一个高粱蜡质合成调控基因及其在拟南芥植株中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明主要提供了一个高粱蜡质合成调控基因，其核苷酸序列如文中SEQ?ID?NO：1所示，还涉及了该基因在拟南芥植株中的应用。转化所述基因的拟南芥，其叶片蜡质更厚，叶片有光泽，具有抗旱、抗病虫害等优点。
【专利说明】一个高粱蜡质合成调控基因及其在拟南芥植株中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一个高粱蜡质合成调控基因，还涉及该基因在模式植物拟南芥中的应用。
【背景技术】
[0002]植物表皮细胞的外面有一层结构，称为角质层。角质层为网状结构，有蜡质填充其间，这些填充在角质层网状结构内的蜡层被称为内蜡质层；在角质层外形成只有蜡质成分的结构，为外蜡质层，外蜡质层一般会形成自我组装的蜡质晶体。研究表明:被蜡质填充的角质层能够降低通过植物表面的水分散失，提高植物的抗旱性。角质层还在防止紫外线辐射伤害、抵抗病虫害的侵入方面起重要作用，此外，角质层的蜡质含量与花粉育性和一些农艺性状表现有关。
[0003]为获得能显著提高农作物蜡质含量的基因，我们选用了蜡质含量较高的高粱为材料，进行腊质合成相关基因的克隆。闻梁属于禾本科，闻梁属，I年生草本，植株表面常覆有明显的蜡质成分，使其具有广泛的适应性和较强的抗逆能力，是用于蜡质相关优良基因鉴定的理想材料。我们以拟南芥中调控腊质合成的基因WINl的序列为参考序列，克隆了闻梁中的相应同源基因，命名为SbWINl，并通过基因工程操作，将其转到拟南芥中，并处于组成型超表达启动子35S的控制下。表型鉴定的结果表明，转基因拟南芥的叶片的蜡质含量明显增加，叶 片有光泽。采用扫描电镜对其进行深度形态学扫描，结果表明，叶片表面的蜡质晶体成分明显增多，高粱SbWINl基因具有显著提高植物表面蜡质成分的能力，是进行农作物蜡质性状改良的一个重要候选基因。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一个高粱蜡质合成调控基因，以及该基因在拟南芥蜡质成分性状改变中的应用。
[0005]本发明的技术方案如下:一个高粱蜡质合成调控基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示:
[0006]AUGGUACAGCCMAGMGUUUOGUGGAGUCOGGCAGCGCCACUGGGGUUCCUGGGUCUCOGAGAUCAGGCAUCCCC
[0007]UCCUUMGAGGAGGGUCUGGCUGGGCACCUUOGAGACOGCUGAGGAGGCAGCGAGAGCAUAUGAOGAGGCUGCOGU
[0008]GCUGAUGAGCGGCOGCMOGCCMGACCMCUUCCOGGUCCMAGGAGCAGCACAGGGGAGCCMCCCCAGCUGCG
[0009]GGMGGGAOGCUCACAGCMOGCOGGCAGCGGCUCCUCUACOGCCMCCUGUCCCAGAUUCUCAGUGCGMGCUCC
[0010]GCMAUGCUGCMGGCGCCAUOGCCCUCCCUGACCUGUCUCOGCCUUGACCCUGAGMGUCCCACAUUGGUGUUUG[0011 ] GCAGMGCGUGCAGGAGCCOGUGCUGACUCCMCUGGGUCAUGACOGUGGAGCUCMCMAGGUGCAGCAUCCACU
[0012]GAU(m^AUCACAGUO:ACAUCAa:MCMCUGCUCCACCAGCCACCCOGAUGGAUGAOGAGGAGAGGAUOGCCC
[0013]UGCMAUGAUOGMGAGUUGCUGAGCAGCAGCAGCCCAGCUUCACCCUOGCAOGGAGAUGACCMGGUOGCUUCAU
[0014]CAUCUGA
[0015]SEQ ID NO: I[0016]所述基因根据拟南芥AtWINl基因的序列，通过同源序列比对获得高粱的SbWINl基因序列，通过扩增、连接、植物转化等分子生物学操作而获得。具体如下:
[0017]采用生物信息学的方法，获得SbWINl基因序列。利用PRMER5设计引物用于扩增开放阅读框序列。提取高粱BTX623茎杆的RNA，将I μ g的RNA逆转录为cDNA作为扩增的模板备用。用设计的特异引物进行扩增。将扩增的产物连接到克隆载体上。转入大肠杆菌，筛选阳性的进行测序，获得SEQ ID NO:1所示的基因序列。
[0018]将上述克隆到的基因连接到超表达载体，采用农杆菌介导转化方法，获得转基因拟南芥植株。结果表明转基因拟南芥叶片蜡质比普通的要厚，叶片有光泽。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1野生型拟南芥； [0020]图2是含有本发明序列表中序列I基因的拟南芥；
[0021]图3野生型拟南芥的扫描电镜图；
[0022]图4是含有本发明序列表中序列I基因的拟南芥电镜扫描图。
【具体实施方式】
[0023]下面以高粱的茎杆作为试验材料详细说明制备方法。
[0024]1.总RNA的提取采用TIANGEN试剂盒，操作步骤如试剂盒说明所示。得到RNA溶液后琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量，-80°C保存。
