专利名称：猪β防御素2喷干粉，饲料添加剂，预混料及配合料的制作方法
技术领域：
本发明属于动物饲料领域，具体涉及一种猪β防御素2喷干粉及含有其的饲料添加剂，预混料及配合料。
背景技术：
近年来，抗生素在畜产品中大量使用，其残留可能使动物病原菌产生耐药性，耐药基因可通过转化、转导、接合、易位等方式在细菌之问传播，也可能通过食物链等途径扩散耐药基因，使细菌的耐药基因在人群中细菌、动物群中细菌和生态系统中细菌间互相传递，由此导致致病菌的耐药性增加而引起人类和动物感染性疾病的治疗失败,对人类的健康产生危害。某些抗生素走进动物体内后最终以原型或代谢物形式主要经粪便排泄到外界环 境，造成环境污染，当这些物质超过环境自净能力时，就会对生态环境中的微生物产生影响，增加环境中的耐菌株。抑制或杀灭了有益菌，破坏了肠道内的菌群平衡。由微生物生产的抗菌类小肽物质是通过作用于细菌细胞膜而起作用的，作为添加剂属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型饲料添加剂。但作为蛋白小肽，要使抗菌肽能够真正在养殖生产中大量应用，必须解决产量、活性、稳定性、功能性、成本、生产工艺方法等多方面问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种抑菌肽喷干粉及含有其的饲料添加剂，预混料及配合料。首先，本发明提供一种猪β防御素2喷干粉的制备方法，其为发酵携带猪β防御素2基因的酵母基因工程菌株，取上清液进行超滤，超滤液依次添加保护剂、壁材和载体，喷雾干燥。本发明中，对酵母基因工程菌的菌株并没有特别的限定，只要携带有猪β防御素2基因，并能正常表达出猪β防御素2的酵母菌株都可以用于本发明。其中，超滤截留分子量为3KDa 10KDa的超滤液。在本发明的一个实施方案中，所述保护剂包括质量体积百分比3 8%的脱脂奶粉、质量体积百分比O. 5^2. 5%的谷氨酸钠以及质量体积百分比O. Γ2. 0%的乳糖、海藻糖、蔗糖中的一种或多种。在本发明的另一个实施方案中，所述壁材选自明胶、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、海藻酸钠中的一种或多种，添加量为质量体积百分比5 10%。在本发明的另一个实施方案中，所述载体选自石粉以及玉米淀粉、麦芽糊精、玉米芯粉、麦麸粉中的一种或两种，添加量为质量体积百分比20-25%。其中，喷雾干燥的条件为进风温度16(Tl80°C，进料速度l(T30ml/min，出风温度65 85。。。
进一步的，本发明提供有所述的制备的猪β防御素2喷干粉。更进一步的，本发明还提供含有所述所述喷干粉的饲料添加剂，优选的该饲料添加剂为猪用，更优选的，为仔猪用。更进一步的，本发明还提供含有所述饲料添加剂的预混料，优选的，该预混料为猪用，更优选的，为仔猪用。更进一步的，本发明还提供含有所述预混料的配合料，优选的，该配合料为猪用，更优选的，为仔猪用。本发明提供的具有抑菌活性的毕赤酵母表达的猪β防御素2喷干粉，采用喷雾干燥法与微胶囊成囊技术结合，使猪β防御素2的活性得以最大程度保存，而且，经过体外模拟人工胃液而不被破坏，释放出来的猪β防御素2具有良好的活性，能显著提高仔猪的采食量，促进饲料利用率，提高仔猪的生长速度和日增重，大幅度降低腹泻率，使猪只的生产·性能得到很大的提高。本发明提供的猪防御素2喷干粉的制备方法简单，所需设备简单，成本低，适宜大规模生产。
