专利名称：用于桦褐孔菌发酵的培养基及发酵产多糖的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及一种用于桦褐孔菌发酵的培养基及发酵产多糖的方法与应用。
背景技术：
桦褐孔菌(JflOflOiW1S CvWiiJTOZ1S)又名白桦鸾、黑桦菌、桦菌、斜管纤孔菌,其生于白桦、银桦、榆树、赤杨等落叶树树皮下或砍筏后树木的枯干上，形成不育木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存长达6年，引起白桦、银桦、榆树、赤杨等的白腐。桦褐孔菌是生长在寒带的木腐菌，极耐寒，木材中的桦褐孔菌 菌丝体在_40°C都不会被冻死。桦褐孔菌主要分布于俄罗斯北部西伯利亚、远东地区和堪察加半岛、芬兰、波兰、日本北海道、Hokkaido、Olynets、Baltics、中国黑龙江大小兴安岭、吉林长白山及北美北部等北纬40° -50°间的寒冷地区，主要集中在北纬45° -50°地区。无法通过桦褐孔菌菌核外形来鉴别菌株亲缘关系远近。自16世纪以来，桦褐孔菌被赞誉为“西伯利亚灵芝”，在东欧、北美、俄罗斯、波兰、芬兰等民间被广泛利用，用来防治各种疑难杂症，比如各种癌症、心脏病、糖尿病等。俄罗斯北部人一直把它奉为上帝赐给苦难人类的一种神奇的礼物，日本研究人员称它为“万能药”，美国则把它列入“特殊的天然物质”，作为宇宙人的未来饮品。桦褐孔菌不仅能够显著抑制动物移植瘤的生长，还具有增强免疫、抗氧化、抗病毒、抗突变、抑制HIV感染及治疗糖尿病等多种作用。近年来，灵芝、香菇等各种药用菌多糖都已研发成功能食品，桦褐孔菌自然也不甘示弱，在临床应用上展示出了非常广阔的前景。许多研究学者把重点放在桦褐孔菌对癌症的防治方面，实验效果理想。因此，目前桦褐孔菌在临床上正应用于癌症的辅助治疗。此外，桦褐孔菌在其他疾病和保健方面的开发和应用也有了很大的发展。例如，通古斯-桦露是一种含桦褐孔菌中提取的与预防和治疗糖尿病相关的多种活性成分的天然平衡降糖饮品，可以使糖尿病人避免传统降糖药对肝肾等脏器严重损害的副作用，并获得国家发明专利。俄罗斯堪索莫乐斯基(Komsomlski)制药公司生产的桦褐孔菌精粉对糖尿病的治愈率也达到93%之高。桦褐孔菌也是食品工业中理想的天然抗氧化剂，可以在食品应用中成为起到防腐作用的食品添加剂。桦褐孔菌还可以作为饮料、调味品、饼干面包、香肠等加工类肉品、中药材等的辅助品和食用色素原料。将它添加在食品中，既能发挥桦褐孔菌对产品的功效，又能发挥桦褐孔菌对人体的功效，一举两得。真菌多糖科学的发展让21世纪成为了“真菌多糖的的世纪”，食药用菌的多糖已成为世界的研究热点，是目前最有开发前途的食药用品之一。桦褐孔菌作为一种稀有名贵的真菌，它最重要的价值体现在其药用上。桦褐孔菌是优异的药用菌，在抗肿瘤、治疗糖尿病等方面具有显著的功效。桦褐孔菌在俄罗斯芬兰的民间早已长期被广泛利用，但是在我国，桦褐孔菌的研究起步晚，且桦褐孔菌受气候环境影响大，不适合在气温较高的地方栽培，自然界中形成的野生子实体较稀少，在比例上每20000株桦树才有一株着生，且生长周期长，其只有在桦树上生长10年以上才有很好的药用效果。而目前我国桦褐孔菌的人工栽培仅仅取得有限的成功，重复性差，质量和性状不稳定，暂时还不能盲目进行大规模人工栽培。要想达到规模化或产业化人工培养，仍旧还有十分遥远的路要走，根本无法满足目前人类的需求。但也正因如此，给予了桦褐孔菌的研究及相关产品的开发广阔的发展前景和空间。由于菌核生长耗时等环境等方面的影响，使其菌核的获得受到限制，因此通过液体发酵获得其菌丝体，是获得桦褐孔菌多糖的主要手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于桦褐孔菌发酵的培养基及发酵产多糖的方法，本发明可显著提高桦褐孔菌的多糖含量，配方经济实用，条件和工艺简单易行，产生的多糖在延缓疲劳产生和加速疲劳消除中的作用。首先提供了一种用于桦褐孔菌发酵的培养基，所述培养基配方为玉米粉15-25g/L、葡萄糖 5-15g/L、麸皮 10-30g/L、酵母粉 3-7g/L、KH2P04 lg/L、MgS04 7H20 O. 5g/L、Vbi 0. 005g/L，水 IL，pH 值为 5-7。更优选地，所述培养基配方为玉米粉20g/L、葡萄糖15g/L、麸皮30g/L、酵母粉3g/L、KH2PO4 lg/L、MgSO4 7H20 O. 5g/L、VB1 0. 005g/L，水 IL，pH 值为 5-7。
