专利名称：建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法
技术领域：
本发明涉及鱼类的人工性别控制技术，属于一种鱼类生理遗传繁殖的方法，是以人工性逆转、筛选、扩群等技术控制鱼类性别技术领域。
背景技术：
生产单性雌鱼有几种方法可供选择:如人工选择、雌性激素直接诱导性逆转、雌核发育和性别特异的DNA探针技术等。但因人工挑选的劳动强度大，而且不能准确区分雌雄鱼。雌性激素直接诱导性逆转是给鱼苗投喂雌性激素，在激素的作用下，使雄性鱼发生性逆转，成为雌性鱼。这种方法不能达到全雌的目的，且有性激素残留的危险，不利于生产，许多国家早已禁用。雌核发育产生全雌鱼应用于养殖生产最大困难是二倍体出现频率低，仔幼鱼阶段成活率差，个体差异大，能达到性成熟的不多。中国科学院水生生物研究所和欧美等国的鱼类遗传育种学家将人工雌核生殖与激素诱导性反转结合起来，先后在鲤鱼和鲑鳟鱼类中生产出全雌性鱼类，并成功地用于养殖实践。性别特异的DNA探针与性反转结合生产全雌性养殖群体的技术的局限性是迄今为止，在脊椎动物中克隆的性别特异DNA序列还很少。至于全雌黄颡鱼繁育种群的建立，尤其是采用性逆转和黄颡鱼染色体特异分子标记的集成技术产生全雌黄颡鱼未见报道。
发明内容
黄颡鱼是淡水养殖的重要鱼类。在相同的养殖条件下，雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30%以上，因此，发明人发明了采用性逆转和雌核发育持续产生全雄黄颡鱼(专利号:ZL200610166518.8)的方法，建立了超雄黄颡鱼繁育种群(专利号:ZL200810197519.8)。为了持续生产全雄黄颡鱼，需要建立与超雄黄颡鱼繁育种群配套的全雌黄颡鱼繁育种群。发明人分析国内外鱼类性别控制的技术经验，提出采用激素性逆转结合黄颡鱼染色体特异分子标记的集成技术，以此达到建立全雌黄颡鱼繁育体系的目的。为了实现该目的，本发明采用的主要技术方案是:建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法，包括如下步骤:步骤1、 人工催产与人工授精:选择体表无伤、腹部膨大柔软、性腺发育良好的普通雌鱼(15 - 20尾/kg)用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮对每条鱼胸鳍基部进行一次注射或两次注射，注射总剂量为每kg雌鱼使用HCG2500 3000IU+LRH - A230 40ug+D0M6 10mg，将雌鱼置于 26°C 的水中，经 24 小时后挤出成熟的卵子，将卵子置于冰浴上低温保存备用；选取生殖突微红的雄鱼(15 - 20尾/kg),每 kg 雄鱼使用 HCG2500 3000IU+LRH - A215 20ug+D0M6 IOmg 注射催产，一次注射，催产后对雄鱼进行解剖取出精巢，用剪刀将精巢剪碎，再用精子保存液洗滤出精子，将精子置于冰浴上低温保存备用；取卵子和精子混合进行干法人工受精；把受精卵置于27°C生化培养箱中恒温孵育成雄鱼和雌鱼鱼苗并全部出膜；待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口饵料；
步骤2、性逆转:将普通雌性黄颡鱼性逆转成生理雄鱼，以卤虫幼体作为雄激素载体，将卤虫幼体在100 250IU的甲基睾丸溶液中浸泡I小时，再抽滤取出富集雄激素的卤虫投喂已开口摄食的人工繁殖黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续投喂40天，经雄性激素处理后存活的鱼苗中部分XX早雌鱼性逆转成为XX 生理雄鱼，XY 雄鱼不变；将用甲基睾丸处理过的所有幼鱼转移至水泥池用海马牌幼鳖粉状配合饲料培育至8cm以上，即可从外表区分雌雄；雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无；剔除XX早黄颡鱼，剩雄性黄颡鱼XX 、ΧΥ 备用；步骤3、性逆转鱼的遗传性别鉴定:用Y染色体特异标记Pf - Υ62引物对筛选出的性逆转黄颡鱼(XX 、ΧΥ )进行基因型PCR鉴定(Y染色体特异标记Pf - Υ62引物及具体的基因型PCR鉴定方法参照专利ZL200810236650.0黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法中的相关内容)，剔除含有Y染色体的黄颡鱼(即XY )，留XX 生理雄鱼备用；步骤4、扩群:ΧΧ早雌鱼和XX 生理雄鱼繁育种群的快速扩群，取步骤3中已被确认的养至性成熟的XX 生理雄鱼与普通XX早雌鱼交配，产生100%ΧΧ早雌鱼，在鱼苗开口时，取一部分XX早雌鱼按步骤2，用雄激素诱导性逆转成为XX 生理雄鱼；步骤5、全雌黄颡鱼繁育种群的建立:取步骤4中XX早雌鱼和XX 生理雄鱼交配，可持续生产XX早雌鱼，重复步骤4和步骤5，建立全雌黄颡鱼繁育种群。