技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高结缕草高频再生系循环转化利用的方法。
背景技术：
草坪草具有景观功能、生态功能和运动功能。随着经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，草坪对于城市的绿化和环境改善起着越来越重要的作用。人们利用有性杂交、轮回选育等常规育种手段培育出一些草坪草新品种。转基因技术具有可以定向改良、打破生殖隔离等优点，是草坪草遗传改良的一种非常有前途的手段。
草坪草与其他植物一样，组织培养是遗传转化操作的前提。目前，尽管有不少报道已建立了各草种的再生体系，但由于大多数草坪草属异花授粉植物，遗传背景复杂，组织培养和遗传转化比其他植物更具有难度。
结缕草属植物（ZoysiaL.）是世界上重要的暖季型草坪草之一，具有很强的生命力和抗逆性，尤其以超群的耐践踏、耐瘠薄和抗病能力而著称。结缕草被誉为“最有前途”的草种，其形成的草坪弹力是早熟禾的30-40倍，耗水量比草地早熟禾少30-40%，建植和管理费用比早熟禾低80%左右（胡叔良，1997，发展草坪绿地关键问题的探讨，中国草地，5（2）：67-70）。正是由于结缕草所具有的这些独特的优良性状，使它们成为运动场、开放绿地、边坡绿化以及水土保持的重要草种，也是适合我国水资源贫乏国情的草坪草种。同时，结缕草也是我国唯一具有出口创汇能力的草种。因此，建立稳定高效的结缕草遗传转化体系不仅具有重要的理论意义，还有实际应用价值。
建立高效的植株再生体系是通过生物技术手段对植物遗传转化的前提。选择合适的外植体是建立再生体系的首要环节。在结缕草组织培养和遗传转化方面，前人已做过一些探索和研究，并取得了一定的研究成果。早在1987年，Al-Khayri等以日本结缕草成熟胚作为实验材料，通过切离成熟胚诱导愈伤组织，最终获得再生植株（A1-KhayriJM,HuangFH,ThompsonLF,eta1.1987,Invitroplantregenerationofzoysiagrass(ZoysiajaponicaSteud.).InVitro,23:3;A1-KhayriJM,HuangFH,ThompsonLF,eta1.1989,Plantregenerationofzoysiagrassfromembryo-derivedcallus.CropScience,29(5):1324-1325）。但结缕草种子较小，成熟胚的分离操作相对困难，限制其广泛应用。Inokuma等在1996年首次报道通过培养日本结缕草悬浮细胞系，用纯化得到的原生质体再生出植株（INOKUMAC,SUGIURAK,CHOC,eta1.1996,PlantregenerationfromprotoplastsofJapaneselawngrass.PlantCellReports,15(10):737-741）。但该操作不仅比较繁琐，而且再生率较低。之后，人们又以结缕草幼穗、幼胚和根茎作为外植体，试图通过体胚发生途径获得再生植株（NOHHY,CHOIJS,AHNBJ.1995,Plantregenerationthroughsomaticembryogenesisinzoysiagrasses(Zoysiaspp.).JournaloftheKoreanSocietyforHorticulturalScience,36(4):582-587；玄松南,陈慧哲,傅亚萍,等.1997，两种草坪草愈伤组织的诱导及其分化研究.浙江农业学报,9:295-299；GEYaxin,TINANorton,WANGZeng-Yu.2006,Transgeniczoysiagrass(Zoysiajaponica)plantsobtainedbyAgrobacterium-mediatedtransformation.PlantCellRep,25:792–798）。Yamamoto和Engelke认为，结缕草是以营养繁殖为主的品种，以其节段(分生组织)直接建立组培体系，有利新基因的引入，具有很多优点（YAMAMOTOI，ENGELKEMC.1997,Utilizinginvitrocultureforthedirectimprovementofturfgrasscultivars,Turfgrassbiotechnology:cellandmoleculargeneticapproachestoturfgrassimprovement.AnnArborPress,165-172）。但研究表明，该方法不仅取材受季节所限，无菌外植体的获得也是一个难题。
