专利名称：：一种水稻病原菌诱导启动子的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物基因工程
技术领域：
，提供了一个水稻病原菌诱导启动子，可用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。
背景技术：
：由真菌、细菌、病毒以及线虫引起的植物疾病为作物生产带来巨大影响。植物拥有两套不同的抗性机制:一是被动防御机制，是指一些抗性相关的形态结构，如表皮和坚硬的细胞壁(BradyJD,FryS.Formationofd1-1sodityrosineandlossofisodityrosineinthecellwallsoftomatocell—suspensionculturestreatedwithfungalelicitorsorH2O2.PlantPhysiol1997,115:87-92.)。另一个是主动防御，主动防御是抗性基因与病原菌识别并且互作引起的。病原物无毒基因(avr)编码的激发子与寄主植物响应的抗病基因(R)编码激发子的受体分子相互作用产生抗病反应。植物抗病防卫反应一般经历信号识别、信号传导、防卫基因表达三个环节。主动防御中所有类型的抗病机制都要依靠防卫基因表达，抵抗的有效性取决于基因表达的时空特性。正是由于防卫基因的时空表达特性，其启动子往往具有某些特殊的顺式作用元件，人们可以利用防卫基因、尤其是其顺式元件为基因工程改良提供有利的工具。植物中绝大部分抗病基因都编码具有核苷酸结合位点以及亮氨酸重复的蛋白(NBS-LRR),(McHaleL,TanX,KoehlP，MichelmoreRff.PlantNBS-LRRproteins!adaptableguards.GenomeBiol2006，7:212.)。但是对于这类基因的启动子研究还比较少。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5'端上游区的DNA序列，是转录调控的中心。从1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。组织特异启动子可以使外源基因的表达只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节特性；诱导型启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是:它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所造成的浪费，并且满足某些需要外源基因特异表达的需求。组织特异性或诱导表达启动子一直以来都是植物基因工程研究的重点和难点。目前，已经找到一些组织特异性或诱导表达启动子，并发现其上存在的相应的顺式因子，为后来的启动子研究奠定了基础。烟草的Sar8.2b基因受水杨酸(SA)诱导，在其启动子上发现了几个顺式作用因子，包括as-1因子、GT21和Dof结合序列。SA诱导Sar8.2b基因表达可能存在于-728至_927bp和-197至_351bp的区域的顺式因子中(SongF，GoodmanRM.CloningandidentificationofthepromoterofthetobaccoSar8.2bgene,ageneinvolvedinsystemicacquiredresistance.Gene2002，290:115-124.X玉米鹿糖合成酶I只在韧皮部细胞中表达(YangNS,RussellD.Maizesucrosesynthase-promoterdirectsphloemcellspecificexpressionofgusgeneintransgenictobaccoplants.ProcNatlAcadSci1990,87:4144-4148.)。PsGNS2启动子只在种子中特异表达(BuchnerP，RochatC,WuillemeS，BoutinJP.Characterizationofatissue-specificanddevelopmentalIyregulatedbeta-1,3-glucanasegeneinpea(Pisumsativum).PlantMolBiol2002，49:171-186.)。水稻是最重要的粮食作物之一，水稻的真菌病害以及细菌病害都会造成产量减少及品质下降。水稻抗病基因的克隆以及启动子的分离可以使我们更好地了解寄主与病原菌的互作并为基因工程改良奠定基础。因此如何利用水稻抗病基因的克隆以及启动子的分离获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。
发明内容本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个水稻病原菌诱导启动子，该启动子能够被水稻白叶枯病病菌黄单胞菌PX099、PX061，水稻细菌性条斑病病菌RS105以及玉米纹枯病菌YWK-196所激活，同时·，也能被脱落酸、赤霉酸、水杨酸、氯化钠处理所激活。通过对该启动子进行截短，确定了_513bp至-411bp和-411至-310bp为病原诱导关键区域。可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性状。发明人首先提供了一个水稻病原菌诱导启动子，该启动子基因序列中含有如序列表SEQIDN0.1所示的DNA序列。该启动子来源于水稻IRBB13(Oryzasativa),是下述核苷酸序列之一:序列表中SEQIDN0.1所示的DNA序列或部分DNA序列。序列表中的SEQIDN0.1由2257个碱基组成。自5'端第2198位碱基为转录起始位点，记为+1。