一种利用上述的培养基发酵产多糖的方法，其特征在于发酵条件转速110-140r/min、温度26. 0-31. (TC、发酵ll_14d ;粗多糖提取步骤如下
(1)胞内粗多糖提取发酵液过滤或离心，收集菌丝体，烘干、粉碎，称取Ig菌丝体粉，加10-30ml蒸懼水，80-100°C下加热O. 5_3h,过滤,滤液旋转蒸发,浓缩至原体积的1/3,然后加入3倍体积酒精，静置24h，离心，收集絮状沉淀；
(2)胞外粗多糖提取将滤掉菌丝的发酵液收集，浓缩至原体积的1/5，加3倍体积酒精，静置，离心，收集絮状沉淀；
合并胞内胞外絮状沉淀，冻干，即得粗多糖，溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量。更优选地，发酵条件转速140 r/min、温度30°C、发酵12d。本发明还提供了桦褐孔菌发酵产生的多糖在制备抗疲劳药物中的应用。本发明具体实施例中采用的桦褐孔菌为桦褐孔菌obliquus)m￡10001，已于2012年7月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址武汉武汉大学，保藏号为CCTCC M 2012283。本发明的优点一是能显著提高桦褐孔菌的胞内、外多糖含量，经过优化培养基配方，优化发酵条件等步骤得到较高的胞内、外多糖含量；为桦褐孔菌的发酵特性、发酵产物的化学成分分析以及桦褐孔菌系列产品的深层次开发利用研究奠定一定的基础；为桦褐孔菌液体深层发酵和相关产品的生产开发提供科学合理的工艺；为桦褐孔菌的规范化发酵生产和工艺质量监控提供理论借鉴和技术指导，二是通过动物试验证明提取的桦褐孔菌多糖具有显著的增强动物耐力、延缓疲劳产生和加速疲劳消除的作用。
图I为标准葡萄糖曲线图。
具体实施例方式以下为具体的实施例中胞内外多糖的提取及含量测定
(I)胞内胞外粗多糖提取
胞内粗多糖提取烘干收集菌丝体后，粉碎，取Ig菌丝体粉加蒸馏水30ml，100°C烘干机煮3小时。真空过滤，之后旋转蒸发，浓缩至原体积的1/3。加3倍分析纯酒精(无水酒精)，静置24h。离心(10000r/min，4°C lOmin)，收集絮状沉淀。胞外粗多糖提取将用纱布过滤掉菌丝的发酵液收集，然后用真空旋转蒸发仪旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5，加3倍分析纯酒精(无水酒精)，静置24h。离心(lOOOOr/min, 40C IOmin),收集絮状沉淀。合并胞内胞外絮状沉淀，冻干5h_6h，即得粗多糖。(2)多糖含量测定一苯酚-硫酸法 ①0. 1%葡萄糖标准液的配制
精确称取105°c干燥至恒重的标准葡萄糖50. OOmg定容于IOOml容量瓶中，配制成浓度 为0. 5000mg/ml的葡萄糖标准母液；取上述母液IOml定容于50ml容量瓶中，配制成浓度为
0.1000mg/ml的葡萄糖标准液。②5%苯酹溶液的配制
精确称取25. 0005g重蒸酚，定容于500ml容量瓶中，配制成5. 0001%的苯酚溶液。③葡萄糖标准曲线制备
吸取葡萄糖标准液0. 0，0. 1，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，I. 0，I. 2，I. 4ml分别置于具塞试管中，分别加水至2. 0ml，再各加苯酚试液I. O ml摇匀，迅速滴加浓硫酸5. O ml，振荡混匀后，置于冰浴中20min，取出置于室温，另以蒸馏水2. O ml同上操作为空白对照，于490nm处测定吸光值，绘制葡萄糖曲线。以葡萄糖标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，如图I所示y=0. 7012x-0. 0063 (R2= O. 9995)。④样品多糖含量测定
