用于诊断和治疗结肠癌相关疾病的基于微小rna的方法和组合物的制作方法

用于诊断和治疗结肠癌相关疾病的基于微小rna的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供诊断和治疗结肠癌的新方法和组合物。本发明还提供鉴定肿瘤形成抑制剂的方法。
【专利说明】用于诊断和治疗结肠癌相关疾病的基于微小RNA的方法和组合物
[0001]本申请是申请日为2007年7月12日、申请号为200780033066.9的同名申请的分
案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2006年7月13日提交的美国临时申请N0.60/807，304和2007年6月I日提交的美国临时申请N0.60/932，736的权益，所述临时申请的公开内容以引用方式并入本文。
[0004]关于联邦赞助研究的说明
[0005]本发明在政府资助下进行，且政府在国立卫生研究院授权N0.XXX和国立癌症研究所授权下对所述发明具有权力。
【背景技术】
[0006]结肠腺癌是世界上主要的癌症死亡原因、
[0007]结直肠癌是美国第三最常见和第二主要的癌症死亡原因2。散发性结肠腺癌最初为腺瘤并通过分子进展、细胞和组织的变化来演化3。虽然5-年死亡率在最近30年内适当降低4，仍需要鉴定所述疾病的新预后生物标记物和治疗靶。目前，化疗法具有重要的治疗价值但手术是治疗的唯一治愈形式5。
[0008]理想的治疗靶应该与疾病原因上相关，且经可设计治疗干预进行修正；而理想的生物标记应该易于测量并与临床结果具有强相关性。微小RNA符合这两个标准6_8。
`[0009]微小RNA为18-25个核苷酸的非编码RNA分子，其调节许多基因的翻译9。从发现它们开始1CI’n，已经发现它们调节多种细胞过程，包括细胞凋亡12_14，分化1(l’n’15和细胞增殖16O微小RNA在癌变中起因果作用16，17。微小RNA的表达水平在大多数肿瘤类型18’19，包括结肠癌&22中被改变。在大多数慢性淋巴细胞白血病中微小RNA miR-15和miR_16a被删除或下调23。特异性微小RNA的实验操作调节小鼠模型系统中肿瘤发育16’24_26。还证实了微小RNA对慢性淋巴细胞白血病7、肺癌8、和神经母细胞瘤21的预后潜力。
[0010]微小RNA的异常表达可能引起癌变，抑制特异性微小RNA可能具有治疗意义。可以设计修饰的反义寡核苷酸来特异性抑制微小RNA的功能28。Antagomirs为一种被证明在抑制小鼠体内微小RNA功能中是有效的反义寡核苷酸29。由于微小RNA功能的特异性抑制剂易于设计，使得其成为治疗靶的候选。
[0011]发明概述
[0012]在一个广义的方面，本文提供一种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法。所述方法包括:测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中相对于对照样品中对应miR基因产物的水平，测试样品中所述miR基因产物水平的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病或处于发展结肠癌相关疾病的风险中。在一个具体方面，所述至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。在一个实施方案中，所述的一种miR基因产物是miR-21。
[0013]在另一广义的方面，本文提供一种测试至少结肠癌相关疾病应答的开始、对结肠癌相关疾病应答的倾向或降低的存活预后的方法，其包括:
[0014](I)测定来自受试者的样品中至少一种标记物的表达水平；所述至少一种标记物包括至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；
[0015](2)比较步骤(1)中测定的表达水平与来自健康受试者的样品中所述标记物的对照表达水平；和
[0016](3)当步骤(2)中的比较结果显示:i)受试者中的至少一个标记物的表达水平比对照中的高，或ii)受试者中的至少一个标记物的表达水平比对照中的低时，判断受试者患有结肠癌相关疾病。
[0017]样品可包括组织、血液、血浆、血清、尿和粪便中的一种或多种。此外,所有的方法步骤可以在体外进行。
[0018]在另一个广义的方面，本文提供一种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或是否具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法，包括:
[0019](I)逆转录来自获自受试者的测试样品的RNA以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸；
