专利名称：一种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明属于饲料领域，尤其涉及饲料添加剂。
背景技术：
现代畜禽养殖过程中，为了预防和治疗动物疾病，常使用过量抗生素产品来确保动物健康，但过量抗生素的使用常导致动物肉制品及其产物的品质下降和抗生素耐性增强，通过食物链的传递导致人类健康也受到抗生素问题的严重影响。源自自然界的一些天然物质不仅具有良好的营养特性，同时还具有抗病毒、消炎、抗氧化、调节机体免疫功能等作用，具有广阔的应用前景。蜂胶的主要成分是黄酮类化合物、酚类、内酯、香豆精类、醛酮，少量的铁、钙、硅、锰、铅、镍、铝、铜、锌等微量元素及维生素B族、维生素A，以及多种氨基酸、酶、多糖类及丰富的阿散酸等。蜂胶还是国内外专家公认的“天然抗生物质”，因为它不仅具有防御外来的入侵者及感染病原菌扩散的作用，还具有抗病毒、消炎、抗氧化、调节机体免疫功能等作用。女贞子又称女贞实、冬青子、白蜡树子、鼠梓子。外果皮薄，中果皮较松软，易剥离，内果皮木质，黄棕色，具纵棱，破开后种子通常为I粒，肾形，紫黑色，油性。无臭，味甘、微苦涩。女贞子果实含齐墩果酸(OleanoliC acid)、甘露醇、葡萄糖、棕榈酸、硬脂酸、油酸及亚麻酸。果皮含熊果酸(Ursolic acid)、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸(Acetyloleanolic acid)。种子含脂肪油14. 9%,油中棕榈酸与硬脂酸为19. 5%、油酸及亚麻酸等为80. 5%。女贞子中尚含铜、锌、铁、猛等微量元素。女贞子补肝肾阴，乌须明目，现代医学研究认为女贞子可以抑制幽门螺杆菌的作用可以治疗胃病，还具有抑制嘌呤异常代谢用于痛风和高尿酸血症的治疗。用于肝肾阴虚，腰酸耳鸣，须发早白；眼目昏暗，视物昏暗；阴虚发热，胃病及痛风和和高尿酸血症。女贞子是一味临床常用中草药，近几年已经开始研究其作为饲料添加剂在畜禽生产中的作用。抗菌肽是一类具有抗菌活性的生物小肽，是动物天然免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽的理化性质稳定，相对分子质量小，抗菌谱广，抗菌机制独特。与传统抗生素相比，具有抗菌活性强、无耐药性、无残留和毒性小的优点。近年来，抗菌肽作为抗生素的理想替代品一直是研究的热点。据报道，抗菌肽作为添加剂饲喂动物，具有提高免疫性能、减少疾病的发生和提高成活率的作用。同时，抗菌肽对动物有良好的促生长作用，可提高动物的生长性能，降低料肉比。因此，抗菌肽具有成为绿色安全饲料添加剂的潜力。灵芝[Ganoderemalucidum(Leyss ex Fr. ) karst],又称灵芝草，属担子菌亚门、多孔菌目、灵芝科、灵芝属。历代的医典把灵芝归位于“上上药”，其排位在人参之前。《神农本草经》、《本草纲目》记载，灵芝可明目、补肝气、安神、益精、益心气、益脾气、益肺气、益肾气、通九窍、耳聪、目明、利关节、利尿、养颜美容，是上好的滋补佳品。灵芝多糖能促进蛋白质、核酸的合成，对血清、肝脏及骨髓细胞蛋白质或核酸的更新、合成有促进作用，它是灵芝扶正固本的主要有效成分之一。灵芝多糖主要存在于灵芝真菌子实体、菌核、菌丝体或发酵液中；存在于灵芝中的灵芝酸有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、毒杀肿瘤细胞的功用，是灵芝的主要有效成分之一。如何有效开发以天然植物或真菌获得绿色饲料添加剂产品对饲料添加剂行业发
展具有重要意义。
发明内容
本发明提供具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂； 复合饲料添加剂组成如下抗菌肽10-15%，蜂胶10-20%，女贞子萃取物10_25%，枯草芽孢杆菌冻干菌粉15-30%，灵芝菌固体发酵培养物40-70%;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为、CGMCC6012，上述比例为质量百分比。灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下斜面菌种活化培养将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上，22_28°C培养96-120小时左右，至菌丝长满斜面即可；最佳培养温度25°C。I.液体一级种子培养将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件旋转式摇床80-180转/分，22-28°C培养96-130小时左右；旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25°C为宜。2.液体二级种子培养将一级摇瓶种子以5-20%接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件旋转式摇床80-180转/分，22-28°C培养96-130小时左右；合适接种量为10%，旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25°C为宜。3.固体发酵培养将二级摇瓶种子以5-10%接种量接入装有灭菌后固体发酵培养基的500L固体发酵罐中，培养条件装料量50%，培养温度20-27 °C，湿度75_90%，通风量O. 3-1. O (V/V)，培养时间15-40天。每隔3-10天开启搅拌10分钟。采用SGF固体发酵罐。4.发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7%以下。对固体发酵物料进行粉碎。