专利名称：一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法
技术领域：
本发明涉及获得兰科植物种子萌发有效共生真菌的方法，具体来说涉及一种在兜唇石斛(Dendrobium aphyllum)原生地诱导种子萌发,获得原球莖,再从原球莖中分离、培养和筛选出对种子萌发有效共生真菌的方法。
背景技术：
兰科植物的种子非常细小，仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行濒危种类野外回归时，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。通过种子和其有效萌发真菌在自然条件下的共生萌发能很好的解决这ー问题。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生植株的根中分离。但由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐。同时，不同兰科植物根中的真菌与种子萌发阶段的有效共生真菌是否相同目前仍不确定。因此，获得种子萌发的有效共生真菌是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，为实现兜唇石斛的野外回归创造条件。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。本发明的技术方案主要是基于以下认识。我们将兜唇石斛的种子放入特制的种子袋中，并将种子袋放置在有兜唇石斛植株生长的原生地，诱导种子萌发产生原球茎，将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人エ培养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落，并进行真菌的分子鉴定和保存。将获得的真菌和兜唇石斛的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真菌对兜唇石斛的种子萌发的有效性，结果表明所获得的真菌是兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌，从而实现了本发明的目的。一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下步骤(I)在兜唇石斛花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后置于无菌的密闭玻璃容器中在-20°C条件下保存，待用；(2)用灭菌的镊子将100 200粒兜唇石斛的种子播种在尼龙网布上，将播好种子的尼龙网布对折，用热封机将三边封起来，制作完成种子袋，在种子袋边缘缝上标签，便于监测和回收； (3)选择有兜唇石斛成年植株自然生长的不同地点，将种子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的树干上，在种子袋上面覆盖ー层苔藓保湿；
种子袋放置时应 尽量靠近成年植株根部，并使种子袋呈水平状态，避免种子在重力作用下聚集成团。(4)每个月定期从各放置点回收2 3个种子袋，检查种子袋内种子的萌发情况，当发现有原球茎时，回收所有的种子袋；(5)将回收的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基PDA上进行培养；(6)原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3 5次后，得到纯菌落；(7)将兜唇石斛的种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在配制好的燕麦琼脂培养基(OMA)的培养皿表面放置两张无菌滤纸，分别吸取150微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在培养基中心接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理10个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养;(8)每周观察I次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌。上述步骤中，所述的种子袋采用网孔为45 μ m的尼龙网布。这样的网孔大小既可以保持种子不掉出，又可以使水和真菌的菌丝自由穿过，热封机封口时应避免损伤种子。步骤(3)中所述的种子袋放置点为同时有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗处。步骤(4)回收后的种子袋用自来水轻轻冲洗掉附着物及泥土，将清洗后的种子袋放在两层面巾纸中间，轻轻按压使面巾纸吸干种子袋多余的水分，用剪刀小心的剪开封口，打开种子袋放在解剖镜下观察种子萌发情况。步骤(5)所述的次氯酸钠溶液有效氯离子浓度为1%，消毒3 5分钟，无菌水冲洗3 4次；本步骤同时设置对照处理，用同一来源的原球茎表面灭菌后不切开直接置于PDA培养基中，若对照组培养基内未长出真菌，说明从实验组原球茎切口周围长出的真菌为原球茎的内生共生真菌。培养皿用封口膜封好后放入人工气候箱内，25 ± 2 °C黑暗培养。步骤(7)所述的150微升的悬浮液约含150粒兜唇石斛种子，所述的培养条件为光照强度为 2000Lx-3000Lx，温度 25°C ±2°C，光周期 12h/12hL/D。