专利名称：一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，具体地说，涉及一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法。
背景技术：
互叶白千层(Melaleuca leu cadendron)是桃金娘科(Myrtaceae)白千层属的一种长绿小乔木，从其新鲜枝叶和树干提取的茶树油，是一种强效的抗菌剂及免疫激活剂，是公认优良的天然保健医药材料，广泛应用于制药、日化、食品、香料等行业。互叶白千层具有速生、树干直、萌发力强等特点，定植后又可以多次收获，具有极高的的经济效益，目前已在广西、广东、福建等多个省(区)推广种植。目前，互叶白千层主要通过种播和扦插进行种苗繁殖，繁殖系数较低，因此建立高繁殖系数的互叶白千层组培技术对解决缺乏优质互叶白千层种苗的现状具有重要的实践意义。褐化现象与菌类污染和玻璃化并称植物组织培养的三大难题，是指植物组织培养过程中，培养物在诱导脱分化或再分化时，自身组织由其表面向培养基释放褐色物质，导致培养基逐渐变褐色，最终致培养物死亡的现象。研究证明，褐化不是基因型病变，而是培养物被切割后，切口附近的细胞受到伤害，其分隔效应被打破，酚类化合物向外分泌，酚氧化酶释放或合成并发生氧化反应形成褐色醌类物质，毒害培养物并致其死亡。褐化现象的发生与植物的种类及基因型、外植体的生长部位及生理状态、营养条件、激素水平有关，改善培养条件可缓解褐化的程度。目前，防止褐化的主要措施是在培养基中添加防褐剂，如抗氧化的抗坏血酸，半胱氨酸和柠檬酸以及具吸附作用的活性炭，但这些措施只能减轻褐化的程度，并不能彻底解决褐化问题。应用研究表明，适宜浓度的稀土元素能促进植物细胞对养份的吸收、转化和利用，能清除植物器官生长环境及体内的活性氧，能调节细胞内外的水平衡。此外，稀土元素具有细胞分裂素作用，能促进植物器官快速生长。目前有关稀土元素在促进互叶白千层丛生芽及防止继代培养褐化的应用方面尚未见有报道。因此，本发明提供了一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种简便、经济，且可减少培养基中的激素用量的促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法。本发明人用含有适量浓度稀土元素的培养基对互叶白千层不定芽进行丛生芽增殖培养的实验证明，由于稀土元素具有激素样的作用以及促进植物细胞对养份的吸收利用，从而促进互叶白千层丛生芽的增殖，并可部分替代2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)或完全替代N6-苯甲酰基酰嘌呤出-BA)。此外，稀土元素能清除植物器官生长环境及体内的活性氧，从而抑制了酚类物质的氧化以及酚氧化酶释放或合成，进而实现了本发明的目的。
本发明的促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法，包括以下的步骤(I)配制培养基在改良MS培养基中添加3-10g/L的琼脂，0-3. Omg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸(2,4-D), 0-3. Omg/L N6-苯甲酰基酰嘌呤(6_BA),0. l_30mg/L的单一或混合稀土化合物，调节PH5. 4 5. 8，并进行高压灭菌处理；(2)丛生芽增殖培养将互叶白千层不定芽接入上述培养基中，在温度(25±2) °C，光照为1500-30001ux的条件下，每天光照12小时，培养20-30天。步骤(I)所用的改良MS培养基为10g/L葡萄糖代替蔗糖的MS培养基；步骤(I)所用的单一或混合稀土元素的化合物包括镧、铈、钕、镨、钐的硝酸盐和
氧化物；步骤(2)所述的互叶白千层不定芽为由早春即将萌动的休眠芽器官诱导分化而来的丛生芽。目前国内尚未有关于稀土元素促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的专利和文献报道，而本发明具有简单、易行、经济的特点，可大幅度地提高互叶白千层繁殖系数和有效地防止继代培养褐化现象的发生。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例一I.配制下列四种培养基对照培养基CK :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. 0mg/L6_BA，O. 01mg/L 2，4-D ；培养基A :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA，再加入3mg/L硝酸钕[Nd(NO3)3]；培养基B :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，0. 01mg/L 2，4-D，再加入3mg/L硝酸钕[Nd(NO3)3]；培养基C :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. 0mg/L 6-BA，0. 01mg/L2，4-D ；再加入lmg/L硝酸钕[Nd(NO3)3]。2.将互叶白千层不定芽接入上述四种培养基中，在温度26°C，光照为20001UX的条件下，每天光照12小时，培养25天，其结果如下在对照培养基CK中培养，丛生芽增殖了 I. 8倍，到培养第15天时，继代培养褐化率为25%，到培养第25天时，继代培养褐化率为33% ；在培养基A中培养，丛生芽增殖了 6. 5倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基B中培养，丛生芽增殖了 7. 2倍，继代培养可保持其生长质量，继代培养第20天时，褐化发生率在5%以下；在培养基C中培养，丛生芽增殖了 8. 4倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化。实施例二
