专利名称：甜樱桃PaAP1基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及甜樱桃PaAPl基因及其应用。
背景技术：
开花是植物从营养生长到生殖生长的一个重要转折点，研究表明MASDSbox基因从5个阶段参与花发育过程的调节(Gunter et al. , 2000 ；Okada and Shimura, 1994)。其中 API (APETALA1)同源基因在开花诱导和花器官的形成过程中均起着至关重要的作用[Coen and Meyerowttz, 1991 ；Bowman et al. , 1993 ；Jofuku et al. ,1994]。目前，研究人员已从甜橙、黄金梨、苹果、枇杷、桃、枣、葡萄、美洲山杨、香脂杨和柳树和蓝桉等十多种木本植物中分离克隆了 APl同源基因全长cDNA。吕晋慧等(2007)将APl同源基因转入地被菊‘玉人面'品种中，能使菊花提早开花。2001年，Pena等将APl和LFY同源基因导入柑橘，得到的转基因柑桔当年开花、果实正常，其种子于当年播种，第二年春天即开花结果。Nobuhiro 等(2002)把苹果的MdMADS5基因(API同源基因)导入到拟南芥中，能使转基因拟南芥提早开花。另外，将拟南芥的花分生组织决定基因(例如LFY，APl和FT等)导入欧洲山杨和枳橙，同样也能使转基因植物提早开花[Weigel and Nilsson, 1995 ；Rottmann et al. , 2000 ； Endo et al. , 2005 ;B01enius et al. ,2006]。甜樱桃在都市农业发展中占有重要的地位，因其具有较高的收益而在近年发展迅速，但是樱桃树体高大、进入结果期较晚，常规管理需要3-4年才能开花结果，5-7年才能进入盛果期。选育幼龄期短开花早的甜樱桃品种一直是重要的育种方向[万仁先，毕可华主编，现代大樱桃栽培，1992，中国农业科技出版社]。红蜜是国内自主培育的樱桃品种，3-4 年就可开花，具有幼龄期短和丰产的特点。从红蜜中克隆APl的同源基因，预期提供一个具有促进樱桃或其它植物早开花的基因资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种与甜樱桃幼龄期相关的基因，以便通过该基因或其衍生物筛选或改良甜樱桃(甚至其它植物)，获得幼龄期短开花早的品种。本发明还涉及所述基因的一些衍生物及一些相关的应用。具体来讲涉及以下内容甜樱桃PaAPl基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 12所示。甜樱桃PaAPl基因，其编码的氨基酸的序列如SEQ ID NO : 12所示。由于密码子简并性，会涉及多条序列。初始获得的基因是如SEQ ID N0:11所不的序列。重组了所述的甜樱桃PaAPl基因的重组载体。转化了所述重组载体的转化体。将所述甜樱桃PaAPl基因转化拟南芥或甜樱桃使其早开花的应用。甜樱桃的转化在品种或砧木都可以。所述蛋白的应用，涉及利用该蛋白筛选早开花的拟南芥或甜樱桃。
所述的甜樱桃PaAPl基因的应用，涉及利用该基因筛选早开花的拟南芥或甜樱桃。所述的甜樱桃PaAPl基因对拟南芥和甜樱桃的开花期有显著影响，可以通过该基因或其衍生物筛选或改良甜樱桃及其砧木(甚至其它植物)，获得幼龄期短开花早的品种。
图I为PaAPl编码区扩增结果；图2为樱桃PaAPl蛋白属于MADS蛋白家族的分析；图3为樱桃PaAPl蛋白和部分同源蛋白序列的进化树分析结果；图4表示PaAPl基因在不同时期花芽及不同组织中的表达；其中中2、34、27、40、 38、37、42为花芽，分别在6月10日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、 9月9日采取。19、33、41、39、21、17、32、29为叶芽，分别在6月3日、6月16日、6月29日、 7月10日、7月22日、8月4日、8月20日、9月9日采取。HB :花瓣，HE :花萼，leaf =Bf, steam :莖，XR :雄蕊，ZT :柱头。以上样品在图4的横坐标中按照以上顺序排列。图5表示PaAPl表达载体；
图6为TO代转基因株系PCR鉴定结果；其中，泳道I :野生型；泳道2-5 :转基因株系；泳道6 :阴性对照；泳道7-12 :转基因株系；
图7为转基因株系(右)和野生型(左)的GFP表达情况
图8为拟南芥转基因株系；
图9为拟南芥野生型；
图10为Tl代转基因拟南芥早开花的情况，Tl代转基因拟南芥(左)2片真叶出现花序分离，同时期的野生型(右)8片真叶尚未开花；
图11为转基因株系Tl代的PaAPl表达分离结果。
具体实施例方式下面具体说明如SEQ ID NO=Il所示的甜樱桃PaAPl基因的制得过程及其一些应用。一、如SEQ ID NO 11所示的甜樱桃PaAPl基因的制得(为了更好地理解本发明， 文中附带了一些对该基因的分析)I.材料和方法I. I 材料6月10日、6月16日、6月29日、7月10日、7月22日、8月4日、9月9日采取分别取红蜜花芽和叶芽。枝条基部饱满的芽为花芽，枝条上半部的形态较尖芽为叶芽。4月9 日收集花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊及未展开花的子房和柱头，立即放在_80°C冰箱保存。I. 2 方法I. 2. IRNA 的提取用艾德莱生物公司的植物RNA提取试剂盒，按照说明书进行RNA的提取，I %琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性和浓度。I. 2. 2RT-PCR反应中第一链cDNA的合成