步骤(8)所述的种子萌发和原球莖发育情况参照Stewart & Zettler (2002)的方法对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，分为5个阶段阶段O描述为种胚透明，种皮完好，种子未萌发，阶段I描述为种胚吸水膨胀；阶段2描述为种胚继续膨大，突破种皮，视为萌发；阶段3描述为出现原生分生组织；阶段4描述为长出第一片叶片；阶段5描述为第一片叶片继续生长，变长。Stewart SL,Zettler Lff(2002)Symbiotic germination of three semi-aquaticrein orchids (Habenaria repens, H. quinqueseta, H. macroceratitis) from Florida.(佛罗里达三种半水生玉凤花属植物(Habenaria repens, H. quinqueseta, H. macroceratitis)的种子共生萌发)Aquatic Botany (水生植物学)，72，25-35。对所获得的兜唇石斛种子萌发有效共生真菌进行分子鉴定和比对，其为胶膜菌属(Tulasenlla)真菌,且与美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登录号为⑶166410. I的真菌Tulasenlla calospora最为相似,最大相似度达到99%，对其编号为FDaI7，采用试管斜面法保存于中国科学院西双版纳热带植物园。所述的分子鉴定中，采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用引物为ITSl和ITS4 ;PCR扩增产物为上海生エ生物工程有限公司进行测序。本发明相对于现有技术具有以下优点虽然国内外都有专利和文献报道有关兰科植物种子萌发有效共生真菌的分离方法，但这些方法多采用从兰科植物野生植株的根中分离真菌。由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效共生真菌的筛选和分离工作异常复杂和繁琐。同时，不同兰科植物根中的真菌与种子萌发阶段的 有效共生真菌是否相同并不确定，要获得种子萌发有效共生真菌非常困难。对兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的分离尚无报道。本发明的方法直接从兜唇石斛种子原地共生萌发的原球茎中分离真菌，操作简单，获得的真菌种类单一，不需要大量繁琐的筛选过程，分离到的ー种胶膜菌属真菌通过和种子的共生萌发实验，证明是兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌，从而为利用兜唇石斛种子和真菌共生萌发来培育种苗开辟了一条新的途径。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进ー步地详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限制。所有基于本发明教导所作的变换，均应属于本发明的保护范围。实施例I :兜唇石斛开花时选取健壮的植株进行人工异交授粉，授粉后约180天果实成熟，采收已成熟但果荚尚未裂开的果实，表面用75%的酒精消毒并用无菌水清洗后用无菌刀片切开果实，将种子置于盛有硅胶的干燥器内干燥24小时后，于无菌的密闭玻璃小瓶内保存于-20°C中。用灭菌的镊子将100-200粒兜唇石斛的种子均匀播种在6cmX9cm，网孔为45 y m的尼龙网布上，将播好种子的尼龙网布对折，用热封机将三边封起来，制作完成一个种子袋，在种子袋边缘缝上塑料标签，便于监测和回收。选取中国科学院西双版纳热带植物园内4个种子袋放置点和西双版纳国家级自然保护区绿石林森林公园3个种子袋放置点，共计7个种子袋放置点。这些选取的放置点都有兜唇石斛自然生长的成年植株，且植株生长状况良好，能正常开花结实。每个放置点各放置30个种子袋，共计210个种子袋，种子袋进行编号。将种子袋放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的树干上，用尼龙线固定，在种子袋上面覆盖ー层苔藓，以起到保湿的作用。放置时种子袋尽量靠近成年植株根部，使种子袋呈水平状态，避免种子在重力作用下聚集成团。种子袋放置两个月后，每个月从不同放置点各回收2-3个种子袋，回收后的种子袋用自来水轻轻冲洗掉附着物及泥土，将清洗后的种子袋放在两层面巾纸中间，轻轻按压使面巾纸吸干种子袋多余的水分，用剪刀小心的剪开封ロ，打开种子袋放在解剖镜下观察种子萌发情況。当发现有原球茎时，于2011年8月20日回收所有剰余的种子袋。从4个放置点共获得55粒原球茎，其余3个放置点种子袋内没有原球茎或种子袋破损。将原球茎用自来水冲洗后，在超净工作台中放入盛有有效氯离子浓度为1%的次氯酸钠溶液的烧杯中，轻轻摇动烧杯3-5分钟后，用无菌钝头镊子取出，再用无菌水冲洗3-4次。用无菌刀片将每个原球茎切成两半，切口面贴于准备好的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上进行培养。同时将2个表面消毒的原球莖不切开直接置于PDA培养基中，作为对照。培养皿用封口膜封好后放入人工气候箱内，25±2°C黑暗培养。培养7天后，未切开的原球茎周围未长出菌丝，而切开的原球茎周围长出白色菌丝，由此可以确定为兜唇石斛原球茎的内生真菌。原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3-5次后，得纯菌落。将保存的兜唇石斛种子从-20°C中取出，置于室温下过夜使种子回复室温。用有效氯离子浓度为I %的次氯酸钠溶液对种子进行灭菌并用无菌水漂洗3-4次后，将种子放入无菌水中制成均勻的悬浮液。在配制好的燕麦琼脂培养基(OMA)的培养皿表面放置两张
