专利名称：一种柳杉组织培养快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养繁殖技术领域，具体涉及ー种柳杉组织培养快速繁殖方法，特别是一种以柳杉茎段为外植体材料，用自制培养基先诱导柳杉产生不定芽，进而诱导生根获得再生植株。
背景技术：
柳杉)为杉科柳杉属D./ ),别名孔雀杉，乔木，高达4m，胸径可达2m多；树皮红棕色，纤维状，裂成长条片脱落；大枝近轮生，平展或斜展；小枝细长，常下垂，绿色，枝条中部的叶较长，常向两端逐渐变短。叶钻形略向内弯曲，先端内曲，四边有气孔线，长fl. 5cm，果枝的叶通常较短，幼树及萌芽枝的叶长达2. 4cm。柳杉是我国重要的用材树种之一。在我国柳杉主要分布于福建、浙江、江西等省。由于受经济利益的驱使，近年来柳杉资源遭受严重破坏，再加上酸雨、大气污染的危害和病虫侵害，目前大径柳杉已屈指可数。目前柳杉以种子繁育为主，扦插也可采用，但通常发芽率、合格苗率低。对其繁殖的研究也主要对实生苗繁育技术的研究。因此，利用生物技术方法进行人工快速繁殖，对柳杉的资源保护有重要意义。
张翠萍(2008)初歩研究了其组织培养快速繁殖技术，但该研究以柳杉种胚为外植体，不适合具优良基因型柳杉个体的繁殖培养，且在实验中只采用了 MS为基本培养基，对外源激素的添加只采用了单因素设计，未对其他基本培养基和组合激素进行选择培养实验。本申请人选取优良基因型柳杉茎段作为外植体材料，通过实验选择DCR为最适基本培养基，对外源激素的添加进行了多因素设计，并添加活性炭等，为柳杉的组织培养快速繁殖提供了有效途径。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供ー种组织培养快速繁殖柳杉的方法。技术方案为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为
ー种柳杉组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤
(1)取柳杉外植体茎段，接种于诱导不定芽培养基，诱导培养产生不定芽；其中，诱导不定芽培养基为=DCR + 0. I 2. Omg/L 6-BA (6-苄基嘌呤)+ 0. I 2. Omg/L IBA (吲哚丁酸)+0. 5 5. Og/L AC (活性炭)+ 0. 001 0. 01mg/L TDZ (噻苯隆)+30. Og/L 蔗糖；
(2)生根培养采用两阶段发根先将已伸长且生长较健壮的嫩芽放入生根培养基1，进行2 15d暗培养后，放入光照下培养5 30d ;然后转接于生根培养基2，继续培养至生根；其中，生根培养基 I 为1/2DCR + 0. I 2. 0mg/L NAA + 0. I 2. 0mg/L IBA + 0. I I. 0mg/L6-BA+1. 0 10. 0g/L AC + 10. 0 30. 0g/L 蔗糖，生根培养基 2 为DCR+0. I I. 0mg/L NAA +0. I I. 0mg/L 6-BA+0. 5 5. 0g/L AC+30. 0g/L 蔗糖。
步骤(I)中，所述诱导不定芽培养基为DCR + I. Omg/L 6-BA + O. 5mg/L IBA +0. Olmg/L TDZ + 3. Og/L AC+30g/L 蔗糖。步骤(2)中，所述生根培养基I 为1/2DCR + 2. Omg/L NAA + I. Omg/L IBA +
0.5mg/L 6-BA + 0. 5mg/L IBA + 5. Og/L AC + 25g/L 蔗糖。步骤(2)中，所述生根培养基2 为DCR+0. 5mg/L NAA + O. 5mg/L 6-BA + 3. Og/LAC + 30. Og/L 鹿糖。步骤(2)中，在所述的1/2DCR培养基配方中，大量元素比常规DCR减少1/2的量。步骤(2)中，所述光照下的光照时间为14 16h，光照强度为120(Tl300LUX，温度为 25 28。。。该方法，选取优良基因型柳杉茎段作为外植体材料，通过以DCR为最适基本培养基，对外源激素的添加进行了多因素设计，并添加活性炭等，为柳杉的组织培养快速繁殖提供了有效途径。有益效果与现有技术相比，本发明的显著优点是以具优良基因型柳杉个体茎段为外植体，以DCR为基本培养基，附加不同种类、不同浓度的植物生长调节剂和活性炭诱导芽增殖和诱导生根，通过本方法，嫩芽增殖系数达到5. 7以上，生根率为80%以上。培养周期短，繁殖量大，有利于规模化生产。
图I诱导获得的柳杉不定芽；
图2诱导生根后形成柳杉完整植株。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例I