分别称取5. Omg左右上述步骤(2)的粗多糖样品(一式三份)定容于25ml容量瓶中，分别吸取多糖样品液I. 0ml，按步骤③操作。实施例I
将不同的氮源(麸皮50g/L、黄豆粉50g/L、玉米粉50g/L、酵母粉50g/L、牛肉膏2g/L、酒石酸铵0. 32g/L、蛋白胨2g/L)，碳源(面粉20g/L、米粉20g/L、玉米粉20g/L、葡萄糖20g/L、甘露醇20g/L、蔗糖20g/L)，通过单因素筛选和正交试验(表1)，得到有利于菌丝体生长和明显提高胞内、外多糖含量的最佳液体发酵培养基配方玉米粉20g/L、葡萄糖15g/L、麸皮30g/L、酵母粉 3g/L、KH2PO4 lg/L、MgSO4 7H20 0. 5g/L、Vbi 0. 005g/L (发酵条件置于 25。。，转速为150r/min的摇床中，振荡培养IOd),优化前通用配方葡萄糖3%、蛋白胨0. 3%、酵母粉0. 2%、硫酸铵0. 2%、磷酸二氢钾0. 1%、硫酸镁0. 05%,pH自然，定容至IOOOmL,粗多糖含量仅为0. 253 g/100mL，而优化后粗多糖量达到0. 373g/100mL，多糖量比配方优化前提高 47. 4%ο表I培养基配方正交试验因素水平表
权利要求
1.一种用于桦褐孔菌发酵的培养基，其特征在于所述培养基配方为玉米粉15-25g/L、葡萄糖 5-15g/L、麸皮 10-30g/L、酵母粉 3_7g/L、KH2PO4 lg/L、MgSO4 7H20 O. 5g/L、Vbi0.005g/L，水 IL，pH 值为 5-7。
2.根据权利要求I所述的用于桦褐孔菌发酵的培养基，其特征在于所述培养基配方为玉米粉 20g/L、葡萄糖 15g/L、麸皮 30g/L、酵母粉 3g/L、KH2P04 lg/L、MgS04_ 7H20 O. 5g/L、Vbi 0.005g/L，水 IL，pH 值为 6。
3.利用权利要求I所述的培养基发酵产多糖的方法，其特征在于发酵条件转速110-140 r/min、温度26. 0-31. (TC、发酵ll_14d ;粗多糖提取步骤如下 (1)胞内粗多糖提取发酵液过滤或离心，收集菌丝体，烘干、粉碎，称取Ig菌丝体粉，加10-30ml蒸懼水，80-100°C下加热O. 5_3h,过滤,滤液旋转蒸发,浓缩至原体积的1/3,然后加入3倍体积酒精，静置24h，离心，收集絮状沉淀； (2)胞外粗多糖提取将滤掉菌丝的发酵液收集，浓缩至原体积的1/5，加3倍体积酒精，静置，离心，收集絮状沉淀； 合并胞内胞外絮状沉淀，冻干，即得粗多糖，溶于水用苯酚硫酸法测多糖含量。
4.根据权利要求3所述的利用培养基发酵产多糖的方法，其特征在于发酵条件转速140 r/min、温度 30。。、发酵 12d。
5.如权利要求3或4所述的利用培养基发酵产多糖的方法生产的多糖在制备抗疲劳药物中的应用。
全文摘要
本发明具体涉及一种用于桦褐孔菌发酵的培养基及发酵产多糖的方法与应用。所述培养基配方为玉米粉15-25g/L、葡萄糖5-15g/L、麸皮10-30g/L、酵母粉3-7g/L、KH2PO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L、VB10.005g/L，水1L，pH值为5-7，发酵条件转速110-140r/min、温度26.0-31.0℃、发酵11-14d；通过粗多糖提取，测定多糖含量，最后通过动物试验证明其多糖具有显著的增强动物耐力、延缓疲劳产生和加速疲劳消除的作用。本发明可显著提高桦褐孔菌的多糖含量和得率，配方经济实用，条件和工艺简单易行。
文档编号C05G1/00GK102898210SQ20121035108
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者郑金贵, 谢宝贵, 黄铃 申请人:福建农林大学