行变异基因分析；(8)优良单株的区域试验和推广通过生物学、植物学性状以及观赏特性的观测， 结合分子鉴别，获得优良单株；将该单株进行无性繁殖(如扦插、嫁接)，选择不同的区域进行试验，以明确其适种范围，并总结适合该单株的一整套栽培措施。步骤⑵中选取育种材料的品种如“皋月”、“白佳人”、“雪美人”、“紫云”等。步骤(4)中优选为所述的盆土量为lOOOg，基质含有有机质SSg^kg—1，碱解氮 IlOmg · kg_\ 速效磷 87mg · kg_\ 速效钾 237mg · kg-1, pH6. 3。步骤(7)中所述SRAP标记技术进行变异基因分析其西洋杜鹃花SRAP-PCR反应体系为20μ L PCR 反应体积中，MgCl2 I. 75mmol/L, dNTPsO. 175mmol/L, Taq 聚合酶 I. 5U，引物O. 2ymol/L，10XBuffer 2. O μ L，DNA基因组为I. 5Μ ;PCR扩增反应程序为反应前5个循环94°C预变性5min ;94°C变性lmin, 37。。复性lmin, 72。。延伸lmin, 5个循环反应；94°C 变性lmin，50°C复性lmin，72°C延伸lmin, 35个循环；最后72°C延伸IOmin0上述引物利用TGAGTCCAAACCGGATA、TGAGTCCAAACCGGAGC、TGAGTCCAAACCGGAAT、 TGAGTCCAAACCGGACC、TGAGTCCAAACCGGAAG、TGAGTCCAAACCGGTAA、TGAGTCCAAACCGGTCC、 TGAGTCCAAACCGGTGC、GACTGCGTACGAATTAAT、GACTGCGTACGAATTTGC、GACTGCGTACGAATTGAC、 GACTGCGTACGAATTTGA、GACTGCGTACGAATTAAC、GACTGCGTACGAATTGCA、GACTGCGTACGAATTCAA、 GACTGCGTACGAATTCTG、GACTGCGTACGAATTCGA、GACTGCGTACGAATTCAG、GACTGCGTACGAATTCCA 等 19条引物(共同使用)扩增出清晰的谱带且重复性较好。本发明的优点和有益效果I.本发明成功采用6tlCoY射线人工诱变，获得变异概率高、操作安全稳定的西洋杜鹃育种。2.本发明的西洋杜鹃育种方法，通过确定照射剂量、剂量率、照射后种子的播种环境条件控制、苗木的管理、筛选、变异性状的分子鉴别、优良单株的区域试验和推广等，得到一套完整的观赏价值高、开花期(提早5-15天)、性状优良(花色为白色、红白相间、红色等，重瓣，抗逆性高)的单株西洋杜鹃人工诱变育种方法，成功实现了西洋杜鹃人工诱变育种。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述(以“皋月”杜鹃品种诱变选育新品种为例)，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例实施例以“皋月”品种为例，“皋月”杜鹃原产日本，我国广为栽培，采用的“皋月” 杜鹃母本花冠鲜红色，阔漏斗形，花丝淡红色，利用人工诱变可以成功选育出在花色、花期等方面产生优良变异的单株。(I)育种目标的确定以较高的观赏价值(如不同的花型、花色、较早开花等)为主要育种目标；(2)育种材料的选取选择具有较高观赏价值的品种(系)、生长健壮且已进入开花盛期的植株为母株，一般秋季或春季母株的果实果皮变为褐色或黄褐色时便可采集；浙江省一般在早春蒴果开裂前采集，种子采集后选择饱满的发育良好的种子，约1000粒为一组，分为6组，其中I组为对照，5组用于辐照处理；(3)物理诱变剂量的选择通过预备试验，采用50、100、150、200、250Gy的6ciCo Y 射线进行急性辐照，以无辐射处理为对照，剂量率为10Gy/min ；(4)种子的播种种子播种于直径25cm、高度25cm的塑料容器中，基质为泥炭和谷壳的混合物(体积比为6 4)，基质装盆前用高压灭菌锅进行消毒，盆土量IOOOg左右， 有机质 38g · kg-1,碱解氮 IlOmg · kg-1,速效磷 87mg · kg-1,速效钾 237mg · kg-1, pH6. 3,上面平铺厚度为I厘米左右的的剪碎的苔藓，基质浇透水。将诱变处理组和对照组的种子均匀播种于苔藓上，每盆200粒左右；容器苗置于连栋大棚内，大棚内的温度一般保持20°C左右，种子萌芽期间大棚内的空气相对湿度保持90%左右，以促萌芽；种子萌发后降至70% 左右，以减少病害，播种后土壤保持湿润，土壤相对湿度保持70%左右；(5)苗木的管理播种后15天左右发芽，当小苗长至2 3叶时移植于小容器中， 选用无纺布网袋容器单株定植，其直径为4. 