专利名称：大花金鸡菊叶中β-谷甾醇的提取方法及其新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学与农业领域，具体来说是提供一种大花金鸡菊中β-谷留醇的提取方法及其用途。
背景技术：
大花金鸡菊((Sbreop1Si1S grandiflora Hogg.)又名剑叶波斯菊、狭叶金鸡菊和剑叶金鸡菊，是菊科金鸡菊属多年生宿根草本植物，原产美洲，1938年作为观赏植物传入我国，是外来杂草之一。该草耐贫瘠，抗污染，繁殖力强，因此在我国许多地区大量种植，并逃逸为野生杂草，资源丰富。已有研究表明，该植物根茎叶的挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌等均具有抑制作用(李希红，陈荣，纪付江.安徽农业科学，2009,37(23):10996，10998.)，从该植物花中分离得到的KPY-78-菊黄色素被用于食品添加剂(李鸿英，陆长根，李秀华.植物学报.1981,23(6) :511-514.);而根、茎、叶三种器官的水浸提液能不同程度的抑制白菜、Brassica pekinensi5·入胡萝卜iDaucus caro ia入狗牙根iCynodon dactylon)^ 翦股颖 iAgrostis infirma)、结缕草iZoysia japonica)、二月兰(Orychophragmus violaceus)>{Dianthus和鸡冠花cristata)等植物的种子萌发及幼苗生长(曾建军，杨丽英，孙敏.西南大学学报(自然科学版)，2009，31 (6) :88-91 ;郭荣群，赵宏，张柯，江征，杨振美，闻启.北方园艺，2010(4) :45-48 ;杜明利，高岩，张汝民，等·浙江农林大学学报，2011，28(I) : 109-114)。本发明人也发现大花金鸡菊的根、茎、叶、叶柄、花、萼片及种子粉末对生菜、反枝苋、黄瓜、苘麻、小麦和稗等受体植物幼苗的生长均具有很高的抑制活性(赵妹，罗小勇，仪铭，孟昭礼.安徽农业大学学报，2009,36(3) :369-372)。在对大花金鸡菊叶中有效成分的进一步研究中，首次从中分离到β -谷甾醇(β -sitosterol),并首次发现其具有高除草活性，从而完成了本发明。尽管此前，已经从天癸(吴雪平.贵州大学，2004)、大叶兔尾草(陈艳.广西中医学院，2005)、大三叶升麻(刘彦儒.第二军医大学，2011)、花木蓝(李春 正.天津大学，2006)、绿舒筋(徐满珍.华中科技大学，2007)、灯心草(李红霞.中南民族大学，2007)、三桠苦(刁远明.广州中医药大学，2005，)、枇杷花(李琪，四川师范大学，2009)、红药(王满元，中国中医研究院，2002)、紫花地丁 (杨鹏鹏，闻福林，梁一兵，等.新乡医学院学报，2008，25 (2) : 185-187)、天葵子(蓝华英.天津大学，2006)、无花果(徐希科，胡疆，柳润辉，等.药学服务与研究，2005，5(2):138-140)和白头翁(丁秀娟.苏州大学，2010)等多种植物中被分离到，但尚未见其农用除草活性的任何报道。而且，本发明中所述的提取分离方法，系采用活性追踪法一步步探索而成，它非常适合于大花金鸡菊中该物质的提取分离，提取分离的过程及方法不同于上述植物。
发明内容
本发明的目的之一在于从大花金鸡菊中分离出活性物质谷甾醇。
本发明的另外一个目的是提供所述化合物的提取方法。本发明的又一个目的是提供所述化合物的农药用途，更进一步的是提供该化合物的除草用途。具体的，一种大花金鸡菊中谷留醇的提取方法,包括如下步骤
