专利名称：一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法
技术领域：
本发明涉及植物修复技术，涉及一种重金属超富集/超积累植物的筛选方法，具体为一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法。
背景技术：
砷广泛存在于自然水体和土壤中，尽管与磷属于同族，但砷及其化合物均被认为是致癌物质。金属开采及冶炼、污泥农用、化肥、除草剂、杀虫剂等农用化学品大量使用和砷污染地下水浇灌农田等是砷在土壤中过量积累的主要原因。近年来，砷污染一直是全球(特别是东南亚地区及我国)非常突出且亟需解决的环境问题。目前我国受污染(包括重金属污
染)的耕地面积近2 000 Rhm 2，约占耕地总面积的I/ 5。砷在土壤中大量富集不仅造成环境污染，而且严重影响农作物质量与安全。湖南郴州某采矿区附近水稻田土壤中砷浓度高达1217 mg kg'该污染地区水稻谷粒中砷浓度高达7. 5 mg kg'远远高于我国水稻质量安全标准(0.15 mg kg—1) (GB2762-2005)。全球数百万居民正在遭受砷污染危害，其中数十万居民死于慢性砷中毒。亟需开发高效、切实可行的砷污染土壤治理技术。目前，治理土壤中砷等重金属污染的方法主要有物理、化学和生物的方法。物理化学方法主要包括改土法、石灰改良法、电热修复法、固化法、淋洗法等。这些方法各有其优点，但普遍存在工程量较大、费用高、易造成二次污染、危害治理人员健康、破坏土壤结构及肥力等问题，处理后的土壤往往不太适宜植物生长。物理化学方法主要适用于污染面积小、污染物浓度高的场地污染治理，而不太适合于大面积的农田重金属污染土壤治理。植物修复技术是利用绿色植物及其根际微生物原位修复受污染土壤或水体的一种技术。这项技术以工程措施简单、投资维护费用低、环境扰动小以及在水土保持、景观美化等方面优势明显成为学术界研究的热点。超富集植物(Hyperaccumulator)是指植物地上部分能够吸收超过100 mg kg—1的Cd,或超过 1000 mg kg-1 的 As、Cu、Co、Cr、Ni、Pb,或超过 10000 mg kg-1 的 Zn、Mn ,这一定义最早由Baker和Brooks (1989, Biorecovery, I: 81-126)提出。超富集植物只占植物界很小的一部分，绝大多数分布在世界极少数重(类)金属污染土壤中。目前，世界上累计发现各类超富集植物420余种，其中砷超富集植物14种。国内已报导砷超富集植物包括蜈虫公草 Vi ttata L.)、大叶井口边草cretica L.)等(陈同斌等，2002，科学通报，47: 902-905 ；韦朝阳等，2002，生态学报，22: 777-778)。超富集植物往往生长周期较长、植株矮小、生物量低、扎根浅，存在修复效率较低等缺点，极大地限制了它们在修复砷污染土壤方面的实际应用。因此，需要筛选更为理想、更为有效的超富集植物，为植物修复技术的产业化、市场化提供必要的物质基础。目前，修复植物的系统筛选在世界上尚未有统一的标准，已报道的超富集/超积累植物主要限制于在重金属污染土壤中筛选，重金属污染土壤仅占全球很小一部分，这大大限制了发现超富集植物的数量和种类
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，将砷吸收高效生态型蜈蚣草用于治理砷污染土壤，减少砷在农作物和农产品中的累积。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其包括如下步骤
第一步、野外采集我国多个地区蜈蚣草孢子，室内繁殖蜈蚣草幼苗；
第二步、利用多个地区蜈蚣草适龄幼苗，在含砷营养液中进行短期水培试验，初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草；