不管以哪种外植体再生植株，均有诸多因素影响再生率（齐春辉,韩烈保,黄麟,等.2005，几种因素对日本结缕草愈伤组织诱导与生长影响的研究.四川草业,4:1-3；张俊卫,唐蜻,包满珠.2006，日本结缕草成熟种子愈伤组织诱导及植株再生的影响因子分析.中国农业科学,39(2):368-374）。目前研究发现，影响结缕草植株再生率的关键因素是如何高效地将非胚性愈伤组织调整为胚性愈伤组织（李瑞芬,张敬原,赵茂林.2003，结缕草愈伤组织诱导及植株再生.园艺学报,30:355-357）。本发明的课题组在多年研究的基础上，建立了一套筛选结缕草高频再生系的方法（发明专利申请号：201210428997.1）。由于结缕草属异花授粉植物，每一粒种子可能代表不同的基因型，如果获得的高频再生系不能高效转化或利用，就失去了创制高频再生系的价值和意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高结缕草高频再生系循环转化利用的方法，包括如下三个方法和一个成套培养基。
第一个方法是一种获得转基因结缕草愈伤组织的方法，包括如下步骤：将结缕草愈伤组织用含目的基因的根癌农杆菌侵染后进行共培养，最后获得表达目的基因的转基因结缕草愈伤组织；
所述结缕草愈伤组织来源于按照包括如下步骤的方法制备得到的结缕草再生愈伤组织系：
将单粒结缕草种子依次经诱导培养、第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养，得到结缕草再生愈伤组织系；
所述诱导培养、所述第一次继代培养、所述第二次继代培养和所述第三次继代培养采用的培养材料均源自同一个种子；
所述诱导培养为将所述结缕草种子在诱导培养基中诱导培养，得到诱导愈伤组织；
所述第一次继代培养为将所述诱导愈伤组织在第一代继代培养基中第一代继代培养，得到第一次愈伤组织；
所述第二次继代培养为将所述第一次愈伤组织在第二代继代培养基中第二代继代培养，得到第二次愈伤组织；
所述第三次继代培养为将所述第三次愈伤组织在第三代继代培养基中第三代继代培养，得到再生愈伤组织系；
所述诱导培养基为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、终浓度的0.15mg/L6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、终浓度30g/L的蔗糖、终浓度7.0g/L的琼脂、终浓度0.5g/L的水解酪蛋白、终浓度1mg/L的VB1、终浓度1mg/L的VB2；
所述第一代继代培养基为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA（脱落酸）、终浓度为40g/L的蔗糖、终浓度为9.0g/L的琼脂、终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白、终浓度为1mg/L的VB1（维生素B1）和终浓度为1mg/L的VB2（维生素B2）；
所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35g/L、琼脂终浓度调整为8.0g/L，其他组分和终浓度不变；
所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30g/L、琼脂终浓度调整为7.0g/L，其他组分和终浓度不变。
在上述第一个方法中，所述诱导培养的条件为温度24-26℃、黑暗培养1个月；所述第一次、第二次、第三次继代培养条件均为温度24-26℃、黑暗培养20天；
和/或，在所述第一次继代培养后和所述第二次继代培养前还包括如下步骤：选取第一次继代愈伤组织中的胚性愈伤组织；
和/或，所述结缕草种子为去颖后的结缕草种子。
在上述第一个方法中，所述将结缕草愈伤组织用含目的基因的根癌农杆菌侵染按照包括如下步骤的方法进行：将所述结缕草愈伤组织浸泡于含目的基因的重组根癌农杆菌侵染液中于25℃、0.4个标准大气压条件下侵染10分钟；所述侵染液中含乙酰丁香酮50mg/L，所述侵染液中含目的基因的重组根癌农杆菌的OD600为0.5-0.6；
所述侵染液具体可为在无CaCl2的MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为30g/L的蔗糖、终浓度为10g/L的葡萄糖、终体积百分浓度为0.01%的TritonX-100、终浓度为4mg/LVB1、终浓度为100mg/L的甜菜碱、终浓度为50mg/L的乙酰丁香酮、含目的基因的重组根癌农杆菌的OD600为0.5—0.6；所述侵染液的pH值为5.2；
和/或，在所述侵染后和所述共培养前，还包括将经所述侵染的结缕草愈伤组织进行干燥处理1天的步骤；所述干燥处理1天按照包括如下步骤的方法进行：将经所述侵染的结缕草愈伤组织表面的液体吸干后，于干燥的滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天；
和/或，所述共培养按照包括如下步骤的方法进行：将经所述侵染的结缕草愈伤组织用共培养培养基于温度24—26℃、黑暗培养3—5天；
所述共培养培养基具体可为在无CaCl2的MS基本培养基中添加终浓度为8—12g/L的琼脂（具体可为10g/L的琼脂），终浓度为25—35g/L的蔗糖（具体可为30g/L的蔗糖）、终浓度为8—12g/L的葡萄糖（具体可为10g/L的葡萄糖）、终体积百分浓度为0.008—0.0012%的TritonX-100（具体可为0.01%的TritonX-100）、终浓度为3.5—4.5mg/L的VB1（具体可为4.0mg/L的VB1）、终浓度为80—120mg/L的甜菜碱（具体可为100mg/L的甜菜碱）、终浓度为0.8—1.2mg/L的2,4-D（具体可为1.0mg/L的2,4-D）和终浓度为50mg/L的乙酰丁香酮；所述共培养培养基的pH值为5.0—5.4（具体可为5.2）；