其中TATA框位于转录起始位点上游-30至-25位碱基，而CAAT框位于-72至-69位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。自5'端第-1239位，-183位碱基为黄化诱导元件ACGTATERD1;自5,端第-1793位，-1750位，-682位碱基为胚和胚乳特异表达元件CANBNNAPA;自5,端第-128位碱基为脱水响应元件CBFHV;自5z端第-1474位，-1137位，-837位，-168位碱基为热激蛋白基因表达元件CCAATB0X1;自5z端第-55位碱基为黑暗响应元件CDAATCAB2;自5,端第-2079位，-1773位，-1243位，-739位碱基为铜离子诱导表达元件CUREC0RECR;自5,端第-1714位，-1276位，-1005位，-906位，-725位，-587位，-380位，-333位，-230位碱基为DNA结合蛋白基因表达元件D0FC0REZM;自5,端第-2069位，-1631位，-1572位，-1566位，-1527位，-220位碱基为贮藏蛋白基因表达元件EB0XBNNAPA;自5,端第-2119位，-1252位，-1186位碱基为增强子元件EECCRCAH1;自5,端第-336位碱基为氮响应元件EMHVCH0RD;自5,端第-1805位，-1670位，-1441位，-1071位，-698位，-392位，-284位，-227位，-212位碱基为光诱导元件GATAB0X;自5,端第-2137位，-315位碱基为病原菌和盐离子诱导表达元件GT-1;自5y端第-683位碱基为ABA诱导表达元件PR0XBBNNAPA;自5,端第-1854位，-726位碱基为GA诱导元件PYRMIDINEB0X0SRAMY1A；自5'端第-1517位，-950位碱基为水杨酸诱导元件WB0XATNPR1。2H16启动子p2H16的序列分析结果表明2H16基因在水稻抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。同时通过截短验证,确定了病原诱导相关区段位于_513bp至_411bp和_411bp至-309bp，在确定了上述的病原诱导关键区域后，可以方便的与其他抗病相关基因通过基因工程改造来改善植物抗病性。除此之夕卜，本发明的发明还提供了含有p2H16的重组载体，并命名为I38IGFP::p2H16。综上所述，本发明的发明人在国际上首次提供了一个水稻病原菌诱导启动子P2H16，水稻转基因证明发现转基因植株受到ABA，SA,GA，黄单胞菌PX099、PX061，水稻细菌性条斑病菌RS105以及玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GFP活性均有显著上升，说明p2H16含有相应的应答反应因子。p2H16在模式植物中的表达特征表明其是一个病原相关的启动子。p2H16的功能研究可为揭示2H16的表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于水稻抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。图1.本发明所述启动子转化水稻中花植株受到黄单胞菌PX099、PX061、细菌性条斑病菌RS105诱导后GFP荧光观察结果灰度图；其中H2O为对照，结果发现接种24h后进行荧光观察，可以观察到很强的荧光，说明该启动子受到上述病原细菌的诱导；图2.本发明所述启动子转化水稻中花植株受到玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GFP荧光观察结果灰度图；不接菌CK为对照，结果发现接种24h后进行荧光观察，可以观察到很强的荧光，说明该启动子受到上述病原真菌的诱导；图3.本发明所述启动子转化水稻中花植株受到NaCl，SA,GA，ABA诱导后GFP荧光观察结果灰度图；结果发现处理36h后进行荧光观察，NaCl，SA处理后有很强的荧光，而GA，ABA处理后荧光强度较弱，说明NaCl，SA,GA，ABA均能诱导该启动子表达，只是诱导强度有所不同；图4.本发明所述不同截短启动子转化水稻中花植株受到白叶枯病菌PX099诱导后GFP荧光观察结果灰度图；结果发现，接种24h后进行荧光观察，在截去_720bp至_309bp这一区段后，荧光强度明显减弱，说明这一区段存在与病原诱导相关的元件；图5.本发明所述不同截短启动子在本生烟上瞬时表达后受到玉米纹枯病菌YWK-196诱导后GFP荧光观察结果灰度图；结果发现，接种24h后进行突光观察,在截去_513bp至_41Ibp和_41Ibp至_309bp这两个区段后，荧光强度有明显减弱，说明与病原诱导相关的元件存在于这两个区段。图6为图1的彩色示意图；图7为图2的彩色示意图；图8为图3的彩色示意图；图9为图4的彩色示意图；图10为图5的彩色示意图。具体实施方式以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；实施例1水稻2H16基因启动子p2H16的克隆以及序列分析根据水稻日本晴2H16基因(GENBANK登陆号为:AK058338)上游2300bp序列设计引物(5z-CAGACGGCTACTGTCCATCA-3z，其序列如SEQIDN0.2所示；5z-GCGAGAGCAGGAGGAGAGAC-3'，其序列如SEQIDN0.3所示)用来获得基因的启动子。提取水稻IRBB13基因组DNA，作为模板，进行PCR扩增，反应程序如下:预变形940C5min,变性94°C40s，退火54°C40s,延伸72°C2min,反应35个循环，后延伸72°C7min,结束后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T中(Promega公司)，室温孵育lh，转化E.coliDH5a感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由华大基因完成。