取大花金鸡菊叶干粉，用体积比100%乙醇浸泡提取5 - 7次，每次时间为2 — 4d，提取液合并后经真空抽滤和旋转蒸发回收溶剂，得乙醇提取浸膏，将乙醇提取浸膏加入10-20倍重量蒸馏水混悬后，加入等量石油醚萃取7 — 9次，回收溶剂后得石油醚萃取物浸膏，取石油醚萃取物经硅胶柱色谱，依次用石油醚+乙酸乙酯，以及乙酸乙酯+甲醇进行梯度洗脱，对获得的馏分再用石油醚+丙酮进行梯度洗脱得到β-谷甾醇。优选的，用浓度为100%乙醇提取6次，每次时间为3d，用石油醚萃取8次，取石油醚相继续分离。
具体实施方式
·本发明所述的化合物具有下列结构式
该化合物是从大花金鸡菊的干叶中提取。具体的，将植物大花金鸡菊干燥叶的粗粉用100%乙醇提取，提取液减压回收溶齐U，得乙醇提取浸膏；取浸膏加20倍量蒸馏水混悬后，加入石油醚萃取；回收溶剂后得石油醚萃取物；石油醚萃取物经娃胶柱色谱，依次用(100 — O) : (O — 100)或表不为100 0 —O :100体积比的石油醚+乙酸乙酯、(50 - O) : I或表示为50 :1 — O 1的乙酸乙酯+甲醇进行梯度洗脱，对获得的懼分再用体积比(20 — 1)(1 — O)或表不为20 :1 — I 0的石油醚+丙酮进行梯度洗脱得到本发明的活性物质。本发明所述化合物具有较强的抑制植物幼苗生长的活性。具体来说本发明所分离的化合物对夏至草幼苗胚根和胚轴的生长具有很强的抑制作用，可用于直接开发植物源除草剂或作为先导化合物开发仿生除草剂。
通过实施例和实验例对本发明进行更详细的说明。实施例I化合物谷甾醇的提取
取5000g大花金鸡菊叶干粉末，用100%乙醇溶液(8000mL)浸泡提取6次，时间为每次3d。期间每隔6小时搅拌一次。提取液合并后经真空抽滤和旋转蒸发回收溶剂，得到乙醇提取浸膏495g ;将乙醇提取浸膏480g加入20倍量蒸馏水混悬后，加入等容量石油醚萃取8次，回收溶剂后得石油醚萃取物浸膏135g ;取石油醚萃取物50g经硅胶柱色谱，依次用100:0、100:1、100:2、100:4、15:1、10:1、5:1、3:1、1:1 和 0:100 体积比的石油醚 + 乙酸乙酯混合溶剂和50:1、10:1、5:1和0:1体积比的乙酸乙酯+甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，得到ΑΓΑ8共8个馏分；对A5馏分用体积比20:1、10:1、5:1和I: O的石油醚+丙酮混合溶剂进行进一步的分离，得到β_谷甾醇，为无色针状结晶。对上述分离的化合物β -谷留醇进行结构鉴定，所得波谱数据如下
1H-NMR (500 MHz，CDCl3) 5 :5. 35 (1Η, s)，3. 50 (1Η, m)。13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 5:37.2 (C-1)，31. 5 (C-2)，78. 3 (C-3)，39. 7 (C-4)，140. 7 (C-5)，121. 6 (C-6), 31. 8 (C-7) ,31.8 (C-8), 50. O (C-9), 36. 4 (C-10), 21. O (C-Il)，39. 7 (C-12)，42. 2 (C—13)，56. 7 (C—14)，23. O (C-15)，28. 2 (C—16)，56. O (C—17)，11. 8 (C-18)，19. O (C-19)，36. I (C-20)，18. 7 (C—21)，25. 9 (C-22)，23. O (C-23)，45. 7 (C-24)，29. O (C—25)，19. 3 (C—26)，19. 8 (C—27)，33. 8 (C—28)，11. 9 (C—29)。实验例2 β -谷留醇及其每个提取阶段的除草活性 O实验材料
生菜、小麦、夏至草、稗 2)实验方法