和/或，在所述共培养后，为了抑制农杆菌和非转基因细胞的繁殖并促进转基因细胞的生长，还可将经所述共培养的结缕草愈伤组织进行继代筛选培养的步骤，所述继代筛选培养可按照包括如下步骤的方法进行：将经所述共培养的结缕草愈伤组织用继代筛选培养基于24—26℃、黑暗条件下培养7天；所述继代筛选培养基具体可为在MS基本培养基中添加终浓度为7g/L的琼脂，终浓度为2mg/L的2,4-D，终浓度为0.1mg/L的6-BA，终浓度为250mg/L的头孢霉素，终浓度为30g/L的蔗糖和筛选剂，所述筛选剂的种类可根据转化目的片段上的筛选基因确定，其浓度根据实际情况确定，在本发明的实施例中使用的筛选剂为草铵膦，其在所述继代筛选培养基中的终浓度为3mg/L。
第二个方法是一种利用茎节分生组织获得结缕草再生植株的方法，包括如下步骤：
1）将含有结缕草匍匐茎从下至上第2个或第3个茎节分生组织的茎段用预培养培养基培养；所述茎段的长度可为0.6-1.0cm；
2）将经步骤1）所述培养的所述茎段进行芽诱导培养，获得带芽的茎段；
3）将步骤2）获得的所述带芽的茎段进行生根培养，获得具根茎叶的结缕草再生植株；
步骤1）中所述培养的时间为7天，光照条件为黑暗，温度为25—26℃；所述预培养培养基是在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L的KT（激动素），终浓度为0.2mg/L的2,4-D，终浓度为25g/L的蔗糖，终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白，终浓度为7g/L的琼脂；所述预培养培养基的pH值为5.8。
在上述第二个方法中，为了扩大外植体的数目或减少茎段的使用量，可将所述茎段在其茎节结处沿垂直于茎延伸的方向切开后再进行步骤2）所述芽诱导培养。
在上述第二个方法中，所述步骤2）是将经步骤1）所述培养的所述茎段用芽诱导培养基进行芽诱导培养，获得带芽的茎段；所述芽诱导培养基是在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为0.25mg/L的KT，终浓度为1.0mg/L的ZT，终浓度为0.1mg/L的NAA，终浓度为30g/L的蔗糖，终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白，终浓度为7g/L的琼脂；所述芽诱导培养基的pH值为5.8；
所述步骤2）中所述芽诱导培养的具体条件可为：培养时间为30天，光照条件为光周期为每天14小时光照、其余时间为黑暗，光照强度1000—3000umolm-2s-1，温度为24—26℃。
在上述第二个方法中，所述步骤3）是将步骤2）获得的所述带芽的茎段用生根培养基进行生根培养，获得具根茎叶的结缕草再生植株；所述生根培养基是在1/2的MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L的VB1，终浓度为0.25mg/L的IBA，终浓度为25g/L蔗糖，终浓度为7g/L的琼脂；所述生根培养基的pH值为5.8；
所述步骤3）中所述生根培养的具体条件可为：光照条件为光周期为每天14小时光照、其余时间为黑暗，光照强度1000—3000umolm-2s-1，温度为24—26℃。
在上述第二个方法中，步骤1）所述茎段来源于按照包括如下步骤的方法制备得到结缕草植株：
将上述第一个方法中所述第三次继代培养得到的结缕草再生愈伤组织系，依次经分化培养和生根培养，得到所述结缕草再生植株；
所述分化培养为将所述结缕草再生愈伤组织系在分化培养基中进行分化培养，得到生芽愈伤组织；所述分化培养基具体可为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L6-BA、终浓度为0.2mg/LKT、终浓度为0.5mg/LZT（玉米素）、终浓度为30g/L蔗糖、终浓度为7.0g/L琼脂、终浓度为0.5g/L水解酪蛋白，终浓度为1mg/LVB1、终浓度为1mg/LVB2；
在所述分化培养中，所述结缕草再生愈伤组织系的直径大小均具体为0.3-0.5cm；
所述生根培养为将所述生芽愈伤组织在生根培养基中进行生根培养，得到结缕草再生植株；所述生根培养基具体可为在1/2的MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/LVB1、终浓度为0.25mg/LIBA（3-吲哚丁酸）、终浓度为25g/L蔗糖和终浓度为7.0g/L琼脂；
所述分化培养和所述生根培养的条件均如下：温度为24-26℃，光周期为每天24小时中光照14小时、其余时间为黑暗，光照强度1000-3000umolm-2s-1条件下培养1个月。
