一种防病促生长植物内生细菌的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种对农作物具有防病促生长作用的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)Jaas?ed2及其应用，属于农业集约化生产【技术领域】。本发明采用的菌株Jaas?ed2已于2012年9月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC?No.6580。该菌株对茄子黄萎病菌、西瓜枯萎病菌等多种病原真菌具有拮抗活性；并且可在较低的菌液浓度下进入茄子、西瓜等植株体内，并能在农作物体内定殖和传导；对农作物具有促进生长、防治病害的作用，尤其对土传维管束病害具有良好的防治效果。将该菌株用于制剂生产成本低廉，操作简单，有利于保护农田生态环境，减少农药残留，适合于我国无公害农产品生产的要求。
【专利说明】一种防病促生长植物内生细菌
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种对农作物具有防病促生长作用的植物内生细菌多粘类芽孢杆菌Jaas ed2及其在农业上的应用，属于农业集约化生产【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]植物病害是影响农业高产稳产和优质的主要因素之一，目前控制植物病害的危害，除利用作物品种的抗病性，在防治上主要还是采用化学方法，但化学杀菌剂污染环境，诱导病菌产生抗药性，破坏生态平衡，它的残留问题也令人担忧，因此植物病害的生物防治是能使农业可持续发展的重要途径之一，越来越受到重视。关于植物病害生防细菌，以前绝大多数是从土壤或植物根际土壤微生物中分离筛选得到的，但由于这些土壤微生物易受外界条件的影响，在与土壤习居微生物的竞争中不易长期定殖生存并占优势，因而极大地影响了它们的实际防病效果。近年来的研究表明，植物体是一个复杂的微生态系统，几乎所有健康植物体内均含有内生细菌。这些内生细菌不仅将植物作为其栖息场所,而且对寄主植物有促生、防病、内生固氮等多方面的生物学作用。植物内生细菌还是良好的外源基因载体，为抗病杀虫及固氮等植物外源基因向植物体内的转移，提供了一种新的方法和途径。因此，内生细菌是植物病害生物防治的天然资源菌，是近年来研究开发的热点，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景。
[0003]植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的细菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状。可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织和汁液中分离获得，或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明内生细菌的存在。植物内生细菌因其本身就存在于植株体内，容易占据有利的生态位，能经受住植物自身的防卫反应，并与病原菌直接相互作用，从而给植物提供全面有效的保护。植物内生细菌与从土壤中分离到的拮抗细菌相比，具有不易受环境条件的影响，在植物体内具有稳定的生存空间，可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递等优势。利用内生细菌对土传维管束病害进行生物防治的优势更为突出，由于土传维管束病害的病原菌侵染植株后，就在寄主植物维管束中生长、繁殖、为害，造成化学药剂防治困难，效果不理想又污染环境，而内生细菌可以通过在寄主植物体内定殖，与病原菌争夺生存空间，产生拮抗物质直接对病原菌作用以及诱导寄主植物产生抗性等达到防病控病的目的。
[0004]另外，植物内生细菌在长期的进化过程中与宿主植物形成了协调的共生关系，能够平衡植物感染的微生物种群，并且它们能够产生多种生物活性物质，可以用于包括生物农药在内的药物研发。因此，开展植物内生细菌的研究不仅对植物微生物学科的基础研究有重要的理论价值，而且对农业可持续发展也有重要的实践意义。随着人们对自然环境保护意识的不断加强，现代农业逐步向生态型农业方向发展，研究和利用植物内生细菌成为一条重要的思路，它对于重新建立植物体内细菌的多样性，使植物减少来自外来环境的压力，为植物提供氮肥和促进植物生长有重要作用；对于替代或减少化肥和农药的使用，改善农业生态系统，保持植物微生态系统的生物多样性，维护农田生态平衡，实现农业的可持续发展将起到重要作用。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种能够对多种病原真菌具有拮抗作用、对农作物具有防病促生长作用且能定殖在农作物体内的多粘类芽孢杆菌Jaas ed2。利用该生防菌可开发出新型的生防菌剂，满足无公害农产品的生产要求。