第三步、将初步筛选出的地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草适龄幼苗移栽至不同梯度的人工模拟砷污染土壤中培养12周，以蜈蚣草地上部分生物量、地上部分砷浓度、地上部分砷吸收总量及蜈蚣草对砷的耐性指数为指标，择优筛选出砷吸收高效生态型蜈虫公草。进一步，所述的第二步中的含砷营养液成分包括0. 2 mM KC1，I. 0 mM KNO3, 1.0mM Ca (NO3) 2 4H20, 0. 4 mM MgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8 u M MnCl2 4H20, 0. 15 uMZnSO4 7H20, 0. 07 uM CuSO4 5H20, 0. 03 uM H2MoO H2O, 4 uM Fe-EDTA, 10 100 u M
Na2HAsO4 7H20o进一步，所述的第二步中的短期水培试验的时间为l 24h。进一步，所述的第三步中的人工模拟砷污染土壤砷含量为l(T250mg kg'进一步，其所述第一步、野外采集我国多个地区蜈蚣草孢子，室内繁殖蜈蚣草幼苗，它包括以下步骤
A、10月中下旬在我国多个砷污染地区和未污染地区采集自然生长的蜈蚣草孢子，室内自然风干后，获得不同地区蜈蚣草孢子保存待用，其中砷污染地区不少于3处，未污染地区不少于3处，不同地区之间至少相距100 km ；
B、将粒度小于2mm的未污染土壤与粒度小于2 mm河沙按照重量比4:1混合，作为培养基质，装入育苗盘和育苗钵，在育苗盘的培养基质表层分别撒播已采集的不同地区蜈蚣草孢子，播种后均匀撒上一层细土 (粒度小于I mm)，按照基质最大持水量的80%喷水浇湿，农用塑料薄膜覆盖；
C、在可控温度和光照的温室中进行培养，每2日称重育苗盘I次，孢子发芽后，每周再酌量施加20% Hoagland营养液补充营养，培养过程中按照培养基质最大持水量的80%维持水分；
D、2-3月后将蜈蚣草单株幼苗分栽至育苗钵中，定期酌量施加20%Hoagland营养液，按照培养基质最大持水量的80%维持水分，苗高至4-5厘米待用。进一步，其所述第二步、利用多个地区蜈蚣草适龄幼苗，在含砷营养液中进行水培试验，初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草，它包括以下步骤
A、将第一步中得到的不同生态型蜈蚣草幼苗以自来水冲洗根部泥土，整株蜈蚣草以塑料泡沫板固定，移栽至盛放20% Hoagland营养液的塑料盆中生长，营养液保持充气且每周更换I次；
B、4周后蜈蚁草幼苗在含砷营养液中分别处理0、1、2、6、12或24h,其中所述的含砷营养液成分包括0. 2 mM KCl, 1.0 mM KNO3, I. 0 mM Ca (NO3) 2 4H20, 0. 4 mM MgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8 uM MnCl2 4H20, 0. 15 uM ZnSO4 7H20, 0. 07 uMCuSO4 5H20, 0. 03 u M H2MoO H2O, 4 uM Fe-EDTA, 10 u M Na2HAsO4 7H20 ；
C、在每一时间点，将蜈蚣草羽叶从叶柄底部与根分开，蜈蚣草地上部分由去离子水清洗后擦干、称重并干燥；
D、将得到的蜈蚣草地上部分磨碎并经混合酸消解，地上部分总砷含量利用电感耦合等离子体质谱测定，初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草，其中所述混合酸为HNO3和HClO4，它们的体积比为85:15，消解温度不高于120°C。进一步，其所述第三步、将初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草适龄幼苗移栽至不同梯度的人工模拟砷污染土壤中培养12周，以蜈蚣草地上部分生物量、地上部分砷浓度、地上部分砷吸收总量及蜈蚣草对砷的耐性指数为指标，择优筛选出砷吸收高效生态型蜈蚣草，包括以下步骤
A、将初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草作为研究对象；