5cm，高度10cm，基质同步骤(4);容器苗同样置于连栋大棚内，一大棚内的温度一般保持20-25 V，温度过高用遮阳网遮荫，土壤相对湿度保持70%左右。根据苗木的生长状况第2年以后进行换盆，一般培育4年后植株开花；(6)变异单株的筛选在苗木生长期间，仔细观测不同处理的生物学、植物学性状，选择与对照在抗性、植物生长势、花(花色、花型、花期等)等方面有明显差异的单株；(7)变异性状的分子鉴别选择优良单株，采集该优良单株与对照组单株的幼嫩叶片，利用SRAP标记技术进行变异基因分析；西洋杜鹃花最优SRAP-PCR反应体系为 20 μ LPCR 反应体积中，MgCl2 I. 75mmol/L, dNTPsO. 175mmol/L, Taq 聚合酶 I. 5U,引物 O. 2 μ mol/L, IOXBuffer 2. O μ L ；PCR扩增反应程序为反应前5个循环94°C预变性5min ;94°C变性lmin，37°C复性 lmin，72°C延伸lmin，5个循环反应；94°C变性lmin，50°C复性lmin，72°C延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸IOmin0引物采用TGAGTCCAAACCGGATA、TGAGTCCAAACCGGAGC、TGAGTCCAAACCGGAAT、 TGAGTCCAAACCGGACC、TGAGTCCAAACCGGAAG、TGAGTCCAAACCGGTAA、TGAGTCCAAACCGGTCC、TGAGTCCAAACCGGTGC、GACTGCGTACGAATTAAT、GACTGCGTACGAATTTGC、GACTGCGTACGAATTGAC、 GACTGCGTACGAATTTGA、GACTGCGTACGAATTAAC、GACTGCGTACGAATTGCA、GACTGCGTACGAATTCAA、 GACTGCGTACGAATTCTG、GACTGCGTACGAATTCGA、GACTGCGTACGAATTCAG、GACTGCGTACGAATTCCA 等 19条引物扩增出清晰的谱带且重复性较好。(8)优良单株的区域试验和推广通过生物学、植物学性状以及观赏特性的观测， 结合分子鉴别，获得一开花期(提早15天左右)、花瓣呈白但花瓣先端呈鲜红色的双色优良单株；将该单株进行无性繁殖(如扦插、嫁接)，选择不同的区域进行试验，以明确其适种范围，并总结适合该单株的一整套栽培措施。
权利要求
1.一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于通过人工物理诱变的方式，获得观赏价值高、开花期早的杜鹃花优良单株。
2.根据权利要求I所述的一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于该育种方法具体步骤包括(1)育种目标的确定以抗病、较高的观赏价值为主要育种目标；(2)育种材料的选取选择具有较高观赏价值的品种、生长健壮且已进入开花盛期的植株为母株；从母株上采集种子后，选择饱满的、发育良好的种子，分为辐射处理组和对照组，具体为900 1000粒种子为一组，共分为6组，其中I组为对照，5组用于辐照处理；(3)物理诱变剂量的选择通过预备试验，采用50、100、150、200、250Gy分别对五组用于辐照处理的种子进行6tlCo Y射线的急性辐射，以无辐射处理组为对照，剂量率为IOGy/ min ；(4)种子的播种种子播种于25 30cm、高度20 25cm的塑料容器中，基质为体积比为6 4的泥炭和谷壳的混合物，基质装盆即塑料容器前用高压灭菌锅进行消毒，盆土量为800 1500g,基质含有有机质35 45g · kg4,碱解氮100 120mg · kg4,速效磷80 95mg · kg S速效钟200 250mg · kg S pH6. O 6· 5 ;基质上面平铺O. 