I.配制下列四种培养基对照培养基CK :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. 0mg/L6_BA，O. O lmg/L 2，4-D ；培养基A :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA,再加入5mg/L硝酸镧[La(NO3)3]；培养基B :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，O. O lmg/L 2，4-D，再加入5mg/L硝酸镧[La(NO3)3]；培养基C :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入2mg/L硝酸镧[La (NO3) 3]。2.将互叶白千层不定芽接入上述四种培养基中，在温度25°C，光照为25001ux的 条件下，每天光照12小时，培养27天，其结果如下在对照培养基CK中培养，丛生芽增殖了 2. I倍，到培养第15天时，继代培养褐化率为27%，到培养第25天时，继代培养褐化率为34% ；在培养基A中培养，丛生芽增殖了 5. 9倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基B中培养，丛生芽增殖了 6. 2倍，继代培养可保持其生长质量，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基C中培养，丛生芽增殖了 8. 5倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化。实施例三I.配制下列四种培养基对照培养基CK :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. 0mg/L6_BA，O. O lmg/L 2，4-D ；培养基A :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA,再加入lmg/L氧化镨(III，IV) [Pr6O11 (III，IV)]的硝酸溶液；培养基B :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，0.01mg/L 2，4_D，再加入lmg/L氧化镨(III，IV) [Pr6O11 (III，IV)]的硝酸溶液；培养基C :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入0. 5mg/L氧化镨(III，IV) [Pr6O11 (III，IV)]的硝酸溶液。2.将互叶白千层不定芽接入上述四种培养基中，在温度25°C，光照为30001ux的条件下，每天光照12小时，培养20天，其结果如下在对照培养基CK中培养，丛生芽增殖了 2. 9倍，到培养第55天时，继代培养褐化率为11%，到培养第20天时，继代培养褐化率为26% ；在培养基A中培养，丛生芽增殖了 6. 5倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基B中培养，丛生芽增殖了 8. 4倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化。在培养基C中培养，丛生芽增殖了 8. 7倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化。
实施例四I.配制下列四种培养基对照培养基CK :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. 0mg/L6_BA，O. O lmg/L 2，4-D ；培养基A :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA,再加入5mg/L硝酸铈铵[(NH4)Ce(NO3)6]；培养基B :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，O. O lmg/L 2，4-D，再加入5mg/L硝酸铈铵[(NH4)Ce(NO3)6]；培养基C :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入3mg/L硝酸铈铵[(NH4) Ce (NO3) 6]。
2.将互叶白千层不定芽接入上述四种培养基中，在温度25°C，光照为15001UX的条件下，每天光照12小时，培养30天，其结果如下在对照培养基CK中培养，丛生芽增殖了 I. 7倍，到培养第15天时，继代培养褐化率为25%，到培养第25天时，继代培养褐化率为33% ；在培养基A中培养，丛生芽增殖了 6. 5倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基B中培养，丛生芽增殖了 5. 5倍，继代培养可保持其生长质量，继代培养第20天时，褐化发生率在5%以下；在培养基C中培养，丛生芽增殖了 8. 7倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化。实施例五I.