[0006]本发明所提供的植物内生菌是2004年从中国江苏省南京市的茄子茎组织中分离获得，2012年对该菌株进行了菌种鉴定，结果为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa),命名为Jaas ed2,并于2012年9月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC N0.6580。该菌株具有下述性质:
[0007]1、菌落形态特征
[0008]该菌株在NA培养基上生长良好，单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面湿润光滑，菌落淡乳黄色，无光泽，隆起，不透明。
[0009]2、菌体形态特征
[0010]菌体细胞杆状，形成荚膜，产生芽孢。
[0011]3、主要生理生化特征
[0012]革兰氏反应阳性；过氧化氢酶反应阳性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇、葡萄糖产酸；利用葡萄糖产气P反应阳性；淀粉水解阳性；明胶液化阳性；分解酪素阳性。
[0013]4、遗传学特征
`[0014]利用Eubac27F和Eubacl492R为引物进行PCR扩增出16S rRNA基因的部分序列1435bp，并向GenBank提交，将于2013年2月I日公开发布，登录号为JX849658。将该序列在www.ncb1.nlm.nih.gov网站上用BLAST工具与GenBank中已登录的部分菌株的16SrRNA基因序列进行相似性比较,结果表明与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的相似性达99%。
[0015]因此，通过对该菌株进行形态特征、生理生化特征和遗传学特征进行鉴定，本发明所述的植物内生细菌Jaas ed2属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
[0016]通过常规的微生物发酵方法可以培养本发明所述的植物内生细菌，并制得以本发明所述的植物内生细菌为有效成分的生防菌剂。该菌的最适PH为6.0-8.0，最适培养温度为25-30°C，可用一般发酵工业中的通用发酵罐进行培养。在制造以本发明所述的植物内生细菌为生防菌剂时，可同样使用该【技术领域】中已知生防菌剂通用的培养基，配制成水剂、粉剂等任意的剂型。
[0017]本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2及制得的以其为有效成分的生防菌剂与现有技术相比具有如下优点:
[0018]1、可以在植株体内定殖传导
[0019]本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌可以在茄子、西瓜等多种农作物体内定殖，并且可以在植株体内传导。
[0020]2、可以促进植株生长
[0021]用本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌菌液泼浇茄子苗、西瓜苗等农作物，可显著提高植株的株高、根长和鲜重。[0022]3、对土传维管束病害具有突出的防治效果
[0023]用本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌菌液对植株进行灌根对茄子黄萎病、西瓜枯萎病等土传维管束病害具有突出的防治效果。
[0024]4、对多种作物病原真菌具有拮抗活性
[0025]本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，对西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、茄子黄萎病菌、棉花黄萎病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、莴苣菌核病菌、番茄早疫病菌等多种病原真菌都具有明显的拮抗活性。
【具体实施方式】:
[0026]下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
[0027]实施例1液体制剂
[0028]将植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2菌株接种到试管斜面上，培养基为NA，25°C恒温培养2-4天，获得试管种。
[0029]将试管种接种到NB培养基中，28 °C恒温振荡培养过夜后，转接于NB培养基中，28°C恒温振荡培养1天后的培养液即可为制剂。
[0030]配方一、普通细菌NA培养基(重量％ )
[0031]牛肉浸膏0.3%，酵母膏0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，琼脂1.5-2.0%，pH6.8-7.00
[0032]配方二、普通细菌NB培养基(重量％ )
[0033]牛肉浸膏0.3%，酵母膏0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，pH6.8-7.0。
[0034]实施例2对茄子苗的促生长作用
