专利名称：一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法
技术领域：
本发明涉及转基因植物检测，涉及一种同时测定转基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，更具体的说是一种测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时，通过喷洒一定浓度的抗生素溶液检测抗虫性纯度的方法。
背景技术：
转Bt基因抗虫棉已在生产上被广泛应用，并有效地控制了棉铃虫的危害。然而抗虫棉的抗虫性纯度直接影响着棉花的产量和品质，因此在棉花生产和经营中进行棉花种子的抗虫性检测是必不可少的环节。早在1998年中国农业大学的王保民等就已经开始利用双抗夹心ELISA检测方法对抗虫棉Bt杀虫晶体蛋白进行检测研究，并取得了初步效果。王坤波等(2000年)在苗床对转Bt基因抗虫棉子叶用卡那霉素溶液涂抹或浸润的方法进行了抗虫性研究，马丽华等(2000年)对转Bt基因抗虫棉子叶用卡那霉素溶液涂抹或浸润的方法进行了田间抗虫性研究，都取得了很好的效果。目前对转Bt基因抗虫棉的抗虫性纯度的常用测定方法主要有卡那霉素抗性基因田间种植检测法和试纸条法。卡那霉素抗性基因田间种植检测法主要是采取叶片涂抹的方法，在大田播种出苗后，用硫酸卡那霉素溶液涂抹子叶或真叶来检测种子的抗虫性，这种田间种植检测的方法需要在大田种植，对于棉花种子的经营者来说，通常需要延缓一个种植季节出售；而试纸条法则是通过检测毒蛋白来检测棉花中的抗虫性，快速、简便易行，但费用高，每百粒棉种仅试纸成本就得600-700元，因此该方法可作小范围急用使用，大规模生产经营的棉种企业或种植户不常使用。另外，检测转Bt基因抗虫棉的抗虫性纯度的方法还有PCR检测、Southern和Northern杂交、卡那霉素抗性室内基因鉴定、Gus基因检测、ELISA快速定量检测等，这些方法检测时间短，但需专业技术人员来操作，是科研单位实验室常用的方法。上述无论哪种检测方法都只能检测棉花种子的抗虫性，而对于棉花种子生产和销售者来说，在进行种子抗虫性检测的同时还往往需要另外再通过目测法、沙床培养法、毛巾培养法、恒温箱培养法等进行种子的发芽率的检测。
发明内容
为了避免上述现有检测技术的缺陷，本发明在适宜抗生素选择压力下，利用转Bt基因植株带有的新霉素磷酸转移酶(npt II )基因作标记所编码的产物可使卡那霉素等氨基糖苷类抗生素失活而能够正常生长，而非转Bt基因植株因不含有npt II基因作标记而不能够正常生长的机制，发明了一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法。本发明提供了一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，包括如下步骤:
1、配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液；2、湿沙准备:选择干净河沙与水按6-8:1比例拌匀备用；3、播种:将步骤2准备的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度2_4cm ;在湿沙上均匀摆放待检测的棉花种子100粒，种子间距不小于1.5cm ;然后再在种子上面覆上厚3-4cm步骤2准备的湿沙，压实；塑料盆顶上盖一层塑料薄膜；4、培养:将步骤3中播好种子的塑料盆摆放在安装日光灯的室内，光照时间12小时/天，室内温度20°C -30°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在湿沙表面均匀喷洒300mL步骤I中制备的硫酸卡那霉素水溶液;第5天开始每隔2-3天给湿沙喷水，防止湿沙表面变干；第7天统计发芽率，第13-15天观察抗虫性。苗势壮、叶色深绿的为抗虫株；苗势弱、子叶有黄斑或子叶全部变黄的为非抗虫植株。步骤I中配制的是0.4%的硫酸卡那霉素水溶液。 步骤2中选择干净河沙与水按7:1比例拌匀备用。步骤3中将步骤2所述的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度3cm ;在湿沙上均匀摆放待检测的棉花种子100粒，种子间距为1.5cm ;然后再在种子上面再覆上厚3cm步骤2所述的湿沙，压实；用一层塑料薄膜封住盆口。步骤4中所述的室内温度为26V。本发明的有益效果在于:1、操作简单易行:设备简单，一般人员都能操作；2、费用低，检测100粒棉种所用试剂费用约为试纸条法的1.5% ;3、本发明在检测转Bt基因棉花种子发芽率的同时可以检测棉花种子的抗虫性纯度；4、本方法的检测准确度达到100%。下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例中所用硫酸卡那霉素粉剂(纯度100%)购于上海生工生物工程技术服务有限公司，所用转Bt基因抗虫棉品种冀1316和非抗虫棉品种冀棉25的种子均由本所提供。