更进一步的方案是:所述所述的雌鱼的两次注射间隔时间10小时。更进一步的方案是:所述海马牌幼鳖粉状配合饲料(由福州海马饲料有限公司生产)的粗蛋白质含量为40%以上。本发明中，为了便于表述黄颡鱼的生理性别，用XX早表示雌鱼，用XX 表示生理雄鱼，用XY 表示雄鱼。该发明与现有技术相比较，具有`以下的有益效果:1.由于采用激素性逆转结合黄颡鱼染色体特异分子标记的集成技术，不用测交方法就能确定XX 生理雄鱼，缩短了育种时间，与测交方法比较，可以缩短一代。2.因省略了雌核发育步骤，可以降低人工诱导雌核发育对受精卵遗传物质的损伤，提高了 XX早雌鱼的获得率。3.有明显的经济和社会效益:由于采用了 XX早雌鱼和XX 生理雄鱼交配法，可以迅速获得大量的XX早雌鱼，产品可批量进行，节约了为YY 超雄黄颡鱼挑选配套雌鱼所产生的大量人力和物力。鉴此，本发明具有显著的应用价值。
图1为一种建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法技术原理图。图2为一种建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法的步骤流程方框图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步的说明。附图1示出了建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法技术原理图，附图2示出了建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法的步骤流程方框图，结合附图，具体论述本发明的工艺流程如下:步骤1、人工催产与人工授精:根据实验或工业化生产的需要，取若干数量的体表无伤、腹部膨大、柔软的普通雌黄颡鱼(15 -20尾/kg)，给每条鱼胸鳍基部进行两次注射，注射总剂量为每kg雌鱼使用HCG2500 3000IU+LRH -A230 40ug+D0M6 10mg。使用的催产剂及剂量如下:第一针为 LRH - A2Iug/ 尾，第二针为(HCG150IU+LRH - A2lug+D0M0.5mg) /尾，针距10小时。催产剂HCG、LRH - A2和DOM均为杭州动物药品厂和萧山第一兽药制造有限公司的产品。将鱼置于26°C的水中，距第二针约20小时后可挤出成熟的卵子，将之置于冰浴上低温保存备用。在雌鱼注射第二针的同时选取生殖突微红的雄鱼注射与雌鱼第二针同样剂量的催产剂，即HCG150IU+LRH - A2lug+D0M0.5mg/尾，雄鱼为(15 - 20尾/kg),因其精巢结构呈树枝状，催产后挤不出精液，需对其进行解剖取出精巢，用剪刀剪碎后用精子保存液洗滤出精子，仍置于冰浴上低温保存备用。根据需要取数百至千粒卵子与精子混合进行干法人工受精，受精卵在27°C生化培养箱中恒温孵育至鱼苗全部出膜。待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口饵料。步骤2、性逆转:将普通XX早黄颡鱼性逆转成XX 生理雄鱼，以卤虫幼体作为雄激素载体，将其先在200IU的甲基睾丸酮(MT ;sigma)溶液中浸泡I小时，再抽滤取出富集雄激素的卤虫投喂已开口 4天的人工繁殖黄颡鱼苗，每天上午、下午喝晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续投喂40天，实验证明存活率为60%以上，性逆转率达95%以上，由于黄颡鱼是雄性配子异性的鱼类，其性别体制是XX早/XY ，雌雄鱼的比例近似为1:1。所以，经性激素处理后成活的鱼苗中，约有50%是XX早雌鱼性逆转成XX 生理雄鱼，将经激素性逆转后的幼鱼(·包括XX 、ΧΥ 和XX早)一并转移至水泥池中，用蛋白质重量含量为40%以上的海马牌幼鳖粉状配合饲料(由福州海马饲料有限公司生产)养至8cm以上，根据雌雄黄颡鱼生殖器的区别(雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无)，剔除XX早黄颡鱼，剩雄性黄颡鱼(XX 、XY )备用。步骤3、性逆转鱼的遗传性别鉴定:用Y染色体特异标记Pf - Υ62引物对性逆转黄颡鱼进行基因型PCR鉴定(具体方法参照专利ZL200810236650.0黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法)，被确认为XY 雄鱼的弃之，留XX 生理雄鱼备用。步骤4、扩群:取步骤3中已被确认的XX 生理雄鱼养至性成熟后与普通的XX早雌鱼交配，产生100%χχ早雌鱼，当鱼苗开口 4天时，取一部分XX早雌鱼鱼苗按步骤2，用MT诱导性逆转成为XX 生理雄鱼。步骤5、全雌黄颡鱼繁育种群的建立:取步骤4中XX早雌鱼和XX 生理雄鱼交配，可持续生产XX早雌鱼，重复步骤4和步骤5，则可建立全雌黄颡鱼繁育种群。至此，即形成了持续生产全雌黄颡鱼的生产过程以及它们的繁育体系。
