专利名称：一种铁皮石斛试管开花及结实的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种铁皮石斛试管开花及结实的方法。
背景技术：
铁皮石斛又称黑节草，属兰科附生兰类，为多年生草本植物。铁皮石斛是石斛中的极品，因其表皮呈铁绿色而得名，是著名的观赏兼药用兰花；现有技术中，对铁皮石斛的培养阶段中，大多对外植体原球茎进行诱导培养、增殖、分化、生根培养，得到小苗，但是对后期的试管开花及结实的研究比较少；铁皮石斛对生境条件要求苛刻，难开花，在栽培条件下，从种子萌发到开花通常需要3 4年；因此，对铁皮石斛开花的诱导对提高植物开花机理研究具有非常重要的意义；而现有的应用植物生物技术对铁皮石斛进行诱导开花时，虽可获得一定的开花诱导率，但是诱导率低，成本高，花朵小，且常出现不完整的花朵。并且，铁皮石斛花属虫媒花，自然条件下授粉率低，一般均为人工授粉，现有的授粉方法一般是:在晴天选择直径为0.8^1.2cm的健壮植株且具正常结构的优良花朵，拔出唇瓣用牙签或者大头针挑去花药放入雌蕊腔，将授粉后花朵套袋。但是上述方法存在以下缺陷:受自然环境因素影响大，授粉成功率低；授粉后植株没有得到单独特殊的营养供应导致营养元素不充足，直接影响果实发育，造成果夹小，结实率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛试管开花及结实的方法，诱导铁皮石斛开花及结实，从而提高铁皮石斛开花及结实率。为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:提供一种铁皮石斛试管开花及结实的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)原球茎诱导培养
选取健壮的生长良好的铁皮石斛茎段或蒴果作为外植体，将外植体消毒后，接种于下列无菌诱导培养基中:MS+BA1.5 2.0mg/L+NAA0.2 0.6mg/L+白糖30 50g/L+琼脂粉5.5 8g/L+ 土豆汁60 70ml/L+活性炭粉0.3 0.7g/L，在温度为23 25°C、光照强度为1500 25001x、光照时间为9 11小时/天的条件下，培养45 60天，形成原球茎；
(2)原球茎增殖培养
将生长良好的原球茎转接入下列增殖培养基中:MS+白糖30 50g/L+琼脂粉5.5 8g/L+6-BA0.5 0.8mg/L+NAA0.1 0.8mg/L+ 土豆汁 30 50ml/L+ 红薯汁 30 80ml/L+活性炭粉0.2 0.9g/L，进行增殖培养，培养的环境条件为:温度25 27°C，光照强度1800 30001x，光照时间10 12小时/天，培养周期45 60天；
(3)原球莖生根培养
将原球茎转入下列生根培养基中:MS+白糖20 50g/L+琼脂粉5.5 IOg/L+NAA0.4 0.9mg/L+IAA0.2 0.7mg/L+ 土豆汁 20 50ml/L+ 红薯汁 60 80ml/L+ 活性炭粉0.5 1.0g/L,在温度为23 27°C、湿度为40 60%、光照强度为2000 30001x、光照时间为11 13小时/天的条件下，培养70 100天，得到生根苗；
(4)生根苗诱导开花培养
将生根苗接种于下列诱导开花培养基中:MS+白糖30 60g/L+琼脂粉5.5 llg/L+土 汁 30 50g/L+BA0.2 0.6mg/L+NAA0.1 0.9mg/L+PPP3330.3 0.8mg/L+Spml.0
6.0mmol/L+ZTl.5 6mg/L，进行诱导开花培养，培养的环境条件为:温度22 25°C，湿度30 50%，光照强度2300 26001x，光照时间11 13小时/天，培养周期60 85天；
(5)授粉过程及结实培养
在经诱导开花培养基培养后的植株中，选取具有完整花结构的健壮植株，在无菌环境中进行人工授粉，再将授粉后的植株转接到下列授粉后培养基中:改良MS+白糖25 40g/L+ 琼脂粉 5.5 10g/L+NAA0.2 0.5mg/L+ 土豆汁 30 50ml/L+ 红薯汁 30 50ml/L+ 活性炭粉0.5 0.8g/L，在温度为22 25°C，湿度为40 60%，光照强度为2500 32001x,光照时间为12 14小时/天的条件下，培养65 110天，得到铁皮石斛蒴果；其中，改良MS培养基中KN03、KH2PO4和H3BO3用量为MS培养基中KN03、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余组分含量不变。每升MS培养基中含有的组分及各组分的重量如下:NH4N03 165mg, KNO3 1900mg、CaCl2.2Η20 440mg、MgSO4.7Η20 370mg、KH2PO4 170mg、KI 0.83mg、H3BO3 6.2mg、MnSO4.H2O16.9mg、ZnSO4.7H20 8.6mg、Na2MoO4.2H20 0.25mg、CuSO4.5H20 0.025mg、CoCl2.6H20