[0020](2)使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸；和
[0021](3)比较测试样品的杂交谱与对照样品产生的杂交谱，其中至少一个miRNA信号的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病，处于发展结肠癌相关疾病的风险中，或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后。
[0022]在一个具体的方面，相对于对照样品产生的信号，至少一个miRNA信号是被上调或下调的。此外，所述微阵列可包括一个或多个miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸，所述miRNA 选自由 miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0023]在另一个广义的方面，本文提供一种抑制受试者中肿瘤形成的方法，所述受试者患有或怀疑患有结肠癌相关疾病，其中相对于对照细胞，在受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物是被上调或下调的，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，包括:
[0024](I)当癌细胞中至少一种miR基因产物被下调时，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成；或
[0025](2)当癌细胞中至少一种miR基因产物被上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制所述至少一种miR基因产物表达的化合物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成。
[0026]在一个具体的方面，在步骤(1)和/或步骤(2)中至少一个分离的miR基因产物是miR-21、或其分离的变体、或其生物活性片段或功能等价物，或与其结合的抗体。
[0027]在另一个广义的方面，本文提供一种抑制患有结肠癌的受试者中肿瘤形成的方法，包括:[0028](1)相对于对照细胞，测定受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物的量；和[0029](2)改变在癌细胞中表达的miR基因产物的量，通过:[0030](i)给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，如果在癌细胞中表达的所述miR基因产物的量少于对照细胞中表达的miR基因产物的量，所述miR基因产物选自由 miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组；或[0031](ii)给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因产物的化合物，如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量；[0032]从而抑制受试者中肿瘤形成。[0033]在一个具体的方面，步骤(i)中的至少一种分离的miR基因产物是miR-21或其分离的变体或生物活性片段。此外，在某些实施方案中，在步骤(ii)中的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，或其分离的变体或生物活性片段。[0034]在另一个广义的方面，本文提供一种肿瘤形成抑制剂的鉴定方法，包括:给细胞提供一种测试试剂，并测量与结肠癌相关疾病中变化的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中miR基因产物水平的升高或降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。[0035]在另一个广义的方面，本文提供一种肿瘤形成抑制剂的鉴定方法，包括:给细胞提供一种测试试剂，并测量与结肠癌相关疾病中改变的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中miR基因产物水平的降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。