选取生长健壮的柳杉茎段，剪去茎段上的针叶，将茎段剪成4cm左右，流水冲洗f 2h，置于75%乙醇中灭菌30s，再用50%的84消毒液(内含少量吐温_20，每50mL加一滴)消毒lOmin，无菌水冲洗8次，再将茎段剪成2cm左右，接种于诱导不定芽培养基，光照诱导培养8d后开始产生不定芽；不定芽产生后，选取生长教健壮的嫩芽转接于生根培养基I，先暗培养2 15d后，放入光照下培养2 30d后，再转接于生根培养基2中，约IOd开始生根。其中，诱导不定芽培养基为DCR + 0. Γ2. 0mg/L 6-BA + 0. Γ2. 0mg/L IBA + 0. 00Γ0. Olmg/L TDZ + 0. 5 5. 0g/L AC ;生根培养基 I 为1/2DCR + O. I 2. 0mg/L NAA + O. I 2. Omg/L IBA + O. Γθ. 5mg/L 6-BA + I. (TlO. Og/L AC + 10. 0 30· Og/L 蔗糖，生根培养基 2 为DCR+0. Γ1. 0mg/L NAA + O. Γ . 0mg/L 6-BA+O. 5 5. 0g/LAC+30. Og/L 蔗糖。实施例2
按实施例I所述相同步骤重复进行实验，在各个诱导培养阶段，分别添加不同剂量的活性炭(0. 5^10. 0g/L)，其中，诱导不定芽培养基中添加活性炭0. 5^5. 0g/L,生根培养基I中添加活性炭I. (TlO. 0g/L,生根培养基2中添加0. 5^5. 0g/L，可明显促进柳杉生长健壮，叶绿，有效防止幼苗黄化褐化的发生，并在诱导生根阶段促进生根。实施例3
按实施例I所述相同步骤重复进行实验，在诱导生根阶段，所采用的1/2DCR培养基中的大量元素比常规DCR减少1/2的量。结果见表1，能明显促进诱导生根，使生根率提高到85%。表I培养基中大量元素对柳杉生根的影响
权利要求
1.ー种柳杉组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取柳杉外植体茎段，接种于诱导不定芽培养基，诱导培养产生不定芽；其中，诱导不定芽培养基为DCR + 0. I 2. Omg/L 6-BA + 0. I 2. Omg/L IBA + 0. OOTO. 01mg/L TDZ +0.5 5. Og/L AC+30. Og/L 蔗糖； (2)生根培养采用两阶段发根先将已伸长且生长较健壮的嫩芽放入生根培养基1，进行2 15d暗培养后，放入光照下培养5 30d ;然后转接于生根培养基2，继续培养至生根；其中，生根培养基 I 为1/2DCR + 0. I 2. 0mg/L NAA + 0. I 2. 0mg/L IBA + 0. I I. 0mg/L6-BA+1. 0 10. 0g/L AC + 10. 0 30. 0g/L 蔗糖，生根培养基 2 为DCR+0. I I. 0mg/L NAA +0.I I. 0mg/L 6-BA+0. 5 5. 0g/L AC+30. 0g/L 蔗糖。
2.根据权利要求I所述的柳杉组织培养快速繁殖的方法，其特征在于步骤(I)中，所述诱导不定芽培养基为DCR + I. 0mg/L 6-BA + 0. 5mg/L IBA + 0. Olmg/L TDZ + 3. Og/LAC+30. Og/L 鹿糖。
3.根据权利要求I所述的柳杉组织培养快速繁殖的方法，其特征在于步骤(2)中，所述生根培养基 I 为1/2DCR + I. 0mg/L 6-BA + 0. I 2. 0mg/L IBA + 2. 0mg/L NAA + 5. Og/L AC + 10. 0 30. Og/L 蔗糖。
4.根据权利要求I所述的柳杉组织培养快速繁殖的方法，其特征在于步骤(2)中，所述生根培养基 2 为DCR+0. I I. 0mg/L NAA + 0. I I. 0mg/L 6-BA + 3. 0g/L AC + 30. 0g/L蔗糖。
5.根据权利要求I或4所述的柳杉组织培养快速繁殖的方法，其特征在于步骤(2)中，在所述的1/2DCR培养基配方中，大量元素比常规DCR减少1/2的量。
6.根据权利要求I所述的柳杉组织培养快速繁殖的方法，其特征在于步骤(2)中，所述光照下的光照时间为14 16h，光照强度为120(Tl300LUX，温度为25 28°C。
全文摘要
本发明公开了一种柳杉组织培养快速繁殖方法，包括取柳杉外植体茎段，接种于诱导不定芽培养基DCR＋0.1~2.0mg/L6-BA＋0.1~2.0mg/LIBA＋0.5~5.0g/LAC＋0.001~0.01mg/LTDZ+30g/L蔗糖，诱导培养产生不定芽；生根培养采用两阶段发根，即先放入生根培养基1为1/2DCR＋0.1~2.0mg/LNAA＋0.1~2.0mg/LIBA+0.1~1.0mg/L6-BA+1.0~10.0g/LAC＋10.0~30.0g/L蔗糖，先进行2~15d暗培养后，放入光照下培养5~30d后，转接于生根培养基2为DCR+0.1~1.0mg/LNAA＋0.1~1.0mg/L6-BA+0.5~5.0g/LAC+30.0g/L蔗糖。通过本方法，嫩芽增殖系数达到5.7以上，生根率为80%以上。培养周期短，繁殖量大，有利于规模化生产。
文档编号A01H4/00GK102860260SQ20121038338
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者诸葛强, 沙玉清, 徐立安, 王立科, 王章荣, 王福生 申请人:南京林业大学