专利名称：诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法
技术领域：
本发明涉及一种多倍体鱼类雌核发育的方法，尤其是一种操作方法简单、快捷，无需卵子染色体加倍处理，可快速、高效生产雌核发育二倍体泥鳅的诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法。
背景技术：
人工诱导雌核发育(artificially induced gynogenesis)是通过物理或化学方法使遗传失活的精子激活卵，精子不参与合子核的形成，卵仅靠雌核发育形成胚胎并经过染色体加倍发育成正常个体的技术。到目前为止，国内外先后对斑马鱼(Zfeflio rerio) >青鎌鱼(Oryzias、香鱼(Plecoglossus alti velis 入大麻哈鱼(Oncorhynchusrhodurus )、虹轉(VncorAyncAus mykiss)、罗车鱼(Oreochromis、非洲鲇鱼(Clarias 褐牙鲆 iParalichthys oilvaceus)、漠斑牙鲆{Paralichthyslethostigma)、大黄鱼{Pseudosciaena crocea,Larimichthys crocea)、细鱗大麻哈jk iOncorhynchus gorbuscha)等进行了雌核发育诱导。人工诱导雌核发育是一种实用性较强的科学手段，在产生纯系、染色体操作、遗传分析以及性别控制等方面都有潜在的应用价值。·目前，人工诱导鱼类雌核发育二倍体包括两个关键步骤(I)精子染色体的遗传失活；(2)卵子染色体的二倍体化。前者主要用来激活卵子发育；后者是使受精卵恢复正常二倍体倍性以来保证个体的正常发育。现有卵子染色体的二倍体化主要有物理学方法、化学方法和生物学方法三种，无论哪种方法，在多倍体诱导过程中的各种处理(如物理操作或药物残留)对细胞内特定蛋白的生化效应存在一定的伤害，这种伤害常常对诱导物的生长和存活产生一定的负面效应。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作方法简单、快捷，无需卵子染色体加倍处理，可快速、高效生产雌核发育二倍体泥鳅的诱导天然四倍体鱼类雌核发育的方法。本发明的技术解决方案是一种诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法，其特征在于依次按如下步骤进行
a.精、卵的获得
取天然雌性四倍体泥鳅及雄性二倍体泥鳅进行催产，分别取雌性四倍体泥鳅的卵子及雄性二倍体泥鳅的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液稀释100倍待用；
b.精子的遗传失活
将二倍体泥鳅精液均匀铺设于底面涂有厚度为Imm的1%BSA洁净培养皿内，用紫外线照射二倍体泥鳅的精液，照射剂量为50erg/mm2/SX120S ；
c.人工授精取a步骤所得卵子与经b步骤紫外线照射的二倍体泥鳅的精子授精，授精在避光条件下进行，并在避光状态中孵化15min ；d.受精卵孵化及培育
将所得受精卵收集在装有淡水的培养皿中孵化，水温23± 1°C，每天换水两次，每次换水1/3，待孵化后移入另一培育器皿培育，生产出泥鳅雌核发育二倍体鱼苗。本发明是以经紫外线灭活的二倍体泥鳅的精子激活天然四倍体泥鳅的卵子，继而培育出雌核发育二倍体泥鳅。因天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体(4n=100)且是同源四倍体，雌雄泥鳅均能产生正常的2n配子，所以无须卵子加倍处理，操作方法简单、快捷，避免了繁琐的人工处理操作程序及理化诱导手段可能对受精卵造成的伤害，提高了孵化率等，是实现鱼类雌核发育一条切实可行的途径，具有巨大的应用价值。
图1是本发明实施例所制备的雌核发育二倍体泥鳅染色体(2n=50)的图片。图2是对照组(2n早X 4n ￠)泥鳅染色体(3n=75)的图片。