本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯(粉碎后)等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉等；需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。在上述固体发酵培养基中添加有质量比为2-6%粉碎后，过40-50目的当归、3_8%的粉碎后，过40-50目的板蓝根，2-5%粉碎后，过40-50目的麝香草。所述女贞子萃取物制备方法如下女贞子粉碎，过40-50目筛后，添加女贞子3-6倍重量无水乙醇浸溃提取，控制温度30-45°C，2-4小时后调整温度为55-60°C 1-2小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的女贞子残渣中添加75-85°C热水，热水添加量为女贞子残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟，连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物。所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC6012，冻干菌粉中活菌数量为4_8X 108个/g。所述复合饲料添加剂由以下方法制得粉碎后灵芝菌培养物、抗菌肽、蜂胶、女贞子萃取物和枯草芽孢杆菌冻干菌粉按照比例混合得到复合饲料添加剂。
本发明提供一种饲料生产用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌种,该菌株已经于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 6012。有益效果枯草芽孢杆菌具有如下功能1.耗氧产酸，调节肠道微生态平衡，达到预防腹泻、下痢等疾病；2.分泌多种酶类，提高饲料消化利用率；3.产生多种营养素，参与机体新陈代谢；4.提高动物免疫力。本发明女贞子进行粉碎破壁处理，使女贞子中功能因子实现全价溶出和高效提取利用，分别采用有机溶剂和热水实现其中不同功效成分的有效提取，特别是控制温度分段提取更是有效提高了女贞子提取物的提取效率和质量。抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性短肽的总称。抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起 了人们的重视。除此之外，人们还发现，某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。本发明通过科学复配，将枯草芽孢杆菌、灵芝菌实现了有机组合，特别是灵芝菌培养中添加了中药成分，本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲养动物中的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料利用效率，增强动物的免疫力，提高饲养效益。具体实施方法本发明中灵芝菌培养物生产过程如下( I)斜面菌种活化培养(2)液体一级种子培养(3)液体二级种子培养(4)固体发酵培养(5)发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7%以下。对固体发酵物料进行粉碎。本发明所用灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏中心，菌号CICC14080。本发明中斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基或其他合适培养基。本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯(粉碎后)等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉等；需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。在发酵培养基中还添加有质量比为2-6%粉碎后过40-50目的当归、3_8%的粉碎后过40-50目的板蓝根，2-5%粉碎后过40-50目的麝香草；本发明中液体发酵种子培养基组成淀粉2-3%，蔗糖3-5%，葡萄糖1_3%，蛋白胨O. 5%，脱脂大豆蛋白粉2-3%，磷酸二氢钾O. 13-0. 2%，硫酸镁O. 1-0. 15%，维生素B12PPm，PH6-7。本发明中灵芝培养方法适合同属其它菌种通过发酵法进行大规模发酵培养。菌种诱变采取紫外诱变方法以CICC10023为出发菌株，制成菌悬液，涂布于培养基平皿上，紫外照射90s后37°C培养箱中培养。
菌种筛选从90s平皿上挑30个长得强壮的单菌落，接种于斜面上，37°C培养箱中，培养24小时，0-4°C冷藏保存；以原始菌种作为对照，采用常规选育条件，羧甲基纤维素钠作为碳源和蛋白水解圈方法筛选产纤维素酶和蛋白酶强的菌株，筛选获得产纤维素酶和蛋白酶强的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) LI,此菌株产纤维素酶能力比原始菌株提高了25%，产蛋白酶能力比原始菌株提高了 52%。将该菌种在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No 6012。本产品所用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌种，该菌株已经于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No6012。通过实验研究表明本发明产品具有良好的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、等致病菌的特性。采用杯碟法对灵芝饲料添加剂产品的抑菌效果进行了研究，试验采用饲料添加剂的10倍水浸提液进行研究。实验结果见表1，结果表明本发明产品具有抑制致病菌生长的良好特性。表I饲料添加剂产品的抑菌效果