[0036]在另一个广义的方面，本文提供一种用于评估一种或多种代谢途径的标记物，所述代谢途径对至少一种结肠癌相关疾病的引发、进展、严重性、病理、恶性(aggressiveness)、分期、活性、残疾、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在致病或病理特征的至少一种有贡献，其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由 miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其组合组成的组。[0037]在另一个广义的方面，本文提供包含一个或多个本文所述标记物的组合物。[0038]在另一个广义的方面，本文提供鉴定引发或发展受试者中至少一种结肠癌相关疾病的潜力的方法，所述方法提供对一种或多种本文所述标记物的测量。在某些实施方案，在分离的样品中存在一种或多种标记物，且所有的方法步骤在体外进行。[0039]在另一个广义的方面，本文提供测试结肠癌相关疾病的试剂，其中所述试剂包含多核苷酸，所述多核苷酸包括至少一种本文所述标记物的核苷酸序列或与所述标记物的核苷酸序列互补的核苷酸序列。[0040]在另一个广义的方面，本文提供测试结肠癌相关疾病的试剂，其中所述试剂包含抗体，所述抗体识别由至少一种本文所述的标记物编码的蛋白。[0041]在另一个广义的方面，本文提供测试结肠癌相关疾病的DNA芯片，探针固定在所述芯片上以测试至少一种本文所述的标记物。[0042]在另一个广义的方面，本文提供一种评估疗法预防、诊断和/或治疗至少一种结肠癌相关疾病的效力的方法，包括:[0043]1)给动物施用一种疗法，评估所述疗法的效力，和[0044]2)通过评价至少一个本文所述的标记物测定在治疗或预防结肠癌相关疾病中待测试的治疗的效力水平。
[0045]在某些实施方案中，候选治疗剂包括药物组合物、保健组合物和顺势疗法组合物的一种或多种。此外，待评估的疗法可用于人受试者。在某些实施方案中，所述方法不是通过手术或疗法来治疗人体或动物体的方法。
[0046]在另一广义的方面，本文提供一种评估至少一种材料引发动物模型中结肠癌相关疾病应答的能力的方法，所述方法包括:
[0047]I)在使动物与足以引发动物中结肠癌相关疾病应答的量的一种或多种材料接触后，测量一种或多种本文所述的被上调或下调的标记物；和
[0048]2)测定上调或下调标记物的至少一种是否具有引发结肠癌相关疾病应答的能力。
[0049]在另一广义的方面，本文提供一种治疗结肠癌相关疾病的药物组合物，包括:至少一种 miR 基因产物，所述 miR 基因产物选自由 miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；和药学可接受的载体。
[0050]在另一广义的方面，本文提供治疗结肠癌的药物组合物，其包括至少一种miR表达抑制化合物和药学可接受的载体，其中所述的至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组。
[0051]在另一广义的方面，本文提供一种产品，包括:至少一种与结肠癌相关疾的标记物结合的捕获试剂，所述标记物选自本文所述标记物的至少一种。
[0052]在另一广义的方面，本文提供筛选用于治疗结肠癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒`包括:至少一种本文所述的标记物的一种或多种试剂，和表达至少一种标记物的细胞。在某些实施方案中，使用包含抗体或抗体片段的试剂检测所述标记物的存在，所述抗体或抗体片段与至少一种标记物特异性结合。同样，在某些实施方案中，所述试剂是标记的、放射标记的、或生物素标记的，和/或所述抗体或抗体片段是放射标记的、生色团标记的、荧光团标记的或酶标记的。在一个具体的实施方案中，所述试剂盒进一步包括包含至少一种标记物的容器。同样，所述试剂可包括下述的一种或多种:抗体、附带或可附带的探针、和固定的金属螯合物。
[0053]在另一广义的方面，本文提供结肠癌相关疾病的筛选测试，包括:
[0054]使一种或多种权利要求20的标记物与所述标记物的底物和与测试试剂接触，和
[0055]测定所述测试试剂是否调节所述标记物的活性。
[0056]在某些实施方案中，所有的方法步骤可以在体外进行。
[0057]在另一广义的方面，本文提供预测受试者中结肠癌相关疾病存在的微阵列，包含针对至少一种权利要求20的标记物的抗体。
[0058]在另一广义的方面，本文提供方法、组合物等，其中通过检测转录多核苷酸或其部分的存在来评估标记物的表达水平，其中所述转录的多核苷酸包括所述标记物的编码区。同时，所述样品可以是结肠癌相关体液或组织。在一个具体的实施方案中，所述样品包括来自患者的细胞。