0.025mg、FeSO4.7Η20 27.8mg、Na2-EDTA.2H20 37.3mg、肌醇 100 mg、烟酸 0.5 mg、盐酸吡口多醇0.5 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、甘氨酸2 mg。所述铁皮石斛为广南红杆软脚铁皮石斛；所选取的铁皮石斛茎段的茎节间长为
1.5^3cm ;所选取的铁皮石斛蒴果的长为1.0^2.5cm、宽为0.8 2cm。所述外植体为铁皮石斛茎段，对该铁皮石斛茎段进行消毒的过程为:将选取好的铁皮石斛茎段流水冲洗lOmin，用手术刀从铁皮石斛茎段的节间切割，得到带有叶芽的茎段，并将该茎段置于无菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用无菌水冲洗:Γ5次。所述外植体为铁皮石斛蒴果，对该铁皮石斛蒴果进行消毒的过程为:将选取好的蒴果流水冲洗8min，用84消毒液擦拭果夹，放于无菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用无菌水冲洗3飞次；将消毒后的蒴果切开，取种子作为外植体备用。授粉时，选取高5cm以上、茎直径为0.Γ0.8cm、具有至少八片叶子展开且具有完整花结构的健壮植株作为授粉体。本发明的铁皮石斛试管开花及结实的方法，可以准确有效地调控铁皮石斛试管开花率；在铁皮石斛花芽形成的关键阶段，通过光照、温度、湿度及PPP333、Spm、土豆汁和ZT的共同协同调节作用，显著激活铁皮石斛试管苗开花的关键因子，从而提高铁皮石斛成花率；并且，本发明采用在无菌环境中授粉及授粉后采用专用培养基进行结实培养，从而为铁皮石斛提供丰富的氮、磷等营养元素，提高其结实率；本发明的方法可诱导植株健壮生长，果夹直径可达0.8 lcm，授粉结实率高达90%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。实施例1
在5月份，选择广南红杆软脚铁皮石斛，从该铁皮石斛中选取生长良好无明显病虫害的茎节间长为1.5cm的铁皮石斛茎段作为外植体，剪掉叶子在自来水下冲洗lOmin，取出放于超净工作台上的灭菌盘中；将枪形镊、手术刀放置于接种器械灭菌器中加热至300°C灭菌；用手术刀从该铁皮石斛茎段的节间切割，得到带有叶芽的茎段，并将该茎段置于无菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，倒出乙醇，再用手术刀切掉叶柄和叶鞘等多余组织，用0.1%的升汞浸泡6min，然后用无菌水冲洗3飞次；该消毒后的外植体接种于下列无菌诱导培养基中:MS+BAL 5mg/L +NAA0.2 mg/L+ 白糖 30g/L+ 琼脂粉 5.5g/L+ 土豆汁 60 ml/L+ 活性炭粉0.3g/L，在温度为25°C、光照强度为20001x、光照时间为10小时/天的条件下，培养50天，形成原球茎；
原球茎增殖培养
将生长良好的原球茎转接入下列增殖培养基中:MS+白糖30g/L+琼脂粉5.5g/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.lmg/L+土豆汁 30 ml/L+红薯汁 30 ml/L+活性炭粉 0.2 g/L，在温度为25°C，光照强度为25001x、光照为小时11/天，培养周期为55天的条件下进行增殖培养；
原球莖生根培养
将原球茎转入下列生根培养基中:MS+白糖20g/L+琼脂粉5.5g/L+NAA 0.4mg/L+IAA0.2mg/L+ 土豆汁20ml/L+红薯汁60ml/L+活性炭粉0.5g/L，采用28瓦日光色灯管作为光源，光照强度为30001x，在温度为24°C、湿度为40%、光照时间为12小时/天的条件下，培养90天，得到生根苗；
生根苗诱导开花培养
将生根苗接种于下列诱导开花培养基中:MS+白糖30g/L+琼脂粉5.5g/L+土豆汁30g/L+BA 0.2mg/L+NAA 0.lmg/L+PPP333 0.3mg/L+Spml.0mmoI/L+ ZT 1.5mg/L，采用 28 瓦日光色灯管作为光源，光照强度为25001x，在温度为25°C，湿度为50%，光照时间12小时/天的条件下，培养60天，进行诱导开花；其中，表I为采用诱导开花培养基进行开花培养与采用生根培养基进行开花培养的植株生长状态的对照:
表I
权利要求
1.一种铁皮石斛试管开花及结实的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)原球茎诱导培养 选取健壮的生长良好的铁皮石斛茎段或蒴果作为外植体，将外植体消毒后，接种于下列无菌诱导培养基中:MS+BA1.5 2.0mg/L +NAA0.2 0.6 mg/L+白糖30 50g/L+琼脂粉5.5^8g/L+ 土豆汁6(T70 ml/L+活性炭粉0.3^0.7g/L，在温度为23 25°C、光照强度为150(Γ25001χ、光照时间为9 11小时/天的条件下，培养45 60天，形成原球茎； (2)原球茎增殖培养 将生长良好的原球茎转接入下列增殖培养基中:MS+白糖3(T50g/L+琼脂粉5.5^8g/L+6-BA0.5 0.8mg/L+NAA0.