实施例1:喷洒0.4%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时测定抗虫性纯度1,0.4%硫酸卡那霉素水溶液的配制:称取硫酸卡那霉素粉末试剂4g、蒸馏水1L，配制成0.4%的硫酸卡那霉素水溶液；2、湿沙的准备:选择干净河沙与水按7:1比例拌匀备用，湿沙以手攥能成团，松开后微散为宜；3、播种:将步骤2准备的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度3cm ;在不同所料盆的湿沙上均匀摆放转Bt基因抗虫棉冀1316种子和非抗虫棉品种冀棉25的种子各100粒，种子间距1.5cm ;然后再在种子上面覆上厚3cm步骤2准备的湿沙，压实；用一层塑料薄膜封住盆口；4、培养:将步骤3中播好种子的塑料盆摆放在安装日光灯的室内，光照时间12小时/天，室内温度26°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在湿沙表面均匀喷洒300mL步骤I中制备的硫酸卡那霉素水溶液，以喷洒蒸馏水为对照；第5天开始每隔2天给湿沙喷水，防止湿沙表面变干;第7天开始观察发芽率，第14天观察抗虫性。
统计处理组和对照组的种子的发芽率。结果处理组和对照组中的转Bt基因抗虫棉冀1316种子有89粒种子发芽长成植株，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子中有86粒种子发芽长成植株，说明转Bt基因抗虫棉冀1316种子发芽率为89%，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子发芽率为86%。观察处理组和对照组抗虫性，发现转Bt基因抗虫棉冀1316种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿，初步判断冀1316种子抗虫性纯度为100%。而非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子喷洒了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗势弱、子叶有黄斑或全部变黄，说明冀棉25对硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗虫，喷洒蒸馏水的冀棉25种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿。实施例2:喷洒0.45%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时测定抗虫性纯度按实施例1步骤I中的方法配制0.45%硫酸卡那霉素水溶液，步骤3中在塑料盆底部均匀铺上2cm厚的湿沙，步骤4中培养温度为30°C并第15天观察抗虫性，其余步骤与实施例1相同。统计处理组和对照组的种子的发芽率。结果处理组和对照组中的转Bt基因抗虫棉冀1316种子有88粒种子发芽长成植株，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子中有86粒种子发芽长成植株，说明转Bt基因抗虫棉冀1316种子发芽率为88%，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子发芽率为86%。观察处理组和对照组抗虫性，发现转Bt基因抗虫棉冀1316种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿，初步判断冀1316种子抗虫性纯度为100%。而非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子喷洒了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗势弱、子叶有黄斑或全部变黄，说明冀棉25对硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗虫，喷洒蒸馏水的冀棉25种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿。实施例3:喷洒0.5%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时测定抗虫性纯度按实施例1步骤I中的方法配制0.5%硫酸卡那霉素水溶液，步骤2中选择干净河沙与水按8:1比例拌匀备用，步骤3中在塑料盆底部均匀铺上4cm厚的湿沙，步骤4中培养温度为20°C并第15天观察抗虫性，其余步骤与实施例1相同。统计处理组和对照组的种子的发芽率。