[0025]2.cDNA 的合成:cDNA 的合成使用 Invitrogen 的 SuperScript? III First-StrandSynthesis System for RT-PCR,步骤如下:
[0026]I)取0.5ml灭菌微量离心管，分别加入以下成分:总RNA ；01igl dT ；10mM dNTP。混匀，轻甩离心管，使溶液至底部；
[0027]2)离心管置于水浴锅内，65°C保温5min ；
[0028]3)迅速取出置于冰上冷却Imin以上，将离心管轻微离心；
[0029]4)在上述离心管中加入下列反转录反应液:5XFirst-strand Buffer ；0.1M DTT ；Recombinant RNase Inhibitor ；SuperScript? III RT ；
[0030]5)轻微震荡混匀后短暂离心；
[0031]6)50°C保温 50min ;
[0032]7) 70 保温 15min，-20 °C 保存。
[0033]高梁β-Actin F (GenBank accession N0.X79378)检测反转录产物。PCR 扩增程序:94°C 4min，35 个循环的程序为 95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，最后 72°C 5min。2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0034]3.SbffINl 的分离
[0035]PCR扩增引物采用“Primer 5.0”引物设计软件进行设计，并对得到的引物序列用VectorNTI进行分析，找出解链温度，自身互补性，两引物互补性合适的引物对。cDNA为模板，SbAGL6-F、SbAGL6-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为:反应总体系50 μ 1，包括反转录产物，IOXphushion HF buffer, 10mmol/T, dNTPs, IOmM 基因特异引物，phusionDNA聚合酶，DMS0，剩余用水补齐。PCR扩增程序:98°C lmin，35个循环的程序为98°C 10s，47°C 20s, 72°C 30s，最后72°C IOmin0本试验PCR扩增选用的是NEB公司的PhusionDNA聚合酶。
[0036]4.PCR产物的加A连接
[0037]利用Phusion DNA聚合酶产生的克隆片段为平末端，在进行TA克隆之前，可用另一种聚合酶Taq酶在平末端PCR产物末端进行加A。加入PCR回收产物、5XTaq buffer、IOmM dATP、Taq酶，72°C保持15分钟，取出2μ I加A后的PCR回收产物加入2 X T4连接酶缓冲液、pGEM-T easy 载体(50ng/μ I)、T4DNA 连接酶(3υ/μ I)连接到 pGEM-Teasy 载体上，pGEM-T easy载体购自Promega公司。
[0038]5.连接产物的转化
[0039]I)从_80°C冰箱中取出I管(50 μ I)感受态细胞，置冰上。
[0040]2)用预冷的无菌吸头向管中加入2μ I连接反应物，轻轻摇匀，置冰上30分钟。[0041 ] 3) 42 V水浴热激60秒，迅速置冰上5分钟。
[0042]4)向离心管中加入SOC液体培养基，混匀后37°C振荡培养lh。
[0043]5)室温下8000rpm离心5分钟，弃掉上清液，将剩余上清液重新悬浮菌体，用涂布器将其均匀涂到X-gal+IPTG+Amp的平板上，放置30分钟。
[0044]6)倒置平板于37°C恒温培养箱中过夜，待出现明显单菌落时拿出。
[0045]7)放入4 V冰箱数小时，使蓝白斑颜色分明。
[0046]6.重组质粒的PCR`鉴定
[0047]本实验所用的pGEM-T载体的插入片段上游有T7引物，下游有SP6引物和M13引物，所以可以用这三个启动子序列做引物对插入片段进行特异性扩增，对重组质粒进行鉴定，鉴定程序如下:PCR扩增体系包括10 X buffer (含MgCl2), dNTP 10mmol/L, T7和SP6引物(20ng/y l)，Taq酶，模板为转化后的白色菌斑。反应条件为:94°C，10min ;35个循环:94°C，30s ； 56 °C, 30s ；72°C,2min ;72°C延伸5min。最后，PCR扩增产物用I %琼脂糖电泳检测，选择合适大小的阳性克隆测序。测序在华大基因测序部完成。
[0048]表达载体的构建:根据SbWINl基因的ORF序列，将Gateway技术中的AttB位点加入原始引物序列，从阳性克隆的质粒中扩增出ORF片段，用于构建表达载体。
[0049]7.带有attB位点的基因序列的扩增
[0050]以通过测序鉴定的质粒为模板SbWINlF，SbWINIR，为引物进行PCR扩增。
[0051]PCR扩增体系为:反应总体系包括反转录产物，IOXphushion HF buffer, IOmmol/LdNTPs，10mM基因特异引物，phusion DNA聚合酶，DMS0，剩余用水补齐。PCR扩增程序:98°C 30s，35 个循环的程序为 98°C 10s,60°C 30s, 72°C lmin，最后 72°C 5min。50 μ I 全部点样，琼脂糖电泳后回收PCR产物。
[0052]8.入门载体的构建