具体实施例方式依次按如下步骤进行
a.精、卵的获得
选取发育良好的雌性天然四倍体(4n=100)及雄性二倍体(2n=50)泥鳅进行催产，水温24±1°C，效应时间1(T12小时后，确认雌性天然四倍体排卵后，轻压腹部采卵；同样轻压雄性二倍体泥鳅腹部用毛细管采精，所得精液用Kurokura’s solution溶液稀释100倍待用；精子保存液Kurokura’s solution溶液的配制方法是NaCl 750 mg, CaCl2 20 mg, NaHCO320 mg, KCl 20 mg溶于100 ml蒸懼水中；
b.精子的遗传失活
将二倍体泥鳅精液均匀铺设于直径为6cm且涂有厚度为Imm的1%BSA洁净培养皿内，用紫外线照射二倍体泥鳅的精液，照射剂量为50erg/mm2/SX120S ；
c.人工授精
取a步骤所得天然四倍体泥鳅产生的成熟卵子(二倍体)与经b步骤紫外线照射的二倍体泥鳅的精子授精，授精在避光条件下进行，并在避光状态中孵化15min ；
d.受精卵孵化及培育
将所得受精卵收集在装有淡水的培养皿中孵化，水温23 土 1°C，挑出未受精的卵或死卵，每天换水两次，每次换水1/3，待孵化后移入另一容积较大的培育器皿培育，生产出泥鳅雌核发育二倍体鱼苗。对本发明实施例所得泥鳅倍性检测
通过早期混合胚胎制片法对本发明实施例及对照组的泥鳅体细胞染色体数目进行检测，对照组与本发明实施例的区别是受精卵未经 紫外线照射，即精子的遗传未失活。早期混合胚胎制片法为取本发明实施例及对照组发育眼胞期的胚胎3(T50个，用镊子剖去卵膜和卵黄后放入盛有0. 0025%的秋水仙素中处理45min，0. 8%的柠檬酸低渗20min，再用预冷的卡诺固定液(甲醇冰醋酸=3 :1)固定3次，每次15 20min，最后-20°C冷冻过夜。冷滴片，10%吉姆萨染色，镜检，拍照。
本发明实施例照片如图1所示结果表明雄核发育泥鳅染色体为二倍体(2n=50)。对照组照片如图2所示结果表`明染色体为三倍体(3n=75)。
权利要求
1.一种诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.精、卵的获得取天然雌性四倍体泥鳅及雄性二倍体泥鳅进行催产，分别取雌性四倍体泥鳅的卵子及雄性二倍体泥鳅的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液稀释100倍待用；b.精子的遗传失活将二倍体泥鳅精液均匀铺设于底面涂有厚度为Imm的1%BSA洁净培养皿内，用紫外线照射二倍体泥鳅的精液，照射剂量为50erg/mm2/SX120S ；c.人工授精取a步骤所得卵子与经b步骤紫外线照射的二倍体泥鳅的精子授精，授精在避光条件下进行，并在避光状态中孵化15min ；d.受精卵孵化及培育将所得受精卵收集在装有淡水的培养皿中孵化，水温23土 1°C，每天换水两次，每次换水1/3，待孵化后移入另一培育器皿培育，生产出泥鳅雌核发育二倍体鱼苗。
全文摘要
本发明公开一种操作方法简单、快捷，无需卵子染色体加倍处理的诱导天然四倍体泥鳅雌核发育的方法，依次按如下步骤进行a.取天然雌性四倍体泥鳅及雄性二倍体泥鳅进行催产，分别取雌性四倍体泥鳅的卵子及雄性二倍体泥鳅的精液，所得精液用Kurokura’ssolution溶液100倍稀释待用；b.将二倍体泥鳅精液均匀铺设于底面涂有厚度为1mm的1%BSA洁净培养皿内，用紫外线照射二倍体泥鳅的精液，照射剂量为50erg/mm2/s×120s；c.取a步骤所得卵子与经b步骤紫外线照射的二倍体泥鳅的精子授精，授精在避光条件下进行，并在避光状态中孵化15min；d.受精卵孵化及培育。
文档编号A01K61/00GK103039386SQ20121050825
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者李雅娟, 王伟, 高养春, 刘博 , 王玉生 申请人:大连海洋大学, 李雅娟