结果以水稻IRBB13基因组DNA为模板，经过PCR扩增后，获得一个长度为2257bp的DNA片段，具有序列表SEQIDN0.1的DNA序列。与已克隆的2H16的启动子序列进行比较，结果该2257bp的DNA片段存在73bp的连续缺失，将该启动子命名为p2H16。而将上述含有p2H16的重组载体命名为pGEM-T::p2H16。将2H16cDNA序列的第一个碱基定义为转录起始位点，即序列表中SEQIDN0.1自5z端的第2198位碱基。用PLACE(HigoK，UgawaY,IwamotoM,KorenagaT.Plantcis-actingregulatoryDNA_elements(PLACE)NuclAcidsResl999,27:297-300.)软件对水稻2H16的启动子核苷酸序列(序列表中的SEQIDN0.1)进行序列分析。用上述软件对2H16基因启动子P2H16中的顺式作用元件进行搜`索、预测，结果该启动子中含有众多与已知真核生物的顺式元件的同源序列。其中，将2H16cDNA序列的第一个碱基定义为转录起始位点(记为+1)，即序列表中SEQIDN0.1自5z端的第2198位碱基，其中TATA框位于转录起始位点上游-30至-25位碱基，而CAAT框位于-72至-69位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。自5'端第-1239位，-183位碱基为黄化诱导元件ACGTATERD1(SimpsonSD,NakashimaK，NarusakaY，SekiM,ShinozakiK，Yamaguch1-ShinozakiK.Twodifferentnovelcis-actingelementsoferdl,aclpAhomologousArabidopsisgenefunctionininductionbydehydrationstressanddark-1nducedsenescence.PlantJ2003,33:259-270.);自5,端第-1793位，-1750位，-682位碱基为胚和胚乳特异表达元件CANBNNAPA(EllerstromM,StalbergK，EzcurraI,RaskL.Functionaldissectionofanapingenepromoter:1dentificationofpromoterelementsrequiredforembryoandendosperm-specifictranscription.PlantMolBiol1996,32:1019-1027.)；自5"端第-128位喊基为脱水响应兀件CBFHV(SvenssonJT,CrosattiC，CampoliC，BassiR,StancaAM,CloseTJ,CattivelliL.Transcriptomeanalysisofcoldacclimationinbarleyalbinaandxanthamutants.PlantPhysiol2006,141:257-270.);自5'端第-1474位，-1137位，-837位，-168位碱基为热激蛋白基因表达元件CCAATB0X1(RiepingM,SchofflF.Synergisticeffectofupstreamsequences,CCAATboxelements,andHSEsequencesforenhancedexpressionofchimaericheatshockgenesintransgenictobacc0.MolGenGenet1992，231:226-232.);自5,端第-55位碱基为黑暗响应元件CDAATCAB2(MaxwellBBjAnderssonCR，PooleDSjKaySAjChoryJ.HY5,circadianclock—assosiated1，andacis—lelement，DETldarkresponseelement,mediateDETlregulationofchlorophylla/b-bindingprotein2expression.PlantPhysiol2003，133:1565-1577.);自5,端第-2079位，-1773位，-1243位，-739位碱基为铜离子诱导表达兀件CURECORECR(QuinnJMjMerchantS.Twocopper-responsiveelementsassociatedwiththechlamydomonasCyc6genefunctionastargetsfortranscriptionalactivators.PlantCell1995，7:623-628.);自5'端第-1714位，-1276位，-1005位，-906位，-725位，-587位，-380位，-333位，-230位碱基为DNA结合蛋白基因表达兀件D0FC0REZM(YanagisawaS.DofIandDof2transcriptionfactorsareassociatedwithexpressionofmultiplegenesinvolvedincarbonmetabolisminmaize.PlantJ2000，21:281-288.);自5,端第-2069位，-1631位，-1572位，-1566位，-1527位，-220位碱基为贮藏蛋白基因表达元件EB0XBNNAPA(Stalbei*gK，EllerstomM,EzcurraI,AblovS，RaskL.DisruptionofanoverlappingE-box/ABREmotifabolishedhightranscriptionofthenapAstorage—proteinpromoterintransgenicBrassicanapusseeds.Planta1996，199:515-519.)