将总RNA, I μ I oligo (dT) 15primer, I μ I IOmM dNTP,和 dd H2O 按总体积 13 μ I 在冰浴中混勻，65°C加热变性5min后,冰浴中迅速冷却lmin。依次加入4μ1 5Xreaction buffer,I μ I RNAsin(Promega), I μ I O.IM DTT,I μ I Superscript IIIrt 逆转录酶 (Invitrogen)，混匀，50°C温育60min后，70°C 15min灭活，冰上冷却，产物直接用于RT-PCR。I. 2. 3PaAPl编码区引物设计及全长序列获得根据NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)数据库中已释放的楼花 APl 序列(GQ267074) 设计全长引物AP1-7F和AP1-7R(表1，也可见序列表SEQ ID NO :1和2)，利用花瓣cDNA 做模板进行PCR。反应体系为在20 μ I反应体系中，模板20ng, IOXreaction buffer
2μ I, I. 5mM Mg2+，dNTP 0. 25mM, Primer 0. 2 μ M, Taq 酶 lu，ddH20 8 μ I。PCR 反应程序为 94°C 2min，35 个循环(94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2min) ,72°C IOmin 延伸。PCR 产物在 I %琼脂糖凝胶电泳分离后，将特异扩增片段回收。I. 2. 4PCR产物的克隆、测序与序列分析将回收PCR产物与pMD-T载体连接，转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定，将插入片段正确的8个阳性克隆提取质粒，用Beckman CEQ8000测序仪测序。将测得的序列用DNAMAN， DNAstar，MEGA4等软件分析，与已注册的其它植物APl基因进行同源性比较。I. 2. 5荧光实时定量表达分析1.2. 5. I引物设计和验证根据克隆得到的PaAPl,和NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)数据库中已释放的楼桃 ACTIN(FJ560908)序列设计引物 APl-F-QU APl-R-Ql、ACT-F-Ql、ACT-R-Ql (表 1，也可见序列表SEQ ID NO :3-6)，用于PaAPl荧光实时定量表达分析。利用红蜜6月16花芽cDNA 为模板检测引物的特异性和最适退火温度。结果显示阴性对照的C(t)值接近于40，而且 API-F-QI/API-R-QI和ACT-F-QI/ACT-R-QI只有单峰没有杂峰出现，说明可以用于荧光实时定量表达分析，API-F-QI/API-R-QI最适退火延伸温度是55°C。I. 2. 5. 2反应体系、程序及分析IOul 反应体系中包括 IOng cDNA, 5ul Ssofast Evagreen suppermix (伯乐公司)，200nM引物。反应程序为94°C 5min，40个循环(94°C 5sec，55/57°C 5sec)，溶解曲线 65°C -95°C 5sec(+0. 5°C / 循环)。分析在 CFX96Real_Time system(伯乐)仪器上进行。 每个反应设三个重复，每个引物设三个不加模板的阴性对照。当阴性对照检测不到扩增产物而且样品三个重复的C(t)之间的标准差小于O. 5时数据可用，用Bio-Rad CFX Manager 软件进行数据分析及出柱状图。表I引物序列
权利要求
1.甜樱桃PaAPl基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0:12所示。
2.甜樱桃PaAPl基因，其特征在于，其编码的氨基酸的序列如SEQID N0:12所示。
3.根据权利要求2所述的甜樱桃PaAPl基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO: 11所示。
4.重组了权利要求2或3所述的甜樱桃PaAPl基因的重组载体。
5.转化了权利要求4所述的重组载体的转化体。
6.权利要求2或3所述的甜樱桃PaAPl基因的应用，其特征在于，将所述甜樱桃PaAPl 基因转化拟南芥或甜樱桃，使其早开花。
7.权利要求I所述的蛋白的应用，其特征在于，利用该蛋白筛选早开花的拟南芥或甜樱桃。
8.权利要求2或3所述的甜樱桃PaAPl基因的应用，其特征在于，利用该基因筛选早开花的拟南芥或甜樱桃。
全文摘要
本发明涉及如SEQ ID NO11所示的甜樱桃PaAP1基因及其在提早花期方面的用途。所述的甜樱桃PaAP1基因对拟南芥和甜樱桃的开花期有显著影响，可以通过该基因或其衍生物筛选或改良甜樱桃及其砧木(甚至其它植物)，获得幼龄期短开花早的品种。
文档编号A01H5/00GK102584969SQ20121000988
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者周宇, 张开春, 张晓明, 王晶, 闫国华 申请人:北京市农林科学院