第三个方法是一种获得结缕草转基因芽的方法，包括如下步骤：将上述第二个方法步骤2）获得的带芽的茎段用含目的基因的重组根癌农杆菌侵染，再进行共培养，最后获得表达目的基因的结缕草的芽即所述结缕草转基因芽；
在上述第三个方法中，所述用含目的基因的重组根癌农杆菌侵染按照包括如下步骤的方法进行：将所述茎段浸泡于含乙酰丁香酮50mg/L的所述重组根癌农杆菌菌液中，在1个标准大气压、140rpm条件下侵染30分钟后再于0.4个标准大气压下静置侵染10分钟；所述菌液的OD600可为0.5—0.6；所述侵染的温度具体可为28℃。
和/或，所述共培养按照包括如下步骤的方法进行：将经所述侵染的茎段置于上面铺有滤纸的共培养培养基上，于24—26℃、黑暗条件下共培养3—5天；
所述共培养培养基为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L的KT，终浓度为0.2mg/L的2,4-D，终浓度为50mg/L的乙酰丁香酮，终浓度为25g/L的蔗糖，终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白，终浓度为7g/L的琼脂；所述共培养培养基的pH值为5.2。
在上述第三个方法中，在所述共培养后还包括如下步骤：将经所述共培养的所述带芽的茎段用筛选培养基进行筛选培养；所述筛选培养的条件为：温度24—26℃、光照条件为黑暗；所述继代筛选培养基具体可为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L的KT，终浓度为0.2mg/L的2,4-D，终浓度为250mg/L的头孢霉素，终浓度为30g/L的蔗糖，终浓度为7g/L的琼脂和筛选剂，pH值为5.8；所述筛选剂的种类可根据转化目的片段上的筛选基因确定，其浓度根据实际情况确定，在本发明的实施例中使用的筛选剂为草铵膦，其在所述筛选培养基中的终浓度为3mg/L。
上述第一个方法获得的转基因结缕草愈伤组织经生根、分化及筛选培养，可获得转基因结缕草植株；
上述第三个方法获得的转基因结缕草芽经生根培养，可获得转基因结缕草植株。
本发明所提供的成套培养基包括上述第二个方法中的所述预培养培养基、所述芽诱导培养基和所述生根培养基中的三种、任意两种或任一种，所述成套培养基可用于获得结缕草体细胞再生植株。
实验证明，对结缕草高频再生愈伤组织系和由该高频再生愈伤组织系获得的再生植株来源的匍匐茎从上至下第2个和第3个茎节分生组织进行农杆菌侵染，获得表达目的基因的转基因结缕草的频率（即GUS染色率）显著高于普通的结缕草愈伤组织及其再生植株来源的茎节分生组织；在农杆菌侵染过程中，使用乙酰丁香酮50mg/L、抽真空处理10分钟及侵染后干燥处理1天的处理也可明显提高基因转化效率；使用芽诱导培养基Xuan7对结缕草匍匐茎从上至下第2个和第3个茎节分生组织可使芽诱导率达53.4%。
本发明所提供的方法为结缕草高频再生系的循环利用及基因转化提供了一个高效的途径，在结缕草的研究和生产领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为结缕草高频再生愈伤组织系的获得。
图2为对结缕草高频再生愈伤组织系进行基因转化及GUS染色结果。
图3为结缕草高频再生系愈伤组织的再生培养。
图4为结缕草高频再生系植株茎段的再生培养。
图5为对结缕草高频再生系植株茎段进行基因转化及GUS染色结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的结缕草以日本结缕草品种‘Qingdao’（克劳沃集团http://www.bjclover.com/center/aboutcp1.asp，产品目录号zj-011-02）为例，也可以换为其他所有结缕草属（ZoysiaWilld.）植物。
下述实施例中的质粒pCAMBIA3301购自金维克(中国)生命科学技术中心；根癌农杆菌C58购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心（BiovectorScienceLab）。
下述实施例中MS基本培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度如表1所示。
表1、MS基本培养基的溶质及其浓度
大量元素培养基中终浓度（g/L）NH4NO31.65KNO31.9KH2PO40.17MgSO4·7H2O0.37CaCl20.44微量元素培养基中终浓度（mg/L）
FeSO4·7H2O27.8Na2EDTA37.3MnSO4·4H2O22.3ZnSO4·4H2O8.6H3BO36.2KI0.83Na2MoO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl2·6H2O0.025有机成分培养基中终浓度（mg/L）甘氨酸2.0盐酸硫胺素（VB1）0.4盐酸吡哆素0.5烟酸0.5肌醇100
实施例1、转基因结缕草愈伤组织的获得
1、结缕草愈伤组织的获得
1）结缕草高频再生愈伤组织系的获得