B、以未污染地区表层土(5-15cm)为栽培介质(粒度小于2 _)，不同生态型苗高4_5厘米蜈蚣草适龄幼苗将移植于塑料盆内，塑料盆装人工模拟砷污染土壤，每盆中移植I棵幼苗，土壤砷含量为O、10、50、250 mg kg_1 ；
C、蜈蚣草每2天用去离子水浇灌I次,每周酌量施加20%Hoagland营养液补充营养，称重法保持80%持水量，12周后蜈蚣草地上部分及根分离后用去离子水浸洗、擦干、称重并干燥；
D、将得到的蜈蚣草地上部分磨碎并经混合酸消解，总砷含量利用电感耦合等离子体质谱测定，以蜈蚣草地上部分生物量、地上部分砷浓度、地上部分砷吸收总量及蜈蚣草对砷的耐性指数为指标，筛选出一种砷吸收高效生态型蜈蚣草，其中所述混合酸为HNO3和HClO4，它们的体积比为85:15，消解温度不高于120°C。进一步，所述的20% 的 Hoagland 营养液成分包括0. 2 mM KH2PO4, I. 0 mM KNO3,I. 0 mM Ca (NO3) 2 4H20, 0. 4 mM MgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8 u M MnCl2 4H20, 0. 15U M ZnSO4 7H20, 0. 07 uM CuSO4 5H20, 0. 03 uM H2MoO H2O, 4 uM Fe-EDTA。本发明原理如下
在长期的进化过程中，为适应特殊立地条件下不利的自然环境，生长于重金属污染土壤的植物(污染生态型)与生长于非污染土壤的植物(非污染生态型)相比往往存在明显的基因差异(van Hoof et al. , 2001, Plant Physiology, 126: 1519-1526; Mengoni etal. , 2003，Plant and Soil, 257: 451-457)和生理差异(Bleeker et al. , 2003，NewPhytologist, 175: 33-38)。已有研究结果显示超富集砷是蜈蚁草的一种先天固有的属性。蔡保松等(2007，浙江大学学报，33: 473-478)发现采集于广西、湖南、重庆、广东和福建等地的蜈蚣草孢子培育出幼苗的田间试验结果表明蜈蚣草地上部和根部的砷浓度存在显著的基因型差异。蜈蚣草在我国地域分布较广，在南部18个省份均有分布(陈同斌等，2005，地理研究，24: 825-833)。我国幅员辽阔，地域差别明显，因此，筛选出砷吸收存在明显差异的蜈蚣草生态型存在必然性。本发明具有以下优点
I具有首创性。从已有的相关文献报道来看，以多个地区广泛存在的砷超富集植物蜈蚣草为筛选对象，利用水培和土壤砷污染模拟试验进行砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选研究在国内外均未曾涉及；2方法简单，可操作性强。本筛选方法采用人工可控制的砷污染条件，参试的不同生态型蜈蚣草均处于相对一致的生长环境，不同生态型蜈蚣草之间对砷的耐性及富集特征具有可比性。利用室内常规的水培试验和土培试验两步筛选，方法简单，可操作性强；
3经济可行。蜈蚣草孢子广泛存在，易于采集，筛选成本相对较低。
图I短期(0_24h)水培试验条件下，不同生态型蜈蚣地上部分砷吸收效应初步筛选试验结果。图2砷吸收高效生态型蜈蚣草在典型砷污染土壤中植物修复验证试验。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。实施例I
一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法