结果处理组和对照组中的转Bt基因抗虫棉冀1316种子有89粒种子发芽长成植株，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子中有85粒种子发芽长成植株，说明转Bt基因抗虫棉冀1316种子发芽率为89%，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子发芽率为85%。观察处理组和对照组抗虫性，发现转Bt基因抗虫棉冀1316种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿，初步判断冀1316种子抗虫性纯度为100%。而非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子喷洒了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗势弱、子叶有黄斑或全部变黄，说明冀棉25对硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗虫，喷洒蒸馏水的冀棉25种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿。实施例4:喷洒0.55%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率同时测定抗虫性纯度按实施例1步骤I中的方法配制0.55%硫酸卡那霉素水溶液，步骤2中选择干净河沙与水按6:1比例拌匀备用，步骤3 中在塑料盆底部均匀铺上3cm后的湿沙，步骤4中培养温度为25°C并第13天观察抗虫性，其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的种子的发芽率。结果处理组和对照组中的转Bt基因抗虫棉冀1316种子有89粒种子发芽长成植株，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子中有86粒种子发芽长成植株，说明转Bt基因抗虫棉冀1316种子发芽率为89%，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子发芽率为86%。观察处理组和对照组抗虫性，发现转Bt基因抗虫棉冀1316种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿，初步判断冀1316种子抗虫性纯度为100%。而非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子喷洒了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗势弱、子叶有黄斑或全部变黄，说明冀棉25对硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗虫，喷洒蒸馏水的冀棉25种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿。实施例5:喷洒0.6%的硫酸卡那霉素水溶液测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率同时测定抗虫性纯度按实施例1步骤I中的方法配制0.6%硫酸卡那霉素水溶液，步骤2中选择干净河沙与水按6:1比例拌匀备用，步骤4中培养温度为22°C并第13天观察抗虫性，其余步骤与实施例1相同。统计处理组和对照组的种子的发芽率。结果处理组和对照组中的转Bt基因抗虫棉冀1316种子有88粒种子发芽长成植株，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子中有85粒种子发芽长成植株，说明转Bt基因抗虫棉冀1316种子发芽率为88%，非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子发芽率为85%。观察处理组和对照组抗虫性，发现转Bt基因抗虫棉冀1316种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿，初步判断冀1316种子抗虫性纯度为100%。而非转Bt基因抗虫棉冀棉25种子喷洒了硫酸卡那霉素水溶液的所有植株苗势弱、子叶有黄斑或全部变黄，说明冀棉25对硫酸卡那霉素水溶液敏感，不抗虫，喷洒蒸馏水的冀棉25种子所有出苗长成的植株均苗势壮、叶色深绿。实施例6:本发明方法准确度测定试验将转Bt基因抗虫棉品种冀131`6、非抗虫棉品种冀棉25种子分成四份，于2012年4月29日-2012年6月10日分别同时利用卡那霉素抗性基因田间种植检测法、室内培养基检测法和本发明方法进行抗虫性纯度试验，利用恒温箱发芽率检测法和本发明方法进行发芽率比较试验，试验在河北省农林科学院棉花研究所小安舍实验站进行田间试验和室内试验。1.利用卡那霉素抗性基因田间种植法进行棉花种子的抗虫性纯度试验试验设2个处理，4月29号分别播种转Bt基因抗虫棉品种冀1316和非抗虫棉品种冀棉25 ;每处理3次重复；每重复小区面积20m2，随机区组排列。在5月25日晴朗天气情况下，用毛笔蘸取0.2%的硫酸卡那霉素水溶液均匀涂抹棉株顶部倒数第2片真叶，每次重复随机涂抹100株，7天后统计叶片黄斑株；抗虫纯度=(涂抹株数一黄斑株数)/涂抹株数X 100%。结果见表I。表I卡那霉素抗性基因田间种植检测法抗虫性检测试验结果
