专利名称：东亚对开蕨种质试管保存及迁地保护方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体地说是濒危珍稀植物东亚对开蕨种质保存方法和迁地繁育保护方法。
背景技术：
东亚对开蕨iPhyllitis japonica Kom.)也称东北对开蕨、日本对开蕨、对开蕨。既具有观赏价值，又有药用价值。属铁蕨科，多年生常绿草本植物。根状茎短，横卧或斜生，根细长，多横走。世界稀有物种，我国仅一属一种，国家二级珍稀濒危保护植物。产于长白山南麓和西侧局部地区，主要分布于吉林省长白朝鲜族自治县、临江、集安、抚松等的一些狭窄区域，并且分布星散。对开蕨喜空气湿度大、避风阴湿、腐殖土丰厚且多有坡度的森林土壤环境，东亚对开蕨自然贮量极少。这些地区现没有划入长白山自然保护区保护范围，目前尚无明确的保护措施。有研究表明对开蕨在长白山区为衰退种，近年来随着森林生态环境逐年恶化，其长势日益不良，数量逐减，有的分布区域已绝迹。因此，为保护这一珍稀濒危植物资源，防止自然和人为因素对其造成毁灭性破坏，迫切需要人工对其繁殖和保护。人工繁殖需要大量的种质，而东亚对开蕨自然贮量稀少，大量采集野生种质，这种行为的本身就会给本来就脆弱生态环境造成伤害，以至于伤害大于保护的后果。人工长期传代培养也会造成品种退化，不适合野生环境下生长繁殖。
发明内容
本发明的目的是为了保护濒危珍稀植物东亚对开蕨，扩大野生种群的面积，而提供一种东亚对开蕨种质保存方法和迁地保护方法。一种东亚对开蕨种质保存方法，它包括将原叶体接种于1/4 MS MS (全)+蔗糖25-30g/L培养基中，置于光照培养箱内，光照强度200-3001x ;光照5_7h/d，温度为14-16°C ；
所述的培养基为1/2MS+蔗糖30/L ；
所述温度为15°C ；
所述的培养基为固体培养基，每12个月更换一次。东亚对开蕨迁地保护方法，它包括
1)采集东亚对开蕨含有成熟孢子囊的孢子叶，将剥出的孢子囊放在经灭菌后的滤纸上，小心压碎孢子囊，散出其内的孢子，连同滤纸片一同接种于MS+蔗糖20g/L、培养基中；100-2001x散射光下，光照12h/d ;白天温度25-26°C，晚间20_22°C，孢子萌发为原叶体团；
2)将原叶体团切成小块接种于1/2MS -MS (全)+蔗糖培养基中继代与增殖；
3)将部分原叶体按上述的东亚对开蕨种质保存方法保存；其余出瓶移栽以草炭为基质 的花盆中，温室培养30天，喷施O. 1% KH2PO4孢子体诱导，当幼苗成长至4片叶以上，每年六月下旬迁地移栽；
4)每12个月转接一次，每次转接时将一部分原叶体继续保存培养，其余进行增殖继代、试管外以草炭为基质诱导孢子体植株形成、迁地移栽。本发明提供了一种东亚对开蕨种质保存方法，将原叶体接种于1/4 MS MS (全)+蔗糖25-30g/L培养基中，置于光照培养箱内，光照强度200-3001x ;光照5_7h/d，温度为14-16°C ；12个月后，几乎没有生长和增殖，状态与起初培养时相似，将其转入继代培养条件下后，仍能正常增殖与生长；培养60天后，增值率为4. 5左右，孢子体也可以正常形成；已进行了 5年的保存处理；本发明还提供了东亚对开蕨迁地保护方法，将保存的原叶体每年继代繁殖，试管外以草炭为基质诱导孢子体植株形成、迁地移栽；在长白山区选取了与对开蕨原生境基本相似的3个地点作为迁地移栽供试区；每个地点栽植100株；经生长4年，长
势良好，真正达到对濒危植物的保护。
图1没破碎的孢子叶孢子120d生长状态；
图2破碎孢子囊后的孢子60d培养；
图3液体培养40d原叶体生长状态；
图4液体培养70d原叶体生长状态；
图5固体培养孢子120d生长状况；
图6接种时原叶体；
图7 60d培养后的原叶体；
图8栽植120d后的孢子体状况；
图9分株后的孢子体植株；
图10对开蕨组培苗温室驯化；
图11临江市洋鱼头村生长状况；
图12敦化市马五店山区2年栽植生长状况；
图13野外3年栽植生长状况。
具体实施例方式实施例1 孢子萌发