采用水培试验和土培试验，分三步筛选出砷吸收高效生态型蜈蚣草。蜈蚣草幼苗培育2008年10月中下旬，采集我国多个地区自然生长的蜈蚣草成熟孢子，采样地点包括3个非污染地区[香港大埔窖自然保护区(简称香港)、广东省中山大学校园(简称广州)和广西省南宁市广西植物研究所林地(简称南宁)]和4个砷不同程度污染地区[广东省韶关市乐昌尾矿区(简称乐昌)、湖南省桂阳县大顺垄铅锌废弃矿区(简称大顺垄)、湖南省郴州市苏仙区野鸡尾铅锌废弃矿区(简称野鸡尾)和浙江省衢州市灰坪乡铅锌废弃矿区(简称衢州)]，用刀片轻轻刮下蜈蚣草羽叶背面孢子粉或将带孢子的羽叶剪下，室内自然风干后保存待用。2008年12月下旬于香港浸会大学温室育苗盘(75 cmX40cmX12 cm，长X宽X高)内播种孢子，无污染土壤与河沙混合物(粒径均小于2 _，重量比4:1)作为培养基质，播种后均匀撒上一层细土，喷水浇湿(按照基质最大持水量的80%浇水)，塑料薄膜覆盖。15日后孢子萌发，按照基质最大持水量的80%维持水分，每周酌量施加20%Hoagland营养液补充营养。2_3月后将蜈蚣草幼苗单株幼苗分栽至育苗钵(0 =12cm, H=15 cm)中，苗高至4-5厘米待用。其中20%的Hoagland营养液成分包括0. 2 mMKH2PO4, LOmMKNO3, I. 0 mM Ca(NO3)2 4H20, 0. 4 mM MgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8U M MnCl2 4H20, 0. 15 uM ZnSO4 7H20, 0. 07 uM CuSO4 5H20, 0. 03 uM H2MoO H2O,
4uM Fe-EDTA。水培试验2009年4月，7种不同生态型(香港、广州、南宁、乐昌、大顺垄、野鸡尾和衢州)适龄蜈蚣草幼苗(苗高4-5厘米)以自来水冲洗干净根部泥土，塑料泡沫板固定后整株移栽至盛放3.0 L 20% Hoagland营养液的塑料盆(18 cmX12 cmX15 cm，长X宽X高)中生长，营养液保持充气且每周更换I次。4周后蜈蚣草幼苗在含砷营养液中分别处理O、I、2、6、12或24 h，重复4次，其中所述的含砷营养液成分包括0.2 mM KCl, I. 0 mMKNO3, I. 0 mM Ca (NO3) 2 4H20, 0. 4 mM MgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8 u M MnCl2 4H20,0. 15 u M ZnSO4 7H20, 0. 07 uM CuSO4 5H20, 0. 03 uM H2MoO H2O, 4 uM Fe-EDTA, 10UM Na2HAsO4 7H20。在每一个时间点，蜈蚣草羽叶将从叶柄的底部(大约根上Icm)与根分开，蜈蚣草地上部分由去离子水清洗后擦干、称重并干燥。植物样品磨碎并经混合酸(HNO3和HClO4,85:15，v/v)消解后(=120°C )，总砷含量利用电感耦合等离子体质谱测定，结果见图I。根据蜈蚣草地上部分砷浓度高低初步筛选出2种砷吸收高效生态型蜈蚣草。如图I所示南宁和广州生态型分别在第6、12和24小时砷吸收能力显著高于其余4种生态型，在第24h时南宁和广州生态型地上部分砷浓度分别为2025和2013 mg kg—1，分别是大顺垄生态型的5. 56和5. 55倍，南宁和广州生态型可初步筛选为砷吸收高效型蜈蚣草。土培试验2009年5月，米集非污染地区表层(5-15 cm)土壤风干、过2mm筛后,分别与一定量的Na2HAsO4 7H20混合装入塑料盆(￠=18 cm, H=22 cm)，土壤中的砷拟有以下4个水平0、10、50、250 mg kg'平衡2周后，将水培试验初步筛选出的2种砷吸收高效生态型(南宁及广州生态型)蜈蚣草及与其砷吸收存在明显差异的4种生态型(香港、大顺垄、野鸡尾和衢州)蜈蚣草幼苗(苗高4-5厘米)移植于塑料盆内，每盆中移植I棵幼苗，重复4次。选择另外4种生态型蜈蚣草研究(香港、大顺垄、野鸡尾和衢州)的主要目的是作为对照，在处于相对一致的生长环境下与南宁和广州生态型蜈蚣草砷的耐性及富集特征进行比较。不定期浇去离子水及酌量施加20%Hoagland营养液补充营养，称重法保持基质 80%持水量。12周后，蜈蚣草地上部分及根分离后用去离子水浸洗、擦干、称重并干燥。地 上部分磨碎并经混合酸(HNO3和HClO4,85:15, v/v)消解(写120°C )，总砷含量利用电感耦合等离子体质谱测定，结果见表I。以蜈蚣草的地上部分生物量、地上部分砷浓度及吸收总量及对砷的耐性指数为筛选标准。所得数据利用软件SAS8. I进行方差分析，与其他生态型相比，地上部分生物量、砷浓度及砷吸收总量显著性(/7 > 0.05)高的生态型为砷吸收高效生态型蜈蚣。