I.5cmX4cm大小无菌滤纸,分别吸取150微升种子悬浮液(约150粒)均勻的散布在两张滤纸条上。在培养基中心接种约O. 5cm3 (IcmX lcmXO. 5cm)含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理10个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养培养条件为光照强度为2000Lx-3000Lx，温度25°C ±2°C，光周期12h/12h L/Dο培养5周后，只有接种FDaI7菌株处理的种子萌发达到阶段2及后续阶段，达到阶段2及后续阶段的种子比率为48. 79%,而接种FCb4菌株、FDaI2菌株及未接菌对照组只有吸水膨胀达到阶段I的种子，未形成原球茎，说明FDaI7为兜唇石斛种子萌发的有效共生真
菌。 对所获得的FDaI 7菌株进行分子鉴定和比对，其为胶膜菌属(Tulasenlla)真菌，且与美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登录号为⑶166410. I的真菌Tulasenlla calospora最为相似,最大相似度达到99%。对此菌株采用试管斜面法保存于中国科学院西双版纳热带植物园。
权利要求
1.一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下步骤 (1)在兜唇石斛花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后置于无菌的密闭玻璃容器中在-20°C条件下保存，待用； (2)用灭菌的镊子将100 200粒兜唇石斛的种子播种在尼龙网布上，将播好种子的尼龙网布对折，用热封机将三边封起来，制作完成种子袋，在种子袋边缘缝上标签，便于监测和回收； (3)选择有兜唇石斛成年植株自然生长的不同地点，将种子袋固定放置在靠近兜唇石斛成年植株根部附近的树干上，在种子袋上面覆盖一层苔藓保湿； (4)每个月定期从各放置点回收2 3个种子袋，检查种子袋内种子的萌发情况，当发现有原球茎时，回收所有的种子袋； (5)将回收的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基PDA上进行培养； (6)原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的PDA培养基上，转移3 5次后，得到纯菌落； (7)将兜唇石斛的种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在配制好的燕麦琼脂培养基的培养皿表面放置两张无菌滤纸，分别吸取150微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在培养基中心接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理10个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养； (8)每周观察I次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌。
2.根据权利要求I所述的获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于所述的所述的种子袋采用网孔为45 μ m的尼龙网布。
3.根据权利要求I所述的获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于步骤(3)中，种子袋放置时应尽量靠近成年植株根部，并使种子袋呈水平状态。
4.根据权利要求I所述的获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于步骤(3)中所述的种子袋放置点为同时有兜唇石斛成年植株和自然更新的幼苗处。
5.根据权利要求I所述的获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于步骤(5)所述的次氯酸钠溶液有效氯离子浓度为I %，消毒3 5分钟，无菌水冲洗3 4次。
6.根据权利要求I所述的获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于步骤(7)所述的培养条件为光照强度为2000Lx-3000Lx，温度25°C ±2°C，光周期12h/12hL/D。
全文摘要
本发明公开了一种获得兜唇石斛种子萌发有效共生真菌的方法。将兜唇石斛母株通过人工异交授粉后得到成熟的种子，把种子放入特制的种子袋中，将种子袋放置在有兜唇石斛植株生长的原生地，在自然条件下诱导种子萌发产生原球茎；将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人工培养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落；将获得的真菌和兜唇石斛的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真菌对兜唇石斛的种子萌发的有效性，筛选出兜唇石斛种子萌发的有效共生真菌，并进行真菌的分子鉴定和保存。本发明为利用兜唇石斛种子和真菌共生萌发来培育种苗开辟了一条新的途径。
文档编号A01C1/04GK102612966SQ20121009750
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者林华, 盛春玲, 范旭丽, 高江云 申请人:中国科学院西双版纳热带植物园