[0059]在另一广义的方面，本文提供治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括:[0060]给个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂，以足以干扰所述信号传导的量，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0061]在另一广义的方面，本文提供干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0062]在另一广义的方面，本文提供治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括给所述个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b，miR-203 及其组合组成的组。
[0063]在另一广义的方面，本文提供干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0064]在另一广义的方面，本文提供包括一种包含数据库的计算机可读介质，所述数据库具有多种数据编码的参考谱，其中至少第一参考谱代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第一标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记(indicia),
[0065]其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0066]在某些实施方案中， 所述计算机可读介质包含至少第二参考谱，其代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第二标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记，或受试者患有结肠癌相关疾病。
[0067]在另一广义的方面，本文提供一种测定患者是否患有，或倾向于患有结肠癌相关疾病，或具有差的结肠癌相关疾病存活预后的计算机系统，包括本文所述的数据库，和包括计算机可执行代码的服务器，其使计算机接收受试者的谱，从数据库识别匹配的在诊断上与受试者的谱相关的参考谱，并产生所述受试者是否患有或倾向于患结肠癌相关疾病的指
/Jn o
[0068]在另一广义的方面，本文提供一种评价受试者中结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度的计算机辅助方法，包括:
[0069]I)提供包括对来自获自受试者的样品的数据进行分类的模型或运算法则，其中，所述分类包括就至少一种标记物的存在、不存在或量分析所述数据，其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0070]2)输入获自受试者的生物样品的数据；和
[0071]3)分类生物样品以指示结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度。
[0072]在另一广义的方面，至少一种miR基因产物及其组合包括分离的变体、或其生物活性片段或功能等价物、或与其结合的抗体。[0073]在另一广义的方面，本文提供结肠癌的动物模型，其中下述生物或化学过程的至少一个(上调或下调一种或多种miR基因产物)在所述动物模型中发生，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组。在某些实施方案中，所述动物模型是非人脊椎动物。在具体的实施方案中，所述动物模型是小鼠、大鼠、兔或灵长类动物。
[0074]在附图的启发下阅读时，从下述优选实施方案的详细描述中，本发明的各种目的和优点对本领域技术人员来说是明显的。
【专利附图】

【附图说明】[0075]专利或申请文件包括至少一副以彩色绘制的附图。在提出要求和支付必须的费用后办事处(Office)可以提供带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本。
[0076]图la-lg:miR_21在结肠腺癌中以较高水平表达，在更晚期肿瘤中表达逐步增加。
[0077](图1a)对miR-21的原位杂交进行最优化以区分miR-21的高表达和低表达。人肿瘤(T)中的结肠上皮细胞与临近的非肿瘤组织(N)相比表达较高水平的miR-21。(图1c)在高的放大倍率下，肿瘤组织中结肠上皮细胞的细胞核和细胞质在肿瘤组织中表达显著量的miR-21。(图le)非肿瘤组织在相同的放大倍率下不显示miR-21的显著表达。
[0078](图lb，图ld，图1f)如所预料的，在低或高的放大倍率下，在肿瘤组织和非肿瘤组织的连续切片中争夺对照探针(the scramble control probe)没有显示显著染色。标尺线(scale bars)(图lc_f)显示在晚期肿瘤中500 y M (g) miR-21以较高水平表达。点图表示腺瘤和肿瘤表达水平的miR-21相对Ct值(来自定量RT-PCR)，其已分别针对配对非腺瘤或非肿瘤组织进行标准化。组织类型从腺瘤到1-1V期的肿瘤进行排序。线条显示中间值。存在越晚期的肿瘤具有越高的miR-21表达的明显趋势(在排列的组中趋势的非参数测试)。