权利要求
1.一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于，其包括如下步骤 第一步、野外采集我国多个地区蜈蚣草孢子，室内繁殖蜈蚣草幼苗； 第二步、利用多个地区蜈蚣草适龄幼苗，在含砷营养液中进行短期水培试验，初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草； 第三步、将初步筛选出的地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草适龄幼苗移栽至不同梯度的人工模拟砷污染土壤中培养12周，以蜈蚣草地上部分生物量、地上部分砷浓度、地上部分砷吸收总量及蜈蚣草对砷的耐性指数为指标，择优筛选出砷吸收高效生态型蜈虫公草。
2.根据权利要求I所述的一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于所述的第二步中的含砷营养液成分包括0. 2 mM KC1，I. 0 mM KNO3, I. 0 mM Ca (NO3) 2 4H20,0. 4 mM MgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8 uM MnCl2 4H20, 0. 15 uM ZnSO4 7H20, 0. 07U M CuSO4 5H20, 0. 03 uM H2MoO H2O, 4 uM Fe-EDTA, 10 100 u M Na2HAsO4 7H20。
3.根据权利要求I所述的一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于所述的第二步中的短期水培试验的时间为l 24h。
4.根据权利要求I所述的一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于所述的第三步中的人工模拟砷污染土壤中的砷的含量为l(T250mg kg'
5.根据权利要求I所述的一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于其所述第一步、野外采集我国多个地区蜈蚣草孢子，室内繁殖蜈蚣草幼苗，它包括以下步骤 A、10月中下旬在我国多个砷污染地区和未污染地区采集野外生长的蜈蚣草孢子，室内自然风干后，获得不同地区蜈蚣草孢子保存待用，其中砷污染地区不少于3处，未污染地区不少于3处，不同地区之间至少相距100 km ； B、将粒度小于2mm的未污染土壤与粒度小于2 mm河沙按照重量比4:1混合，作为培养基质，装入育苗盘和育苗钵，在育苗盘的培养基质表层分别撒播已采集的不同地区蜈蚣草孢子，播种后均匀撒上一层细土 (粒度小于I mm)，按照基质最大持水量的80%喷水浇湿，农用塑料薄膜覆盖； C、在可控温度和光照的温室中进行培养，每2日称重育苗盘I次，孢子发芽后，每周酌量施加20% Hoagland营养液补充营养，培养过程中按照培养基质最大持水量的80%维持水分； D、2-3月后将蜈蚣草单株幼苗分栽至育苗钵中，定期酌量施加20%Hoagland营养液，按照培养基质最大持水量的80%维持水分，苗高至4-5厘米待用。
6.根据权利要求I所述的一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于其所述第二步、利用蜈蚣草幼苗，在含砷营养液中进行水培试验，初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草，它包括以下步骤 A、将第一步中得到的不同生态型的苗高4-5厘米的蜈蚣草幼苗以自来水冲洗根部泥土，整株蜈蚣草以塑料泡沫板固定，移栽至盛放20% Hoagland营养液的塑料盆中生长，营养液保持充气且每周更换I次； B、4周后蜈蚁草幼苗在含砷营养液中分别处理0、1、2、6、12或24h,其中所述的含砷营养液成分包括 0. 