取日本结缕草品种‘Qingdao’种子先用细砂纸打磨去颖，再用自来水冲洗约1h，无菌条件下70%酒精处理30s，然后用10%次氯酸钠溶液（体积百分比，并加入1滴吐温20）于超声清洗仪中处理10min，以无菌水清洗6次，并用无菌水浸泡过夜，准备接种。
将前天消毒处理的种子接种于优化的诱导培养基中，在温度24-26℃、黑暗培养1个月，获得诱导愈伤组织。所述诱导培养基为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的2,4-D、终浓度的0.15mg/L6-BA、终浓度30g/L的蔗糖、终浓度7.0g/L的琼脂、终浓度0.5g/L的水解酪蛋白、终浓度1mg/L的VB1、终浓度1mg/L的VB2，pH5.8。
将上一步获得的诱导愈伤组织接种于第一代继代培养基中，在温度24-26℃、黑暗条件下培养20天，得到第一次愈伤组织；所述第一代继代培养基为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA、终浓度为40g/L的蔗糖、终浓度为9.0g/L的琼脂、终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白、终浓度为1mg/L的VB1和终浓度为1mg/L的VB2，pH5.8。
从上一步获得的第一次愈伤组织中挑选胚性愈伤组织（方法为剥离松软、选取增殖明显或质地变硬的第一次继代愈伤组织系）接种于第二代继代培养基中，在温度24-26℃、黑暗条件下培养20天，得到第二次愈伤组织；所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35g/L、琼脂终浓度调整为8.0g/L，其他组分和终浓度不变，pH5.8。
将所述第二次愈伤组织接种于第三代继代培养基，在温度24-26℃、黑暗条件下培养20天，得到高频再生愈伤组织系；所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30g/L、琼脂终浓度调整为7.0g/L，其他组分和终浓度不变，pH5.8。
结缕草高频再生愈伤组织系获得的过程如图1所示，其中，图1中的A为未消毒结缕草种子；B为消毒结缕草种子接种于优化的诱导培养基；C为消毒结缕草种子在优化的诱导培养基上诱导培养15天后出现的愈伤组织；D为第一次继代培养建立的愈伤组织系（每个方格内的愈伤组织为来源于同一粒种子的愈伤组织系）；E为第二次继代培养的愈伤组织系；F为经过3次继代培养获得的单个高频再生愈伤组织，该愈伤组织色泽鲜艳、结构致密，为胚性愈伤组织。
经过上述诱导和三次继代培养获得的结缕草愈伤组织具有很强的再生能力，以下称为高频再生愈伤组织，来源于同一粒种子的愈伤组织组成一个愈伤组织系。
2）对照—普通愈伤组织系的获得
按照步骤1）的方法进行，不同之处在于：第二次继代培养基和第三次继代培养基的组分及其浓度与第一次继代培养基相同，得到普通愈伤组织系。
2、含有目的基因的重组根癌农杆菌的获得
将质粒pCAMBIA3301（含有标记基因或目的基因gus基因以及筛选基因为bar基因）电击转化根癌农杆菌C58菌株中，获得含有目的基因的重组根癌农杆菌C58/pCAMBIA3301。
3、侵染液的制备
将含有目的基因的重组根癌农杆菌C58/pCAMBIA3301分别用液体LB培养基培养至OD600达到0.8-1.0，3500rpm离心30分钟，收集菌体，重悬于侵染培养基中，获得pH值为5.2的、在无CaCl2的MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分的侵染液A：终浓度为30g/L的蔗糖、终浓度为10g/L的葡萄糖、终体积百分浓度为0.01%的TritonX-100、终浓度为4mg/LVB1、终浓度为100mg/L的甜菜碱、终浓度为0、50或100mg/L的乙酰丁香酮、OD600为0.5—0.6的含目的基因的重组根癌农杆菌C58/pCAMBIA3301；
按照上述同样的方法，制备得到侵染液B，侵染液B是将侵染液A中的重组根癌农杆菌C58/pCAMBIA3301换为不含有质粒pCAMBIA3301的根癌农杆菌C58空菌株。
4、农杆菌侵染、共培养、继代筛选培养获得转基因愈伤组织
在侵染的愈伤组织（高频再生愈伤组织系和普通愈伤组织系）、侵染液中的乙酰丁香酮的浓度（终浓度为0、50或100mg/L）、侵染过程中抽真空处理（抽真空和非抽真空）和侵染后干燥处理（干燥处理1天和不进行干燥处理）四个因素分别设不同的处理，具体如下：
a）侵染的愈伤组织不同
处理a-1：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，于25℃抽真空（0.4个标准大气压）条件下，用步骤3制备的含50mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天后进行共培养；
处理a-2：取步骤1中2）获得的普通愈伤组织系，于25℃抽真空（0.4个标准大气压）条件下，用步骤3制备的含50mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天后进行共培养；