权利要求
1.ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，所述具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂组成如下 抗菌肽10-15%，蜂胶10-20%，女贞子萃取物10-25%，枯草芽孢杆菌冻干菌粉15_30%，灵芝菌固体发酵培养物40-70% ;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012，上述比例为质量百分比；灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下斜面菌种活化培养，液体一级种子培养，液体ニ级种子培养，固体发酵培养，发酵培养结束，选择流化床干燥方法，将物料干燥到水分含量在7%以下，对固体发酵物料进行粉碎。
2.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述灵芝菌固体发酵所用培养基中添加有质量比为2-6%粉碎后过40-50目的当归、3-8%的粉碎后过40-50目的板蓝根，2-5%粉碎后过40-50目的麝香草。
3.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述女贞子萃取物制备方法如下 女贞子粉碎，过40-50目筛后，添加女贞子3-6倍重量无水こ醇浸溃提取，控制温度.30-45°C, 2-4小时后，调整温度为55-60°C 1-2小时，提取液浓缩、干燥得到こ醇提取物 ’乙醇提取后的女贞子残渣中添加75-85°C热水，热水添加量为女贞子残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟，连续提取2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述こ醇提取物和热水提取物合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物。
4.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌冻干菌粉中活菌数量为4-8 X IO8个/g。
5.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂组成如下 抗菌肽10%，蜂胶15%，女贞子萃取物15%，枯草芽孢杆菌冻干菌粉20%,灵芝菌固体发酵培养物40% ;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012，上述比例为质量百分比。
6.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂组成如下 抗菌肽10%，蜂胶10%，女贞子萃取物10%，枯草芽孢杆菌冻干菌粉10%，灵芝菌固体发酵培养物60% ;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012，上述比例为质量百分比。
7.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂组成如下 抗菌肽12%，蜂胶12%，女贞子萃取物14%，枯草芽孢杆菌冻干菌粉13%，灵芝菌固体发酵培养物49% ;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012，上述比例为质量百分比。
8.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述灵芝菌固体发酵培养基组成如下70%麸皮、I. 4%蔗糖、8%玉米粉、8%玉米芯(粉碎后)，.O.1%蛋白胨、2%脱脂大豆蛋白粉、O. 5%酵母粉；4%粉碎后过50目的当归、3%的粉碎后过40目的板蓝根，3%粉碎后过40目的麝香草。
9.根据权利要求I所述ー种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剤，其特征在于，所述具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂组成如下 抗菌肽10%，蜂胶12%，女贞子萃取物11%，枯草芽孢杆菌冻干菌粉13%，灵芝菌固体发酵培养物54% ;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012，上述比例为质量百分比。
全文摘要
一种具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂，具有抗菌抗氧化功能的复合饲料添加剂组成如下抗菌肽10-15%，蜂胶10-20%，女贞子萃取物10-25%，枯草芽孢杆菌冻干菌粉15-30%，灵芝菌固体发酵培养物40-70%；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为CGMCC6012，上述比例为质量百分比；本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲养动物中的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料利用效率，增强动物的免疫力，提高饲养效益。
文档编号A01G1/04GK102657287SQ201210182838
公开日2012年9月12日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者刘权, 王勇飞, 黄春玲 申请人:荆州双胞胎饲料有限公司