材料来自吉林省白山市林区；取东亚对开蕨含有成熟孢子囊的孢子叶，实验室中将孢子叶切成Icm大小；无菌条件下O. l%HgCl2溶液灭菌5分钟，无菌水冲洗6次，滤纸吸干后接种。接种方法接种分三种方式，一是孢子叶直接接种；二是在超净工作台解剖镜下将孢子叶中的孢子囊剥离出后接种；三是解剖镜下将剥出的孢子囊放在经灭菌后2cmX2cm大小的滤纸上，用手术刀小心压碎孢子囊，散出其内的孢子，连同小滤纸片一同接种。孢子培养采用1/2MS+蔗糖20g的固体培养和液体培养两种方法。培养条件100-2001x散射光下，光照12h/d。白天温度25_26°C，晚间20_22°C。孢子叶和孢子囊在固体培养基中大约IOOd左右的培养孢子开始萌发，120d时达到肉眼可见的程度(见图1，图5 )，而破碎孢子囊后的孢子经50-60d的培养即达肉眼可见状态，而且萌发后的长势也明显好于前两种(见图2);可见，东亚对开蕨离体培养中去除孢子囊壳的孢子更利于其萌发。将孢子叶中的孢子囊剥离出后分别进行液体和固体培养。结果发现液体培养基中的孢子经30d培养后开始萌发，约40d出现明显可见的原叶体，其大小可达O. 3cm-0. 5cm(见图3);原叶体再经30d培养后，可形成大量的原叶体团，大小达1. 5-2. Ocm左右(见图4);而此时固体培养的孢子刚处于萌发状态(图5);液体培养中的孢子萌发和原叶体生长速度远远好于固体培养；这说明液体培养较固体培养更适合东亚对开蕨孢子萌发和原叶体的生长。实施例2原叶体继代与增殖
将孢子萌发后形成的原叶体团分切成约O. 5cm大小的小块，每小块约含原叶体5 - 10片，分别接种到含有不同浓度植物生长调节剂的固体MS培养基中(见表1)，每瓶接种8 -10块。将孢子萌发后形成的原叶体团分别接种到含有不同浓度植物生长调节剂的MS培养基中，培养条件100-2001x散射光下，光照12h/d。白天温度25-26°C，晚间20_22°C，与孢子萌发条件相同；60d后观察原叶体增殖及生长情况(见表1，图6，图7)。原叶体在供试的几种培养基中均能以约5倍速率增殖。新复极差测验表明，各培养基中的原叶体增殖率无显著差异。但是，原叶体的生长状态却明显不同，在无植物生长调节剂和KT为O. 2mg/l以下的培养基中，原叶体总体状态表现为生长平展，较宽大。随着生长调节剂的浓度增高，原叶体总体状态表现为狭窄、叶片不展开、密实，且生长状态不佳，这一类原叶体很难用于进一步增殖和孢子体植株的诱导。由此可见，原叶体增殖应以无植物生长调节剂或少量KT的培养基为好。
权利要求
1.一种东亚对开蕨种质保存方法，它包括将原叶体接种于1/4 MS MS+蔗糖25-30g/L培养基中，置于光照培养箱内，光照强度200-3001x ；光照5_7h/d，温度为 14-16°Co
2.根据权利要求1所述的一种东亚对开蕨种质保存方法，其特征在于所述的培养基为 1/2MS+ 蔗糖 30/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种东亚对开蕨种质保存方法，其特征在于所述温度为 15。。。
4.根据权利要求3所述的一种东亚对开蕨种质保存方法，其特征在于所述的培养基为固体培养基，每12个月更换一次。
5.东亚对开蕨迁地保护方法，它包括1)采集东亚对开蕨含有成熟孢子囊的孢子叶，将剥出的孢子囊放在经灭菌后的滤纸上，小心压碎孢子囊，散出其内的孢子，连同滤纸片一同接种于MS+蔗糖20g/L的培养基中； 100-2001x散射光下，光照12h/d ;白天温度25-26°C，晚间20_22°C，孢子萌发为原叶体团；2)将原叶体团切成小块接种于1/2MS MS+蔗糖培养基中继代与增殖；3)将部分原叶体按权利要求1所述的东亚对开蕨种质保存方法保存；其余出瓶移栽以草炭为基质的花盆中，温室培养30天，喷施O. 1% KH2PO4孢子体诱导，当幼苗成长至4片叶以上，每年六月下旬迁地移栽；4)每12个月转接一次，每次转接时将一部分原叶体继续保存培养，其余进行增殖继代、试管外以草炭为基质诱导孢子体植株形成、迁地移栽。
全文摘要
本发明提供了一种东亚对开蕨种质保存方法，将原叶体接种于1/4～MS(全)+蔗糖25-30g/L培养基中，置于光照培养箱内，光照强度200-300lx；光照5-7h/d，温度为14-16℃；12个月后，几乎没有生长和增殖，状态与起初培养时相似，将其转入继代培养条件下后，仍能正常增殖与生长；已进行了5年的保存处理；本发明还提供了东亚对开蕨迁地保护方法，将保存的原叶体每年继代繁殖，试管外以草炭为基质诱导孢子体植株形成、迁地移栽；在长白山区选取了与对开蕨原生境基本相似的3个地点作为迁地移栽供试区；每个地点栽植100株；经生长4年，长势良好，真正达到对濒危植物的保护。
文档编号A01H4/00GK103004606SQ20121058864
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者赵春莉, 赵和祥, 顾德峰, 李金英, 黄翔童, 陈丽飞, 董然, 刘晓嘉, 刘淑英, 姜立新 申请人:吉林农业大学