2 mM KCl, 1.0 mM KNO3, I. 0 mM Ca(NO3)2 4H20, 0. 4 mMMgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8 uM MnCl2 4H20, 0. 15 uM ZnSO4 7H20, 0. 07 uMCuSO4 5H20, 0. 03 u M H2MoO H2O, 4 uM Fe-EDTA, 10-100 u M Na2HAsO4 7H20 ； C、在每一时间点，蜈蚁草羽叶将从叶柄的底部与根分开，蜈蚁草地上部分由去尚子水清洗后擦干、称重并干燥； D、植物样品磨碎并经混合酸消解，地上部分总砷含量利用电感耦合等离子体质谱测定，初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草，其中所述混合酸为HNO3和HClO4，它们的体积比为85:15，消解温度不高于120°C。
7.根据权利要求I所述的一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于其所述第三步、将初步筛选出的地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草适龄幼苗移栽至不同梯度的人工模拟砷污染土壤中培养12周，以蜈蚣草地上部分生物量、地上部分砷浓度、地上部分砷吸收总量及蜈蚣草对砷的耐性指数为指标，择优筛选出砷吸收高效生态型蜈蚣草，包括以下步骤 A、将初步筛选出地上部分砷浓度较高的2飞种生态型蜈蚣草作为研究对象； B、以未污染地区表层土为栽培介质，不同生态型蜈蚣草适龄幼苗将移植于塑料盆内，塑料盆装人工模拟砷污染土壤，每盆中移植I棵幼苗，土壤砷含量为0、10、50、250 mgkg-1 ； C、蜈蚣草每2天用去离子水浇灌I次,每周酌量施加20%Hoagland营养液补充营养，称重法保持80%持水量，12周后蜈蚣草地上部分及根分离后用去离子水浸洗、擦干、称重并干燥； D、地上部分磨碎并经混合酸消解，总砷含量利用电感耦合等离子体质谱测定，以蜈蚣草地上部分生物量、地上部分砷浓度、地上部分砷吸收总量及蜈蚣草对砷的耐性指数为标准，筛选出一种砷吸收高效生态型蜈蚣草，其中所述混合酸为HNO3和HClO4，它们的体积比为85:15，消解温度不高于120°C。
8.根据权利要求I所述的一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，其特征在于所述的 20% 的 Hoagland 营养液成分包括0. 2 mM KH2PO4, I. 0 mM KNO3, I. 0 mMCa (NO3) 2 4H20, 0. 4 mM MgSO4 7H20, 9 uM H3BO3, I. 8 u M MnCl2 4H20, 0. 15 uMZnSO4 7H20, 0. 07 uM CuSO4 5H20, 0. 03 uM H2MoO H2O, 4 uM Fe-EDTA。
全文摘要
本发明涉及一种砷吸收高效生态型蜈蚣草的筛选方法，包括如下步骤第一步、野外采集我国多个地区蜈蚣草孢子，室内繁殖蜈蚣草幼苗；第二步、利用多个地区蜈蚣草适龄幼苗，在含砷营养液中进行短期水培试验，初步筛选出地上部分砷浓度较高的2~5种生态型蜈蚣草；第三步、将初步筛选出的地上部分砷浓度较高的2~5种生态型蜈蚣草适龄幼苗移栽至不同梯度的人工模拟砷污染土壤中培养12周，以蜈蚣草地上部分生物量、地上部分砷浓度、地上部分砷吸收总量及蜈蚣草对砷的耐性指数为指标，择优筛选出砷吸收高效生态型蜈蚣草。本发明的筛选方法简单易行，程序化高，易于推广，对于修复砷污染土壤、保护农产品质量安全具有重要意义。
文档编号A01H1/04GK102715082SQ201210244459
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者刘军华, 吴福勇, 李会杰 申请人:河南城建学院