[0053]利用得到的Sb-WINl产物和pDONR(amp)进行BP反应，Sb-WINl基因编码序列将pDONR(amp)载体上的ccdB位点置换，构建成氨苄青霉素抗性的入门载体。将BP反应产物经转化大肠杆菌菌株DH5ci后，用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，pDONR(amp)载体上游有T7引物和SbAGL6R引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。BP反应体系包括PCR产物、pDONR(amp) vector、BP clone II enzyme、dd H2O0[0054]9.表达载体的构建
[0055]将鉴定正确的质粒连接到pGWB14表达载体上，进行转化和酶切检测，将鉴定正确的菌液送到华大基因公司测序。LR反应体系包括BP质粒、pGWB14vector、LR clone11enzyme> dd H2O0
[0056]10.重组质粒pKIGW-SbWINl农杆菌的电击转化
[0057]①取50 μ I的农杆菌感受态细胞于冰上融化，加入2 μ I已构建好的质粒DNA，轻柔混匀，冰上放置半小时。 [0058]②将①中的混合物转入电击杯中，电击杯提前预冷。
[0059]③用细胞融合仪进行电击。
[0060]④电击结束后立即加入不含抗生素的SOC培养基中，混匀后移入2ml离心管中，28°C下震荡培养2h。
[0061]⑤8000rpm，离心5min，弃上清，剩余菌液涂在含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的固体LB平板上，28 °C下倒置，培养2天。
[0062]11.PCR验证和菌种保存
[0063]挑取培养基上的单菌落，作菌落PCR筛选单克隆。将鉴定正确的单克隆，液氮速冻，-80°C保存以备用。
[0064]12.将活化后的囷液取Iml于200ml接种于含有卡那霉素、大观霉素、庆大霉素的液体LB培养基中，280C，250rpm振荡培养至OD600 = 0.8~0.9。
[0065]将上述菌液5000rpm离心8min,用5% (w/v)鹿糖溶液悬浮菌体,使0D_ = 0.8~
0.9。将悬浮完菌体的蔗糖溶液中加入终浓度为0.02% Silwet L-77，将拟南芥花序浸入加了 Silwet L-77的鹿糖溶液中浸泡lmin。
[0066]把拟南芥用塑料袋套好，密封培养16-24小时后按常规方法培育植株到结实，收获Ttl代种子。
[0067]13.拟南芥Ttl代种子筛选
[0068](I)将干燥2周后的Ttl代种子先用75%酒精消毒I分钟，再用无菌水冲洗三遍。最后用无菌的枪头将消毒后的种子点播在1/2MS选择培养板(75mg/L卡那霉素)上。
[0069](2)4°C春化两天后置于22°C、16h光照条件下，IOd后观察其子叶和根的发育状况，挑选转化体，转化体表现为真叶健康呈深绿色，根长至培养基里。于与转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。IOd后，把生长正常的拟南芥幼苗移栽到土中。当植株长到8~10叶时，提取幼嫩叶片基因组DNA，进行PCR鉴定；通过鉴定的植株分单株收获种子。
[0070]14.转基因拟南芥的PCR鉴定
[0071]用SIGMA公司的Extract-N-Amp? Plant PCR Kits试剂盒对转基因拟南芥进行鉴定，步骤如下:
[0072](I)DNA提取:取0.5-0.7cm叶片组织到2ml离心管中，加入ExtractionSolution, 95°C保持 IOmin,加入 Dilution Solution, 2°C -8°C储存以备用。
[0073](2) PCR 扩增:PCR 扩增反应体系包括 ddH20、Extract-N-Amp PCR ReadymixUOmMPrimer F> IOmM Primer R、Leafdisk extract ;PCR 扩增反应程序为:94°C 3min,30 个循环包括 94°C lmin、6(TC lmin、72°C lmin30sec，然后 72°C IOmin0[0074]15.转基因植物的表型鉴定
[0075]直观观察结果可以明显看到，转基因的拟南芥具有光泽叶片。
[0076]16.扫描电镜观察叶片的结果:通过扫描电镜的观察我们发现转基因的叶片上的蜡质大量的增加了。
[0077]以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利`涵盖范围之内。
【权利要求】
1.一个高粱蜡质合成调控基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.权利要求1所示的基因，其特征在于:该基因序列与拟南芥AtWINl基因有很高的同源性，对其进行克隆测序，经基因工程操作，使其受控于组成型的启动子。
3.权利要求1或2所述的基因在拟南芥中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103667306SQ201210316402
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2012年8月31日
【发明者】谢晓东, 孙守钧, 包曙光, 罗峰, 丁博, 傅扬, 王锐 申请人:天津农学院