^n f,Ιμ lM2 3 抗也纯度 I
11 1 叶片黄斑株数叶片黄斑株数叶片黄斑株数 (％)冀1316000100
冀 ||25100100100 ~~0~ |
2.利用室内培养基检测法进行棉花种子的抗虫性纯度试验在培养室中进行，配制培养基时每升水加琼脂8g，调pH至6.5-6.8，消毒(120°C，30分钟)；将培养基保温至45°C左右，加入1.5_2g硫酸卡那霉素(硫酸卡那霉素可先用少量水溶解)，混匀，倒入已灭菌的250mL三角瓶中，每瓶20mL。将种子加入3%双氧水，置于超净工作台上,消毒2h，随后用灭菌水冲水2次，第3次再用灭菌水浸泡2h ;每瓶接种25粒，每100粒为I个重复，冀1316和冀棉25分别设3次重复；接种后的种子置于培养室中培养，温度为30°C，湿度为70%-90%，光照为150001x ;培养4天后，统计黄叶、绿叶、未萌发和死亡种子数；抗虫纯度=绿叶数/ (接种数一未萌发数一死亡数)X 100%。结果见表2。表2室内培养基抗虫性检测试验结果: SSii MU2 Φ:$￡3 I 抗虫纯度 品种 ----------—
倉录叶数成株数紐叶数成株数绿叶数成株数 (%)
权利要求
1.一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于包括如下步骤: ①配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液； ②湿沙准备:选择干净河沙与水按6-8:1比例拌匀备用； ③播种:将步骤②准备的湿沙均匀铺到直径50cm的塑料盆底部，厚度2-4cm;在湿沙上均匀摆放待检测的棉花种子100粒，种子间距不小于1.5cm ;然后再在种子上面覆上厚3-4cm步骤②准备的湿沙，压实；塑料盆顶上盖一层塑料薄膜； ④培养:将步骤③中播好种子的塑料盆摆放在安装日光灯的室内，光照时间12小时/天，室内温度20°C -30°C ;第3天揭掉塑料薄膜，在湿沙表面均匀喷洒300mL步骤①中制备的硫酸卡那霉素水溶液；第5天开始每隔2-3天给湿沙喷水，防止湿沙表面变干；第7天统计发芽率，第13-15天观察抗虫性；苗势壮、叶色深绿的为抗虫株；苗势弱、子叶有黄斑或子叶全部变黄的为非抗虫植株。
2.根据权利要求1所述的同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于:步骤①中配制的是0.4%的硫酸卡那霉素水溶液。
3.根据权利要求1所述的同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于:步骤②中选择干净河沙与水按7:1比例拌匀备用。
4.根据权利要求1所述的同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于:步骤③中所述塑料盆底部湿沙的厚度为3cm，摆放待检测棉花种子的间距为1.5cm，在种子上面覆盖湿沙的厚度为3cm。
5.根据权利要求1所述的同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、 抗虫性纯度的方法，其特征在于:步骤④中所述的室内温度为26°C。
全文摘要
本发明公开了一种同时测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率、抗虫性纯度的方法，其特征在于包括如下步骤①配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液；②湿沙准备；③播种；④培养。本发明在适宜抗生素选择压力下，利用转Bt基因植株带有的新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因作标记所编码的产物可使卡那霉素等氨基糖苷类抗生素失活而能够正常生长，而非转Bt基因植株因不含有nptⅡ基因作标记而不能够正常生长的机制，在测定转Bt基因抗虫棉种子发芽率的同时可以检测抗虫性纯度。本发明操作简单易行，费用低，其检测准确度达到100%。
文档编号A01G7/00GK103109622SQ20131005882
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者王凯辉, 郭宝生, 耿军义, 刘素恩, 赵存鹏, 马玉柱, 耿香利, 刘敏彦 申请人:河北省农林科学院棉花研究所