[0035]将催芽的茄子种子播种于温室盆钵中，待茄子苗长到2~3片真叶时，将稀释后的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2菌液浇于茄子苗及盆钵土壤中，21天后测量苗高并称鲜重，试验结果表明该菌株对茄子苗具有明显的促生长作用，株高比对照增长75%，鲜重比对照增长92%。
[0036]实施例3对西瓜苗的促生长作用
[0037]将催芽的西瓜种子播种于温室盆钵中，待西瓜苗长至2~3片真叶时，将稀释后的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2菌液浇于西瓜苗根际，20天后测量苗高并称鲜重，试验结果表明该菌株对西瓜苗具有明显的促生长作用，株高比对照增长21.9%，鲜重比对照增长 23.2%。
[0038]实施例4对茄子黄萎病的防治作用
[0039]将催芽的茄子种子播种于温室盆钵中，待茄子苗长至2~3片真叶期时，对茄子苗根部用稀释后的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2进行灌根处理，3天后对茄子苗根部灌浇茄子黄萎病菌孢子液，6天后再次用稀释后的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2进行灌根处理，以不接种本发明所述的内生细菌为对照，2周后调查黄萎病的病情。本发明所述的内生细菌对茄子黄萎病的防治效果为42.9%。
[0040]实施例5对西瓜枯萎病的防治作用
[0041]将催芽的西瓜种子播种于温室里装有病土的盆钵中，待西瓜苗长至2片真叶期时，对西瓜苗根部每隔5天用稀释后的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2进行灌根处理，连用3次，以不接种本发明所述的内生细菌为对照，最后一次处理后23天调查枯萎病的病情。本发明所述的内生细菌对西瓜枯萎病的防治效果为64.1%。
[0042]在大棚中，待西瓜苗长至3~4片真叶期时，对西瓜苗根部灌浇西瓜枯萎病菌孢子液，第2天再用稀释后的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2进行灌根处理，以不接种本发明所述的内生细菌为对照，20天后调查枯萎病的病情。本发明所述的内生细菌对西瓜枯萎病的防治效果为64.9%。
[0043]实施例6对多种病原真菌的拮抗作用
[0044]在PDA平板中心处接直径为5mm病原真菌菌饼，25°C，培养1_3天后，在菌落边缘
1.5cm处接活化好的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2，6_7天后测量抑菌圈。结果表明本发明所述的植物内生多粘类芽孢杆菌具有较广的抑菌谱，对西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、茄子黄萎病菌、棉花黄萎病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、 莴苣菌核病菌、番茄早疫病菌等多种病原真菌都具有明显的拮抗活性。
[0045]实施例7在茄子、西瓜植株体内定殖
[0046]将催芽的茄子或西瓜种子播种于温室盆钵中，待茄子苗或西瓜苗长至2~3片真叶时，将稀释后的经利福平标记后的植物内生多粘类芽孢杆菌Jaas ed2菌液浇于茄子苗或西瓜苗的根际。每隔3天取距土表1cm的地上茎组织，用表面消毒-研磨-铺平板技术再分离回收经利福平标记的菌株，以检测内生细菌在植株体内的定殖情况，试验结果表明该菌株在茄子苗或西瓜苗中可以定殖12天以上。
【权利要求】
1.一种具有防病促生长作用的植物内生细菌Jaas ed2，其特征在于:该菌是一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),已于2012年9月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC N0.6580。
2.根据权利要求1所述的一种植物内生细菌，其特征在于，该菌株在NA培养基上生长良好，单个菌落呈半玻璃珠状，边缘整齐，表面湿润光滑，菌落淡乳黄色，无光泽，隆起，不透明；菌体细胞杆状，形成荚膜，产生芽孢；革兰氏反应阳性；过氧化氢酶反应阳性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇、葡萄糖产酸；利用葡萄糖产气P反应阳性；淀粉水解阳性；明胶液化阳性；分解酪素阳性；用抗利福平与拮抗病原真菌双标记进行内生测定，从植株体内回收分离的菌株，在含利福平培养基上出现相同的菌落。
3.权利要求1或2所述植物内生细菌在制剂生产中的应用，其中以权利要求1或2所述植物内生细菌为生产菌株来生产制剂。
4.以权利要求1或2所述植物`内生细菌为有效成分的制剂在农业上应用。
【文档编号】A01P3/00GK103773708SQ201210460946
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2012年11月16日
【发明者】林玲, 王卿, 张昕, 邓晟 申请人:江苏省农业科学院