图I所示为超滤液、喷干粉抑菌活性比较。图2所示为超滤液、喷干粉耐胃酸试验。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I具有抑菌活性的毕赤酵母蛋白多肽猪β防御素2的制备I、毕赤酵母发酵液的制备I)平板培养复壮将携带猪β防御素2基因的毕赤酵母(根据解民等，重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定，2010，中国兽医学报，20 (8)，1028-1031公开的方法进行制备)菌种接种于YPD平板培养基上，于28°C培养48h，使毕赤酵母复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，28°C培养48h ；2) —级种子的制备将步骤I)培养的毕赤酵母菌种转接装有300mlYPD液态培养基2L摇瓶里，28°C摇床培养48h，至对数后期，得一级种子；3) 二级种子的制备将步骤2)制备的一级种子转接到装有80LYPD种子培养基的100L种子罐中，温度28°C，转速400rpm，培养24h，得二级种子液。4)毕赤酵母发酵液的制备将步骤3)制备的二级种子液按照5%的接种量接种到
O.5 O. 8m3发酵培养基的发酵罐中，温度31。。，转速400rpm，罐压O. 05Mpa，通风比:I :0. 6，培养48h，收集发酵液。发酵毕赤酵母时用的发酵培养基由以下成分组成葡萄糖18g/L,蛋白胨20g/L,牛肉膏3g/L，酵母浸粉8/L，pH为7. 2。2、毕赤酵母蛋白多肽猪β防御素2的制备I)上清液制备将I中得到的发酵液经离心机3000rpm离心20min，去除菌体收集上清，再次5000rpm离心15min，去除菌体收集上清液，待用。2)超滤选择3. 5KD超滤膜,4000rpm,离心40min,收集超滤液。
3)保护剂的添加将脱脂奶粉、谷氨酸钠、乳糖按照10:1:1的比例进行预先混合，以超滤液的8%进行添加，充分混合。4)壁材制备及添加将自来水升温至40°C 50°C，边开搅拌边慢慢加入明胶，使其完全溶解配成10%的溶液，按超滤液的I. 5%加入配好的明胶溶液搅拌lOmin。5)加入25%的载体，设置喷雾干燥塔进出风温度为165°C /85°C，雾化器转动频率为35Hz，进料速度为18ml/min，进行喷雾干燥，得到猪β防御素2的喷干粉。实施例2毕赤酵母蛋白多 肽猪β防御素2耐胃酸试验I、超滤液、喷干粉抑菌活性比较I)解囊称取O. 5g喷干菌粉加入O. 05mol/L柠檬酸钠解囊液49. 5mL中，于37°C、200rpm振荡12h, 3000rpm离心，取上清液。2)制作指示平板采用牛津杯定量扩散法，以金黄色葡萄球菌为指示菌，将含有指示菌IO7个/ml培养物Iml与溶化并冷却至50° C的检测培养基25ml混匀，倒入已放置好牛津杯的平皿中，冷凝后用无菌镊子取出牛津杯。3)抑菌活性比较取超滤液和喷干粉解囊液各50 μ L加入小孔中，在冰箱中放置过夜，使之充分扩散到培养基中，然后在指示菌最适生长温度下培养24h，观察并测定抑菌圈直径。结果如图I所不。图中右边为超滤液抑囷圈，直径为33. 19mm,左边为嗔干粉解囊后抑菌圈，直径为28. 54mm，抑菌活性保持在86%以上。2、耐胃酸试验I)解囊液、指示平板的制作均同上；2)称取O. 5g喷干菌粉加入49. 5mL人工胃液中于37°C、200rpm振荡2h后弃去人工胃液，加入49. 5mL解囊液中于37°C、200rpm振荡Ih后测抑菌圈大小。结果如图2所示。左边为喷干粉解囊后抑菌圈，直径为27. 32_，右边为经过人工胃液处理之后，直径为25. 27抑菌活性保持在90%以上。实施例3毕赤酵母蛋白多肽猪β防御素2对仔猪生长性能的影响试验选21日龄的杜X长X大三元杂交仔猪120头，随机分布到3个处理组和I个空白对照组，每个处理3个重复。在各组日粮中添加实施例I制备的毕赤酵母蛋白多肽猪β防御素2喷干粉，添加量分别为0.5%、1%和2%。测定的生长性能指标包括平均日增重(ADG)、日采食量(40 1)、饲料转化效率^/6)，并观察粪便状态，计算腹泻率。结果如表I所示。表I毕赤酵母蛋白多肽猪β防御素2对仔猪生产性能的影响
项目__对照组试验组0.5% 试验组1% 试验组2%
曰增重(g/d) 264.52±4.27a 274.76士 6.13a 294.05±5.84b 271.14 士 6.9 Ia
ADG_____