；自5'端第-2119位，-1252位，-1186位碱基为增强子元件EECCRCAH1(YoshiokaS，TaniguchiF，MiuraK，InoueT，YamanoT,FukuzawaH.ThenovelMybtranscriptionfactorLCRlregulatestheCO2-responsivegeneCahljencodingaperiplasmiccarbonicanhydraseinChlamydomonasreinhardti1.PlantCell2004,16:1466-1477.)；自5^端第-336位碱基为氮响应元件EMHVCHORD(MullerM,KnudsenS.ThenitrogenresponseofabarleyC—hordeinpromoteriscontrolledbypositiveandnegativeregulationoftheGCN4andendospermbox.PlantJ1993，4:343-355.);自5'端第-1805位，-1670位，-1441位，-1071位，-698位，-392位，-284位，-227位，-212位减基为光诱导兀件GATAB0X(GilmartinPM，SarokinL,MemelinkJ,ChuaNH.Molecularlightswitchesforplantgenes.PlantCell1990，2:369-378.);自5'端第-2137位，-315位碱基为病原菌和盐离子诱导表达元件GT-1(ParkHCjKimML,KangYHjJeonJMjYooJH，KimMCjParkCY，JeongJC，MoonBCjLeeJH，YoonHWjLeeSH，ChungWSjLimCO，LeeSY，HongJC，ChoMJ.Pathogen-andNaCl-1nducedexpressionoftheSCaM—4promoterismediatedinpartbyaGT-1boxthatinteractswithaGT-l-liketranscriptionfactor.PlantPhysiol2004，135:2150-2161.)；自5'端第-683位减基为ABA诱导表达兀件PROXBBNNAPA(EzcurraI，EllerstromM,WycliffeP，StalbergK，RaskL.1nteractionbetweencompositeelementsinthenapApromoter:boththeB~boxABA-responsivecomplexandtheRY/Gcomplexarenecessaryforseed-specificexpression.PlantMolBiol1999，40:699-709.)；自5^端第-1854位，-726位碱基为GA诱导元件PYRMIDINEBOXOSRAMYlA(MenaM，CejudoFJ，Isabel—LamonedaI，CarboneroP.ArolefortheDOFtranscriptionfactorBPBFintheregulationofgibberelIin-responsivegenesinbarleyaleurone.PlantPhysiol2002，130:111-119.);自5z端第-1517位，-950位碱基为水杨酸诱导元件WB0XATNPR1(Chenff,ProvartNJ,GlazebrookJ,KatagiriF，ChangHS,EulgemT,MauchF，LuanS，ZouG,WhithamSA,BudworthPR,TaoY.ExpressionprofilematrixofArabidopsistranscriptionfactorgenessuggeststheirputativefunctionsinresponsetoenvironmentalstresses.PlantCell2002，14:559-574.)。2H16启动子P2H16的序列分析结果表明2H16基因在水稻抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。表12H16启动子序列中的调控元件分析权利要求1.一种水稻病原菌诱导启动子，其特征在于:其基因序列如SEQIDN0.1所示。2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于:该启动子可以被病原菌激活，或者在用脱落酸、赤霉酸、水杨酸、氯化钠处理时能被激活。3.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于:序列中_513bp至-411bp和-411bp至-309bp为病原诱导关键区域。4.如权利要求1所述的启动子在植物品质改良及植物抗性改良中的应用。全文摘要本发明涉及植物基因工程
技术领域：
，提供了一个水稻病原菌诱导启动子，该启动子能够被水稻白叶枯病病菌黄单胞菌PXO99、PXO61，水稻细菌性条斑病病菌RS105以及玉米纹枯病菌YWK-196所激活，同时，也能被脱落酸、赤霉酸、水杨酸、氯化钠处理所激活。通过对启动子截短验证，确定了-513bp至-411bp和-411bp至-309bp这两个区段为受病原菌诱导的关键区域。可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，用于通过植物基因工程技术改善植物品质和其他有益生产性状。文档编号A01H5/00GK103074342SQ201310028478公开日2013年5月1日申请日期2013年1月24日优先权日2013年1月24日发明者储昭辉,丁新华,李宁申请人:山东农业大学