琼脂法将受体植物种子经O. 2%次氯酸钠溶液浸泡15min后，用自来水冲洗数次并置流水下浸泡吸水3 5h左右，而后用蒸馏水洗涤数次，均匀摆放在带盖方盘内的吸水纸上，滴加蒸馏水至种子不漂浮，遮光置于全智能人工气候箱(HP1000GS-B型，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内发芽，待胚根(或种子根)达3 5mm时移植至混有各阶段提取物的O. 5%琼脂凝胶(事先配制IOOmL,并均匀分注至3个小烧杯中)上，各提取物的浸膏需事先分别用O. 5ml DMSO溶解后再加入至琼脂溶液中配制含毒基质，各处理(含空白对照)中DMSO最高浓度为O. 5%，且在配置后待琼脂凝固后再进行处理，在该浓度下对受体植物的生长没有不良影响。以不含提取物的O. 5%琼脂凝胶(含O. 5% DMS0)为空白对照。移植时先用尖嘴镊子在已凝固的琼脂表面插5个小孔，之后分别夹取胚根长度基本一致的预萌发受体植物种子，将胚根(或种子根)垂直由小口轻轻植入琼脂凝胶中。每烧杯5粒，重复3次。为防止光照对化合物及植物幼根生长的影响，将各烧杯放入人工气候箱遮光培养3 4d。其中，生菜和小麦均培养2d,夏至草和稗均培养4d。人工气候箱设置为14h (25°C )和IOh(20°C)的自动循环，箱内相对湿度为60%。待处理结束后，用电子游标卡尺分别测量受体植物幼苗胚根(或种子根)和胚轴(或胚芽鞘)的长度，以各植物胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)的实际生长量计算有效中量(EC5Q)。3)实验结果
从大花金鸡菊叶中提取分离谷留醇共分为乙醇提取、石油醚萃取、柱色谱分离等阶段。每个阶段的除草活性见表f 3。
表I大花金鸡菊叶乙醇提取物抑制夏至草和稗植物幼苗的EC5tl
一置信区间
受体植物 -
_胚根(种子根) 胚轴(胚芽鞘)
个:I·,'I: 0.159/(!. 12-0.21(!.595/0.46-0.76
稗(1.489/().39-(1.613.426/2.450.26
表2大花金鸡菊叶乙醇提取物的石油醚相对生菜、小麦、夏至草和稗幼苗生长的抑制
权利要求
1.一种大花金鸡菊叶中β-谷留醇的提取方法，其特征在于包括如下步骤 取大花金鸡菊叶干粉，用体积比100%乙醇浸泡提取5 - 7次，每次时间为2 — 4d，提取液合并后经真空抽滤和旋转蒸发回收溶剂，得乙醇提取浸膏，将乙醇提取浸膏加入10-20倍重量蒸馏水混悬后，加入等量石油醚萃取7 — 9次，回收溶剂后得石油醚萃取物浸膏，取石油醚萃取物经硅胶柱色谱，依次用石油醚+乙酸乙酯，以及乙酸乙酯+甲醇进行梯度洗脱，对获得的馏分再用石油醚+丙酮进行梯度洗脱得到β-谷甾醇。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于石油醚萃取物经硅胶柱色谱，依次用1000~0100体积比的石油醚+乙酸乙酯、50 :1 O :1的乙酸乙酯+甲醇进行梯度洗脱，对获得的馏分再用体积比20 :1 I :0的石油醚+丙酮进行梯度洗脱。
3.如权利要求I一 2任一所述的方法，其特征在于用浓度为100%乙醇提取6次，时间分别为3d，用石油醚萃取8次，并对石油醚萃取物进行柱色谱分离。
4.β_谷留醇的除草用途，所述的β_谷留醇是按权利要求I 一 2任一所述的方法提取的。
全文摘要
本发明涉及化学与农业领域，具体来说是提供一种大花金鸡菊叶中β-谷甾醇的提取方法，包括取大花金鸡菊叶干粉，用乙醇提取、石油醚萃取，经硅胶柱色谱，依次用石油醚+乙酸乙酯，乙酸乙酯+甲醇进行梯度洗脱，对获得的馏分用石油醚+丙酮进行二级梯度洗脱得到β-谷甾醇。本发明进一步提供β-谷甾醇的除草新用途。
文档编号A01N45/00GK102911236SQ201210326940
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月6日 优先权日2012年9月6日
发明者罗小勇, 郭凤 申请人:青岛农业大学