b）侵染液中乙酰丁香酮的浓度不同
处理b-1：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，于25℃抽真空条件下，用步骤3制备的含0mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天后进行共培养；
处理b-2：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，于25℃抽真空条件下，用步骤3制备的含50mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天后进行共培养；
处理b-3：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，于25℃抽真空条件下，用步骤3制备的含100mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天后进行共培养；
c）侵染过程中抽真空处理不同
处理c-1：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，分别于25℃抽真空（0.4个标准大气压）条件下用步骤3制备的含50mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天后进行共培养；
处理c-2：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，分别于25℃非抽真空（1个标准大气压）条件下用步骤3制备的含50mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天后进行共培养；
d）侵染后干燥处理不同
处理d-1：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，分别于25℃抽真空（0.4个标准大气压）条件下，用步骤3制备的含50mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体，于干燥的无菌滤纸上，24—26℃、黑暗条件下放置1天（即干燥处理）后进行共培养；
处理d-2：取步骤1中1）获得的高频再生愈伤组织系，分别于25℃抽真空（0.4个标准大气压）条件下用步骤3制备的含50mg/L乙酰丁香酮的侵染液A浸泡10分钟；取出愈伤组织后吸干表面液体后进行共培养；
上述共培养的条件为温度25℃、黑暗条件下培养3天；上述共培养使用的共培养培养基为在无CaCl2的MS基本培养基中添加终浓度为10g/L的琼脂，终浓度为30g/L的蔗糖、终浓度为10g/L的葡萄糖、终体积百分浓度为0.010%的TritonX-100、终浓度为4.0mg/L的VB1、终浓度为100mg/L的甜菜碱、终浓度为1.0mg/L的2,4-D和终浓度为50mg/L的乙酰丁香酮；所述共培养培养基的pH值为5.2；上述共培养是在所述共培养培养基铺一层无菌滤纸后再接种愈伤组织。
将经上述处理a-1~d-2共8个处理得到的结缕草愈伤组织再分别用继代筛选培养基于24—26℃、黑暗条件下培养7天；所述继代筛选培养基为在MS基本培养基中添加终浓度为7g/L的琼脂，终浓度为2mg/L的2,4-D，终浓度为0.1mg/L的6-BA，终浓度为250mg/L的头孢霉素，终浓度为30g/L的蔗糖和终浓度为3mg/L的草铵膦。
5、GUS染色鉴定
将步骤4处理a-1~d-2共8个处理经所述继代筛选培养基培养后的结缕草愈伤组织进行GUS染色鉴定（图2），统计侵染的愈伤组织数（记为M）、染色的愈伤组织数（记为N）和染色率（记为O，O=N/M×100%）,实验重复三次，结果用平均值±标准差表示，如表2所示。
表2、不同处理获得转基因愈伤组织的染色率（%）统计结果
注：表2中的AS指乙酰丁香酮；“*”表示与同一因素另一处理水平的结果相比在p<0.05差异显著，其中，处理b-2和b-3的结果后的“*”均表示与处理b-1的结果相比在p<0.05差异显著。
上述GUS染色鉴定的具体方法如下：
将准备好的材料材浸泡在GUS染液（购自北京奥博来科技有限责任公司，产品目录编号S101L）中，于25-37℃保温1h至过夜；将染色后的材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料（即用相同条件下侵染液B侵染得到的愈伤组织）呈白色；肉眼或显微镜下观察，白色背景下的蓝色小点即为GUS表达位点。
对结缕草高频再生愈伤组织系进行基因转化及GUS染色结果如图2所示。其中，A为结缕草高频再生愈伤组织系；B为农杆菌侵染结缕草高频再生愈伤组织系后的共培养；C为空菌株C58侵染结缕草高频再生愈伤组织系作为阴性对照经GUS染色后未染出蓝色；D为处理c-1的愈伤组织经GUS染色后呈蓝色；E为处理d-1的愈伤组织经GUS染色后呈蓝色。
表2和图2的结果表明，使用高频再生愈伤组织系作为侵染对象，在农杆菌侵染中，侵染液含乙酰丁香酮50mg/L、侵染时进行抽真空处理10分钟、侵染后进行干燥处理1天的染色率（即基因转化效率）显著高于其他处理。