8 I. 2厘米厚剪碎的苔藓，然后浇透水；将辐射处理和对照的种子均匀播种于苔藓上，每盆180 200粒；容器苗置于连栋大棚内，大棚内的温度保持在20 25°C，种子萌芽期间大棚内的空气相对湿度保持90 95%，以促萌芽，种子萌发后降至65 75%，以减少病害；播种后土壤保持湿润，土壤相对湿度保持65 75% ;(5)苗木的管理播种后14 15天发芽，当小苗长至2 3叶时移植于小容器中，选用无纺布网袋容器单株定植，容器直径为4 5cm,高度8 IOcm,基质同步骤⑷中基质； 容器苗同样置于连栋大棚内，大棚内的温度保持在20 25°C，土壤相对湿度保持在65 75% ;根据苗木的生长状况第2年以后进行换盆，培育3 6年后植株开花；(6)变异单株的筛选在苗木生长期间，仔细观测不同处理的生物学、植物学性状，选择与对照在抗性、植物生长势、花方面有明显差异的单株；(7)变异性状的分子鉴别选择优良单株，采集该优良单株与对照组单株的幼嫩叶片， 采用改良的CTAB法提取西洋杜鹃植物基因组DNA，利用SRAP标记技术进行变异基因分析；(8)优良单株的区域试验和推广通过生物学、植物学性状以及观赏特性的观测，结合分子鉴别，获得优良单株；将该单株进行无性繁殖，选择不同的区域进行试验，以明确其适种范围，并总结适合该单株的一整套栽培措施。
3.根据权利要求2所述的一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于步骤(2) 中选取育种材料的品种为“皋月”、“白佳人”、“雪美人”、“紫云”中的一种。
4.根据权利要求2所述的一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于步骤(2) 中母株上种子的采集以秋季或春季母株的果实果皮变为褐色或黄褐色时采集。
5.根据权利要求2所述的一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于步骤(4) 所述的盆土量为IOOOg,基质含有有机质38g kg—1,碱解氮IlOmg kg—1,速效磷87mg · kg-1, 速效钾 237mg · kg-1, pH 6· 3。
6.根据权利要求2所述的一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于步骤(7) 中所述SRAP标记技术进行变异基因分析其西洋杜鹃花SRAP-PCR反应体系为20 μ L PCR反应体积中，MgCl2 I. 75mmol/L, dNTPsO. 175mmol/L, Taq 聚合酶 I. 5U,引物 O. 2ymol/L, IOXBuffer 2. O μ L，DNA 基因组为 I. 5Μ。
7.根据权利要求6所述的一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于所述的PCR 扩增反应程序为反应前5个循环94°C预变性5min ;94°C变性lmin，37°C复性lmin，72°C 延伸lmin, 5个循环反应；94°C变性lmin,50°C复性lmin,72°C延伸Imin, 35个循环；最后 72°C延伸 IOmin0
8.根据权利要求6所述的一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于所述的引物为 TGAGTCCAAACCGGATA、TGAGTCCAAACCGGAGC、TGAGTCCAAACCGGAAT、TGAGTCCAAACCGGACC、 TGAGTCCAAACCGGAAG、TGAGTCCAAACCGGTAA、TGAGTCCAAACCGGTCC、TGAGTCCAAACCGGTGC、 GACTGCGTACGAATTAAT、GACTGCGTACGAATTTGC、GACTGCGTACGAATTGAC、GACTGCGTACGAATTTGA、 GACTGCGTACGAATTAAC、GACTGCGTACGAATTGCA、GACTGCGTACGAATTCAA、GACTGCGTACGAATTCTG、 GACTGCGTACGAATTCGA、GACTGCGTACGAATTCAG、GACTGCGTACGAATTCCA 共 19 条引物。
全文摘要
本发明公开一种杜鹃花无性系品种的育种方法，其特征在于通过人工物理诱变的方式，获得观赏价值高、开花期早的杜鹃花优良单株；具体为育种目标确定→采集饱满成熟的种子→物理诱变剂量50-250Gy的60Coγ射线、剂量率为10Gy/min→种子播种→3～6年苗木培育→单株选择生物学、植物学性状、观赏特性的观测等方面选择→变异性状的基因分析→优良单株区域试验→栽培措施总结→推广。本发明方法获得的优良单株一般开花期可以提早5～15天，花色为白色、红白相间、红色等，重瓣，抗逆性高。
文档编号A01H1/06GK102577937SQ201210004689
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴月燕, 李波, 王忠华 申请人:浙江万里学院