专利名称：一株暗褐网柄牛肝菌菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株暗褐网柄牛肝菌菌株，具体涉及一株适合制备液体菌种和袋料栽培的暗褐网柄牛肝菌菌株，属生物技术领域。
背景技术：
暗揭网柄牛肝菌Phlebopus portentosus隶属于小牛肝菌科Boletinellaceae,脉柄牛肝菌属Phlebopus。国外分布于泰国、斯里兰卡、越南、印度尼西亚、巴西、墨西哥、澳大利亚、新西兰等热带地区(Maria2007, Bandala2004, Watling2001, Barbaral987, Peglerl986，Heinemannl982)。国内主要分布在云南，广西、海南也有分布(臧穆等1986,2006 ;杨祝 良和臧穆2003)。暗褐网柄牛肝菌含有丰富的蛋白质、粗脂肪、总糖、粗纤维、多种矿质元素和氨基酸，是一种营养价值较高的食用菌(R. Sanmee2003，张春霞等2010)，深受产地消费者喜爱的美味食用菌。优良的菌种，是决定暗揭网柄牛肝菌广量与质量的提闻和稳定的关键。暗揭网柄牛肝菌菌株的获得主要是利用野生暗褐网柄牛肝菌子实体进行分离、纯化，然后直接用于暗褐网柄牛肝菌的液体菌种和固体菌种的培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一株适合制备液体菌种和袋料栽培的暗褐网柄牛肝菌菌株。本发明从云南省西双版纳州景洪市野生牛肝菌组织分离获得，对其进行了形态学、生理生化性质和ITS-RNA分析，该菌株命名为暗褐网柄牛肝菌(Phlebopusportentosus) PP10003,属于小牛肝菌科 Boletinellaceae,脉柄牛肝菌属 Phlebopus ,于2012年6月21日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6240。本发明的暗褐网柄牛肝菌(Phlebopus portentosus) PP10003的主要形态特征和生理生化性质为该菌株的菌落在Ml斜面培养基上培养圆形或近圆形，菌丝褐色，浓密。在光学显微镜下菌丝无色透明，多分支，菌丝直径约3 μ m,锁状联合明显。本发明按常规方法用常规设备制备。即将暗褐网柄牛肝菌(Phlebopusportentosus) PP10003扩大发酵培养后得到。本发明的优点在于利用该菌株制备的优良液体菌种发菌快，菌球整齐，污染少；用于袋料栽培，其出菇培养时间短，出菇整齐，子实体产量高；能实现规模化生产暗褐网柄牛肝菌，具有较高的应用价值。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
本发明是这样实现的I、菌株的分离与保藏。在超净工作台内，将采来的野生暗褐网柄牛肝菌子实体组织块接种到Ml试管培养基斜面上，于28°C -30°C下暗培养30天，每天观察记录，剔除污染的试管，挑选出长势良好的菌株，获得暗褐网柄牛肝菌试管母种。切取菌丝块置于无菌蒸馏水中15°C保存。2、菌株PP10003的鉴定分子鉴定用CTAB法提取人工子实体PP10003基因组DNA，并以0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。用于真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)由华大基因合成。以提取到的PP10003基因组DNA为模板，以ITS1，ITS4为引物(用dH20稀释至IOmM)进行 PCR 扩增，PCR 扩增体系10 X PCR buffer 5μ L ；10mM dNTP mix 4yL;Taq 酶 0· 5 μ L ;引物各2 μ L ；DNA模板2 μ L ;加超纯水补足至50 μ L0充分混合均匀后，于PCR仪中进行扩增反应,PCR 反应条件如下94°C 4min ；94°C Imin54°C Imin72°C 2min 35 个循环;72°C IOmin; 12°C °o。PCR扩增产物经I. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒回收600bp大小的片段，与T-载体(Takara pMD_18T)，转化大肠杆菌E. coli DH5a感受态细胞，然后在含有Amp，IPTG，X-Gal的LB平板上进行蓝白斑筛选，并进行菌落PCR筛选出阳性克隆，提取质粒送至华大基因完成测序。