实施例2、利用茎节分生组织获得结缕草再生植株
由于结缕草属多年生植物，在辽州半岛和胶州半岛适宜生长的条件下，第二年可繁殖种子再利用。但在北京等地方，结缕草植株第二年抽穗率和结实率均较低，甚至很难抽穗和结实。组织培养中筛选获得的结缕草高频再生系不仅费时费力，且获得的高频再生系的性状和再生性都很好。为了提高结缕草高频再生系的利用效率，除了直接利用愈伤组织系转化或获得再生植株外，本发明还提供了一种优化的利用茎段分生组织获得结缕草再生植株的方法（本实施例）及进行遗传转化的方法（实施例3）。
1、将实施例1步骤1的1）中第三次继代培养得到的结缕草再生愈伤组织系依次经分化培养和生根培养，得到结缕草再生植株。
所述分化培养为将直径大小为0.3-0.5cm的所述结缕草再生愈伤组织系在分化培养基中进行分化培养，得到生芽愈伤组织；所述分化培养基为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L6-BA、终浓度为0.2mg/LKT、终浓度为0.5mg/LZT、终浓度为30g/L蔗糖、终浓度为7.0g/L琼脂、终浓度为0.5g/L水解酪蛋白，终浓度为1mg/LVB1、终浓度为1mg/LVB2；
所述生根培养为将所述生芽愈伤组织在生根培养基中进行生根培养，得到结缕草再生植株；所述生根培养基为在1/2的MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/LVB1、终浓度为0.25mg/LIBA、终浓度为25g/L蔗糖和终浓度为7.0g/L琼脂；
所述分化培养和所述生根培养的条件均如下：温度为24-26℃，光周期为每天24小时中光照14小时、其余时间为黑暗，光照强度1000-3000umolm-2s-1条件下培养1个月。
结缕草高频再生系愈伤组织再生出植株及田间种植如图3所示，其中，A为结缕草高频再生系愈伤组织在第三次继代培养基上；B为结缕草高频再生系愈伤组织接种于所述分化培养基上培养7天；C为结缕草高频再生系愈伤组织接种于分化培养基上培养15天；D为结缕草高频再生系愈伤组织接种于的分化培养基上培养30天；E为结缕草高频再生植株在生根培养基上；F为结缕草高频再生株系移栽田间繁殖。
2、利用茎节分生组织获得结缕草再生植株
1）消毒：从步骤1获得的结缕草再生植株的匍匐茎上取带茎节（茎节处含分生组织，具有分化成芽的能力）的茎段，进行消毒，具体方法如下：无菌条件下用70%酒精处理30s，无菌水清洗三次，用0.1%升汞溶液（加入一滴吐温20）于超声波清洗仪中处理10min，再用无菌水清洗。
2）预培养：无菌条件下将经步骤1）消毒后的茎段再切成0.6—1.0cm长的含1个茎节的茎段（设含匍匐茎从下至上第1个茎节的茎段即茎段a、从下至上第2个茎节的茎段即茎段b和从下至上第3个茎节的茎段即茎段c三种处理），接种于预培养培养基（设预培养培养基Ⅰ和预培养培养基Ⅱ两种处理）中、于25—26℃、黑暗条件下培养7天；
所述预培养培养基Ⅰ为在1/2的MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L的KT，终浓度为0.2mg/L的2,4-D，终浓度为20g/L的蔗糖，终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白，终浓度为7g/L的琼脂；所述预培养培养基的pH值为5.8；
所述预培养培养基Ⅱ为在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L的KT，终浓度为0.2mg/L的2,4-D，终浓度为25g/L的蔗糖，终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白，终浓度为7g/L的琼脂；所述预培养培养基的pH值为5.8。
3）芽诱导培养：将经步骤2）预培养的茎段在茎节结处沿垂直于茎延伸的方向切开（以获得更多的含茎节分生组织的茎段）后接种于芽诱导培养基（1/2的MS基本培养基或表3所示编号为Xuan1—7的七种不同芽诱导培养基）中、于温度24-26℃、光周期为每天24小时中光照14小时其余时间为黑暗、光照强度为1000-3000umolm-2s-1的条件下培养1个月，获得带芽的茎段，并统计芽诱导率（=获得带芽的茎段数/接种的切开茎段数×100%）；
4）生根培养：将带芽的茎段接种于生根培养基中、于温度24-26℃、光周期为每天24小时中光照14小时其余时间为黑暗、光照强度为1000-3000umolm-2s-1的条件下培养1个月，获得具有根茎叶的结缕草再生植株，之后移栽至温室及大田生长繁殖；
所述生根培养基是在1/2的MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L的VB1，终浓度为0.25mg/L的IBA，终浓度为25g/L蔗糖，终浓度为7g/L的琼脂；所述生根培养基的pH值为5.8。