「 ^ 釆食量(g/d) 479.29±9.83a 475.83土 8.20a 530.95士 7.03b 474.82士 9.42aL0045J
ADFI_____
料重比1.81±0.01a 1.73±0.02b 1.81±0.02a 1.75±0.02bc
(F/G)_____
腹筠率 ％ 4.40士0.006a 3.93±0.003ac 2.38士0.006b 2.95AQ.QQ2bc 注同行数据无肩标或肩标字母相同者为差异不显著(p>0. 05)，不同小写字母者差异显著(ρ〈0· 05)从表I中数据可以看出，毕赤酵母蛋白多肽的猪β防御素2添加可以改善断奶仔猪的生产性能。整个试验期，1%试验组的日增重和采食量显著高于对照组(ρ〈0. 05)，料重比显著低于对照组(Ρ〈0. 05)。对于腹泻率，试验组明显低于对照组。由此可见，在仔猪阶段，日粮中添加一定剂量 的毕赤酵母蛋白多肽猪β防御素2能显著提高仔猪的采食量，促进饲料利用率，提高仔猪的生长速度和日增重，使猪只的生产性能得到很大的提高。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种猪β防御素2喷干粉的制备方法，其特征在于，发酵携带猪β防御素2基因的酵母基因工程菌株，取上清液进行超滤，超滤液依次添加保护剂、壁材和载体，进行喷雾干燥。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，超滤截留分子量为3KDa 10KDa的超滤液。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述保护剂包括质量体积百分比3 8%的脱脂奶粉、质量体积百分比O. 5^2. 5%的谷氨酸钠以及质量体积百分比O. Γ2. 0%的乳糖、海藻糖、蔗糖中的一种或多种。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述壁材选自明胶、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、海藻酸钠中的一种或多种，添加量为质量体积百分比5 10%。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述载体选自石粉以及玉米淀粉、麦芽糊精、玉米芯粉、麦麸粉中的一种或两种，添加量为质量体积百分比20-25%。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，喷雾干燥的条件为进风温度16(T18(TC，进料速度l(T30ml/min，出风温度65 85°C。
7.权利要求Γ6任一项所述的方法制备的猪β防御素2喷干粉。
8.含有权利要求7所述喷干粉的饲料添加剂。
9.含有权利要求8所述饲料添加剂的预混料。
10.含有权利要求9所述预混料的配合料。
全文摘要
本发明属于动物饲料领域，具体涉及一种猪β防御素2喷干粉及含有其的饲料添加剂，预混料及配合料。本发明的猪β防御素2喷干粉由以下方法制备发酵携带猪β防御素2基因的酵母基因工程菌株，取上清液进行超滤，超滤液依次添加保护剂、壁材和载体，进行喷雾干燥。本发明提供的具有抑菌活性的毕赤酵母表达的猪β防御素2喷干粉，采用喷雾干燥法与成囊技术结合，使猪β防御素2的活性得以最大程度保存，而且，经过体外模拟人工胃液而不被破坏，释放出来的猪β防御素2具有良好的活性。
文档编号A23K1/18GK102907583SQ20121041917
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月27日 优先权日2012年10月27日
发明者吴雅琨, 彭子欣, 陈慧鑫, 冯秋月, 谢飞, 王安如 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 漳州大北农农牧科技有限公司, 湖南大北农农业科技有限公司