Γθ.8mg/L+ 土豆汁 3(T50ml/L+ 红薯汁 3(T80ml/L+ 活性炭粉0.2^0.9g/L，进行增殖培养，培养的环境条件为:温度25 27°C，光照强度180(Γ30001χ，光照时间1(Γ12小时/天，培养周期45 60天； (3)原球莖生根培养 将原球茎转入下列生根 培养基中:MS+白糖2(T50g/L+琼脂粉5.5 10g/L+NAA0.4 0.9mg/L+IAA 0.2 0.7mg/L+ 土豆汁 20 50ml/L+ 红薯汁 60 80ml/L+ 活性炭粉 0.5 1.0g/L，在温度为23 27°C、湿度为40 60%、光照强度为200(Γ30001χ、光照时间为11 13小时/天的条件下，培养7(Γ100天，得到生根苗； (4)生根苗诱导开花培养 将生根苗接种于下列诱导开花培养基中:MS+白糖3(T60g/L+琼脂粉5.5 llg/L+ 土豆汁 3(T50g/L+BA0.2 0.6mg/L+NAA0.Γθ.9mg/L+PPP333 0.3 0.8mg/L+Spml.0 6.0mmoI/L+ZT1.5 6mg/L，进行诱导开花培养，培养的环境条件为:温度22 25°C，湿度30 50%，光照强度230(Γ26001χ，光照时间11 13小时/天，培养周期60 85天； (5)授粉过程及结实培养 在经诱导开花培养基培养后的植株中，选取具有完整花结构的健壮植株，在无菌环境中进行人工授粉，再将授粉后的植株转接到下列授粉后培养基中:改良MS+白糖25 40g/L+ 琼脂粉 5.5 10g/L+NAA 0.2 0.5mg/L+ 土豆汁 3(T50ml/L+ 红薯汁 3(T50ml/L+ 活性炭粉0.5 0.8g/L，在温度为22 25°C，湿度为40 60%，光照强度为250(Γ32001χ，光照时间为12 14小时/天的条件下，培养65 110天，得到铁皮石斛蒴果；其中，改良MS培养基中ΚΝ03、KH2PO4和H3BO3用量为MS培养基中KNO3、KH2PO4和H3BO3用量的三倍，其余组分含量不变。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛试管开花及结实的方法，其特征在于:每升MS培养基中含有的组分及各组分的重量如下=NH4NO3 165mg、KNO3 1900mg、CaCl2.2H20 440mg、MgSO4.7Η20 370mg, KH2PO4 170mg、KI 0.83mg, H3BO3 6.2mg、MnS04.H2O 16.9mg、ZnSO4.7H208.6mg、Na2MoO4.2H20 0.25mg、CuSO4.5H20 0.025mg、CoCl2.6H20 0.025mg、FeSO4.7H2027.8mg、Na2-EDTA.2H20 37.3mg、肌醇 100 mg、烟酸 0.5 mg、盐酸吡哆醇 0.5 mg、盐酸硫胺素0.I mg、甘氨酸2 mg ο
3.根据权利要求1所述的铁皮石斛试管开花及结实的方法，其特征在于，所述铁皮石斛为广南红杆软脚铁皮石斛；所选取的铁皮石斛茎段的茎节间长为1.5^3cm ;所选取的铁皮石斛蒴果的长为1.0^2.5cm、宽为0.8 2cm。
4.根据权利要求1所述的铁皮石斛试管开花及结实的方法，其特征在于，所述外植体为铁皮石斛茎段，对该铁皮石斛茎段进行消毒的过程为:将选取好的铁皮石斛茎段流水冲洗lOmin，用手术刀从铁皮石斛茎段的节间切割，得到带有叶芽的茎段，并将该茎段置于无菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒Imin,再用0.1%的升萊浸泡6min,然后用无菌水冲洗3 5次。
5.根据权利要求1所述的铁皮石斛试管开花及结实的方法，其特征在于，所述外植体为铁皮石斛蒴果，对该铁皮石斛蒴果进行消毒的过程为:将选取好的蒴果流水冲洗8min，用84消毒液擦拭果夹,放于无菌瓶中，用75%的乙醇溶液消毒lmin，再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用无菌水冲洗3飞次；将消毒后的蒴果切开，取种子作为外植体备用。
6.根据权 利要求1所述的铁皮石斛试管开花及结实的方法，其特征在于:授粉时，选取高5cm以上、茎直径为0.4^0.8cm、具有至少八片叶子展开且具有完整花结构的健壮植株作为授粉体。
全文摘要
本发明公开了一种铁皮石斛试管开花及结实的方法，该方法包括以下步骤采用铁皮石斛茎段或蒴果作为外植体进行诱导培养，再经原球茎增殖培养、原球茎生根培养、生根苗诱导开花培养及授粉过程及结实培养后，形成试管花及试管果实；该方法可以准确有效地调控铁皮石斛试管开花率；并且，本发明采用在无菌环境中授粉及授粉后采用专用培养基进行结实培养，提高其结实率；所结果实的果夹直径可达0.8～1cm，授粉结实率高达90%。
文档编号A01H4/00GK103210842SQ201310041790
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者林忠全 申请人:四川深达生物科技有限公司