上述步骤1）—4）的培养过程中，在步骤2）进行预培养使用的茎段、骤2）进行预培养使用的预培养培养基和步骤3）进行芽诱导培养使用的芽诱导培养基三处分别设置不同的处理，每种处理三次重复，统计各处理的芽诱导率，具体方法和结果如下：
A）预培养培养基不同
按照上述步骤1）—4）的方法进行，具体是将所述茎段a、b和c等量混合，随机分成两份（每份设三次重复，每个重复含茎段30个），每份在步骤2）分别使用所述预培养培养基Ⅰ或所述预培养培养基Ⅱ进行所述预培养，步骤3）使用的芽诱导培养培养基均为1/2的MS基本培养基，最后获得具有根茎叶的结缕草再生植株。
结果：用预培养培养基Ⅱ进行预培养的芽诱导率较高（达15—20%），显著高于用预培养培养基Ⅰ进行预培养的芽诱导率（5—8%）。
B）预培养的茎段不同
按照上述步骤1）—4）的方法进行，具体是将步骤1）获得的茎段a、b和c（每种茎段30个，分成三个重复），在步骤2）均使用所述预培养培养基Ⅱ进行所述预培养，在步骤3）均使用所述芽诱导培养培养基Xuan7，最后获得具有根茎叶的结缕草再生植株。
结果：茎段b和c的芽诱导率平均值都为53.4%，茎段a的芽诱导率仅为10—17%。
C）芽诱导培养培养基不同
按照上述步骤1）—4）的方法进行，具体是将茎段b和c等量混合，随机分成七份（每份设三次重复，每个重复含茎段30个），每份在步骤2）均使用所述预培养培养基Ⅱ进行所述预培养，在步骤3）分别使用表3所示的7种芽诱导培养培养基，最后获得具有根茎叶的结缕草再生植株。
结果：使用芽诱导培养培养基Xuan7进行芽诱导培养的芽诱导率最高，为53.4%，使用其它芽诱导培养培养基的结果如表3所示。
以上各处理获得的带芽茎段经步骤4）所述生根培养获得具有根茎叶的结缕草再生植株的比率均为100%。
表3、结缕草茎节分生组织在不同芽诱导培养基中的芽诱导率结果
注：表3中编号为Xuan1—Xuan7的芽诱导培养基为在MS基本培养基中添加表中对应的激素，另外还添加终浓度为30g/L的蔗糖，终浓度为0.5g/L的水解酪蛋白，终浓度为7g/L的琼脂；pH值为5.8。接种的切开茎段数是指经步骤2）预培养的茎段在茎节结处沿垂直于茎延伸的方向切开（以获得更多的含茎节分生组织的茎段）所获得的茎段数。
结缕草高频再生系植株茎段的再生培养如图4所示。其中，A为结缕草高频再生系植株茎段b和c在预培养基培养基Ⅱ上预培养10天；B为经预培养后的茎段在茎节处切开接种于芽诱导培养基上；C为切开的茎段在优化的芽诱导培养基上培养20天获得的带芽茎段；D为带芽茎段在生根培养基上长成的具有根茎叶的再生植株。
实施例3、利用茎节分生组织获得转基因结缕草芽
1、利用茎节分生组织获得转基因结缕草芽
1）将实施例2步骤2的2）获得的茎段b和c接种于所述预培养培养基Ⅱ中，于25—26℃、黑暗条件下培养7天；将茎段在茎节结处沿垂直于茎延伸的方向切开后浸泡于含目的基因重组农杆菌C58/pCAMBIA3301的菌液中，于28℃、140rpm、非抽真空（即1个标准大气压）下侵染30分钟后，再将盛有茎段和菌液的三角瓶放入真空泵中，抽真空（即0.4个标准大气压）静置侵染10分钟。将侵染后的茎段用灭菌滤纸吸干多余液体，置于铺有滤纸的共培养基培养基（在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：1.0mg/L的KT，0.2mg/L的2,4-D，50mg/L的乙酰丁香酮、25g/L的蔗糖、0.5g/L的水解酪蛋白和7g/L的琼脂，pH值为5.8）上，24—26℃、黑暗条件下培养3—5天，再转移至筛选培养基（在MS基本培养基中添加具有如下终浓度的各组分：1.0mg/L的KT，0.2mg/L的2,4-D，3mg/L的草铵膦，250mg/L的头孢霉素，30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，pH值为5.8）上，在24-26℃、黑暗条件下培养7天，获得待测转基因结缕草芽X。
所述含目的基因重组农杆菌C58/pCAMBIA3301的菌液的制备方法如下：将重组根癌农杆菌C58/pCAMBIA3301用液体LB培养基培养至OD600达到0.8-1.0，3500rpm离心30分钟，收集菌体，重悬于MS基本培养基中使OD600为0.5—0.6，并添加50mg/L的乙酰丁香酮。
2）对照：按照步骤1）的方法进行，不同之处在于：侵染所用的相同部位的茎段取自实施例1步骤1的2）普通结缕草愈伤组织按照实施例2步骤1的分化培养和再生培养获得的再生植株；获得待测转基因结缕草芽CK。
在1）和2）的处理中，每种使用茎段至少30个，重复三次。
2、GUS鉴定结缕草转基因芽
方法：与实施例1中步骤5的GUS鉴定方法相同。
结果：待测转基因结缕草芽X中，经GUS染色呈蓝色的比例为13.6%，待测转基因结缕草芽CK中，经GUS染色呈蓝色的比例仅为3.5%。
对结缕草高频再生系植株茎段进行基因转化及GUS染色结果如图5所示。其中，A为结缕草高频再生系植株茎段的预培养；B为结缕草高频再生系植株茎段经农杆菌侵染后的共培养；C为空菌株C58侵染茎段作为对照经GUS染色后芽未被染成蓝色；D为重组根癌农杆菌C58/pCAMBIA3301侵染茎段经GUS染色后茎段上的芽被染成蓝色。