配制下列四种培养基培养基CK (对照组)在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. 0mg/L6_BA，0· Olmg/L 2，4-D ；培养基A :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA，再加入O. 5mg/L硝酸钐[Sm(NO3)3]；培养基B :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，O. O lmg/L 2，4_D，再加入O. 5mg/L 硝酸钐[Sm(NO3)3]；培养基C :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入0. 2mg/L硝酸衫[Sm (NO3) 3]。2.将互叶白千层不定芽接入上述四种培养基中，在温度27°C，光照为20001ux的条件下，每天光照12小时，培养30天，其结果如下在对照培养基CK中培养，丛生芽增殖了 2. 9倍，到培养第15天时，继代培养褐化率为20%，到培养第25天时，继代培养褐化率为35% ；在培养基A中培养，丛生芽增殖了 7. 9倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基B中培养，丛生芽增殖了 7. 4倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基C中培养，丛生芽增殖了 9. 2倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化。实施例六I.配制下列四种培养基培养基CK (对照组)在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. 0mg/L6_BA，O. Olmg/L 2，4-D ；培养基A :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA，再加入O. 2mg/L稀土混合物(Re)的硝酸溶液；培养基B :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，O. O lmg/L 2，4_D，再加入O. 2mg/ L稀土混合物(Re)的硝酸溶液；培养基C :在改良MS培养基中添加7g/L的琼脂，I. Omg/L 6-BA, O. 01mg/L2，4_D ；再加入0. 05mg/L稀土混合物(Re)的硝酸溶液；在上述中的Re = 60. I % La (NO3) 3+20· 9 % (NH4) Ce (NO3) 3+9· O % Pr60n+6. 8 %Nd(NO3)3+3. 2% Sm(NO3)3，w/w。2.将互叶白千层不定芽接入上述四种培养基中，在温度25°C，光照为15001UX的条件下，每天光照12小时，培养20天，其结果如下在对照培养基CK中培养，丛生芽增殖了 I. 5倍，到培养第5天时，继代培养褐化率为15%，到培养第20天时，继代培养褐化率为20% ；在培养基A中培养，丛生芽增殖了 8. 4倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化；在培养基B中培养，丛生芽增殖了 8. 8倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化； 在培养基C中培养，丛生芽增殖了 10倍，继代培养可保持其生长质量，整个培养过程基本上不发生褐化。
权利要求
1.一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)配制培养基在改良MS培养基中添加3-10g/L的琼脂，0-3.Omg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0-3. Omg/L N6-苯甲酰基酰嘌呤(6_BA)，0. l_30mg/L的单一或混合稀土化合物，调节PH5. 4 5. 8，并进行高压灭菌处理； (2)丛生芽增殖培养将互叶白千层不定芽接入上述培养基中，在温度(25±2)°C，光照为1500-30001ux的条件下，每天光照12小时，培养20-30天。
2.根据权利要求I所述的一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法，其特征在于所述的改良MS培养基为10g/L葡萄糖代替蔗糖的MS培养基。
3.根据权利要求I所述的一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法，其特征在于所述的单一或混合稀土化合物包括镧、铈、钕、镨、钐的硝酸盐和氧化物。
4.根据权利要求I所述的一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法，其特征在于所述的互叶白千层不定芽为由早春即将萌动的休眠芽器官诱导分化而来的丛生芽。
全文摘要
本发明涉及一种促进互叶白千层丛生芽增殖及防止继代培养褐化的方法。该方法将互叶白千层不定芽接种在含有稀土元素、分裂素和生长素的改良MS培养基上进行增殖培养，可有效地促进丛生芽增殖以及防止继代培养褐化现象的发生。所述单一或混合稀土元素化合物包括镧、铈、钕、镨、钐的硝酸盐和氧化物，且所述稀土元素可减少或替代培养基中的生长素或细胞分裂素。
文档编号A01H4/00GK102870677SQ20121038220
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者莫昭展, 梁海清, 朱宇林, 黄肈宇 申请人:玉林师范学院