权利要求
1.建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法，其特征在于包括如下步骤: 步骤1、人工催产与人工授精:选择体表无伤、腹部膨大柔软、性腺发育良好的普通雌鱼(15 - 20尾/kg)用绒毛膜促性腺激素、鱼用促黄体素释放激素类似物2号和多巴胺拮抗物地欧酮对每条鱼胸鳍基部进行一次注射或两次注射，注射总剂量为每kg雌鱼使用HCG2500 3000IU+LRH - A230 40ug+D0M6 10mg，将雌鱼置于 26°C 的水中，经 24 小时后挤出成熟的卵子，将卵子置于冰浴上低温保存备用；选取生殖突微红的雄鱼(15 - 20尾/kg),每 kg 雄鱼使用 HCG2500 3000IU+LRH - A215 20ug+D0M6 IOmg 注射催产，一次注射，催产后对雄鱼进行解剖取出精巢，用剪刀将精巢剪碎，再用精子保存液洗滤出精子，将精子置于冰浴上低温保存备用；取卵子和精子混合进行干法人工受精；把受精卵置于27°C生化培养箱中恒温孵育成雄鱼和雌鱼鱼苗并全部出膜；待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口饵料； 步骤2、性逆转:将普通雌性黄颡鱼性逆转成生理雄鱼，以卤虫幼体作为雄激素载体，将卤虫幼体在100 250IU的甲基睾丸溶液中浸泡I小时，再抽滤取出富集雄激素的卤虫投喂已开口摄食的人工繁殖黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续投喂40天，经雄性激素处理后存活的鱼苗中部分XX早雌鱼性逆转成为XX 生理雄鱼，XY 雄鱼不变；将用甲基睾丸处理过的所有幼鱼转移至水泥池用海马牌幼鳖粉状配合饲料培育至8cm以上，即可从外表区分雌雄；雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无；剔除XX早黄颡鱼，剩雄性黄颡鱼XX 、ΧΥ 备用； 步骤3、性逆转鱼的遗 传性别鉴定:用Y染色体特异标记Pf - Υ62引物对筛选出的性逆转黄颡鱼XX 、XY 进行基因型PCR鉴定，剔除含有Y染色体的黄颡鱼XY ，留XX 生理雄鱼备用； 步骤4、扩群:ΧΧ早雌鱼和XX 生理雄鱼繁育种群的快速扩群，取步骤3中已被确认的养至性成熟的XX 生理雄鱼与普通XX早雌鱼交配，产生100%ΧΧ早雌鱼，在鱼苗开口时，取一部分XX早雌鱼按步骤2，用雄激素诱导性逆转成为XX 生理雄鱼； 步骤5、全雌黄颡鱼繁育种群的建立:取步骤4中XX早雌鱼和XX 生理雄鱼交配，可持续生产XX早雌鱼，重复步骤4和步骤5，建立全雌黄颡鱼繁育种群。
2.根据权利要求1所述建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法，其特征在于:所述的雌鱼的两次注射间隔时间10小时。
3.根据权利要求1所述建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法，其特征在于:所述海马牌幼鳖粉状配合饲料由福州海马饲料有限公司生产，蛋白质重量含量为40%以上。
全文摘要
本发明公开了一种建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法，包括如下步骤步骤1、人工催产与人工授精；步骤2、性逆转；步骤3、性逆转鱼的遗传性别鉴定；步骤4、扩群；步骤5、全雌黄颡鱼繁育种群的建立，最终建立全雌黄颡鱼繁育种群。该发明由于采用激素性逆转结合黄颡鱼染色体特异分子标记的集成技术，不用测交方法就能确定XX♂生理雄鱼，缩短了育种时间，与测交方法比较，可以缩短一代。因省略了雌核发育步骤，可以降低人工诱导雌核发育对受精卵遗传物质的损伤，提高了XX♀雌鱼的获得率，有明显的经济和社会效益。
文档编号A01K61/00GK103070120SQ20131003409
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者刘汉勤, 管波, 田华, 徐江, 侯昌春 申请人:水利部中国科学院水工程生态研究所