所得的测序结果经过人工校正后获得一段666bp的序列I GAGGGTGATG CTAGGTGGGA CGACTGTCGC TGGCATATAT OGTATGCATG TGCACGT0GA61 AACCTTGGCT OGCCCCTCTT CCTTT0GG0G TAATGCTTAA TACACCTGTG AACCTGTTGT121 AGGTTGTTCC CCTAOGAGCA GTAGGAGGAC GATCTATGTC TTTCCATCAC ACTACATGTA181 TGTCTACAGA ACGTTGAAAG TOGTCTCGAC CCTTGACGGG GTTGGAOGCA AAACTATAAT241 ACAACTTTCA GCAAOGGATC TCTTGGCTCT CGCATOGATG AAGAACGCAG CGAATTG0GA301 TAAGTAATGT GAATTGCAGA TTTTCAGTGA ATCATOGAAT CTTTGAACGC ACCTTGCGCT361 CCTTGGTATT CCGAGGAGCA TGCCTGTTTG AGTGTCATCG AATTCTCAAC CATGTCTTGA421 TGTTAACTTT OGAGGCATGG CTTGGACTTG GGAGCTTTGC TGGTTGGACC CCCCTCTCTT481 CGAGGGGGGA ATGTCAGCTC TCCTCAAAAG CATTAGCAAA AGGGACGTGT T0GTCGCATG541 AACTGACGGC CTTCGAOGTG ATAATGATOG TOGTGGCTGG AGGGAAAAGT GTGATGG0GA601 AGGTCTGTCC TAGCTTCTAA TCAAAGGCGA GGGGCTTGTG TCACGCATGC CCTCTGTCTT661 ATCGAA包括ITSl区，5. 8S区及ITS2区，将这段序列提交GeneBank,应用BLAST (www.ncbi. nlm. nih. rov/BLAST)进行同源性搜索,与数据库中各菌株序列进行相似性分析,与数据库中已有的Phlebopus portentosus的各个菌株相应序列一致性(Identities)都到达到 99 100%,该菌株鉴定为 Phlebopus portentosus。3、暗褐网柄牛肝菌液体菌种培养在超净工作台中将暗褐网柄牛肝菌PP10003斜面菌种切碎，菌块小于2 mm，将菌块接种于装有300ml的Ml液体培养基500ml三角瓶中，每只斜面种可接种至10瓶，将三角瓶放在125r/min回旋式摇床中振荡培养，温度为28°C，培养8天后即得到液体菌种。4、暗揭网柄牛肝囷袋料栽培
a.将配置好的固体培养基分装于聚丙烯(规格17 cm X33 cm)菌种袋中，每袋装800g IOOOg栽培培养基，121°C灭菌60分钟，待冷却后备用。b.将培养好的液体菌种接种于a.步骤灭菌后的栽培袋中，每瓶液体种可接种8 10袋，接种后将培养袋置于26 28°C的培养室暗光培养40 60天，菌丝体长满菌袋。c.覆土培养出菇 将制备好的覆土材料覆盖在培养好的菌袋表面，覆土层厚4 6 Cm，置于温度为28 30°C的菇房里，菇房的相对湿度为80 90%，光照度为60 700LX，保持覆土层表面湿润，覆土后10 15天，子实体发育成熟。
权利要求
1.一株暗褐网柄牛肝菌菌株，其特征在于暗褐网柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)PP10003菌株，已于2012年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6240。
全文摘要
本发明涉及一株暗褐网柄牛肝菌菌株，具体涉及一株适合制备液体菌种和袋料栽培的暗褐网柄牛肝菌菌株，属生物技术领域。暗褐网柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)PP10003菌株，已于2012年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6240。本发明的优点在于利用该菌株制备的优良液体菌种发菌快，菌球整齐，污染少；用于袋料栽培，其出菇培养时间短，出菇整齐，子实体产量高；能实现规模化生产暗褐网柄牛肝菌，具有较高的应用价值。
文档编号A01G1/04GK102870597SQ20121037046
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者何明霞, 张春霞, 曹旸, 刘静, 纪开萍, 王文兵, 高锋, 周茂, 伍英, 王云 申请人:云南省热带作物科学研究所