[0079]图2:miR-21在较晚期的肿瘤中以较高水平表达。使用微小RNA微阵列来测量miR-21的表达水平。点图代表miR-211g2 (肿瘤/非肿瘤比例)，如根据来自原来的群(cohort)的微小RNA微阵列所计算的。使用来自微阵列的探针hsa_miR-21-precl7Nol来测量miR-21表达。排除基于微阵列数据具有不可测的miR-21表达的组织。组织类型从?M的I期至IV期肿瘤进行排列。线条表示中间值。存在越晚期的肿瘤具有越高的miR-21表达的明显趋势(p=0.04 ;在排列的组中趋势的非参数测试)。
[0080]图3a和3b:肿瘤中高的miR-21表达预测在两个独立群中具有典型腺癌组织结构的患者中差的存活。所述分析排除具有粘液腺癌或腺鳞状癌组织结构的受试者。
[0081](图3a)在马里兰测试群中使用微小RNA微阵列来测量肿瘤和非肿瘤组织的微小RNA表达水平。排除基于微阵列数据具有不可测的miR-21表达的组织。基于最高三分位组(tertile)对高的miR-21表达进行分类。红线表示具有高表达的个体，而绿线对应低表达。对于非肿瘤组织，24/69组织被分类为高的，而26/72肿瘤被分类为高的。肿瘤中高的miR-21表达(右)与差的存活相关，而其在非肿瘤组织中没有关联。
[0082](图3b)验证独立群中肿瘤高的miR-21表达与差的预后的相关性。通过定量RT-PCR测量miR-21的表达水平。高的表达基于最高三分位组。35/103非肿瘤组织被分类为高的，且34/103肿瘤组织被分类为高的。P-值为根据Kaplan-Meier分析的log秩P-值。在所有线上的X’S表示检查个体的时间。
[0083]图4a和4b:肿瘤中高miR_21表达预测两个独立群中的差的存活。所述分析包括所有受试者，不考虑腺癌组织结构。
[0084](图4a)在马里兰测试群中使用微小RNA微阵列来测量肿瘤和非肿瘤组织的微小RNA表达水平。排除基于微阵列数据检测不到miR-21表达的组织。基于最高三分位组对高miR21表达进行分类。红线表示具有高表达的个体，而绿线对应低表达。对于非肿瘤组织，26/74组织被分类为高的，而28/79肿瘤被分离为高的。肿瘤中高的miR-21表达(右)与差的存活相关，而其在非肿瘤组织中没有关联。
[0085](图4b)对独立群中肿瘤中高的miR-21表达与差的预后的相关性进行验证。通过定量RT-PCR测量miR-21的表达水平。高表达基于最高三分位组。37/111非肿瘤组织被分类为高的，且37/111肿瘤组织被分类为高的。所有P-值为根据Kaplan-Meier分析的log秩P-值。在所有线上的X’s表示检查个体的时间。
[0086]图5a、5b和5c:在常规腺癌组织结构情况下，高的miR-21表达与对辅助化疗低的应答有关。所述分析包括来自验证群的受试者，排除具有粘液腺癌组织结构或腺鳞状癌组织结构的受试者。
[0087](图5a)通过miR-21表达水平比较具有常规腺癌组织结构的期受试者和接受辅助化疗的受试者的存活率。对于77个II/III期的受试者，25个被分类为低的miR-21并接受治疗，28个为低miR-21且不接受治疗，11个为高的miR-21并接受治疗，和13个为高的miR-21且不接受治疗。对于接受辅助化疗的II/III期受试者，肿瘤中高的miR-21表达与差的存活相关(p=0.03)。
[0088](图5b)比较具有常规腺癌组织结构的ITMII期受试者。对于33个II期受试者，8个被分类为低的miR-21并接受治疗，15个为低miR-21且不接受治疗，3为高miR-21的接受治疗，和7个为高miR-21的且不接受治疗。对于所有接受辅助化疗的II期的受试者，在研究期间存活。
[0089](图5c)比较具有常规腺癌组织结构的TWIII期受试者。对于44个III期受试者，17个被分类为低的miR-21并接受治疗，13个为低的miR-21且不接受治疗，8为高的miR-21并接受治疗，和6个为高的miR-21且不接受治疗。对于接受辅助化疗的III期受试者，肿瘤中高的miR-21表达与差的存活相关(p=0.02)。在所有线上的X’s表示检查个体的时间。
[0090]图6a、6b和6c:马里兰测试群和香港验证群的联合分析，检测肿瘤和接受辅助化疗之间miR-21的表达与预后的相关性。所述分析包括来自两个群的所有ITM的II/III期受试者。排除具有粘液腺癌组织结构或腺鳞状癌组织结构的个体。左边的柱包括分析接受辅助疗法与预后之间的相关性的Kaplan-Meier图。中间的柱包括对肿瘤中高的miR-21表达与预后相关性的分析，且右边的柱基于化疗和miR-21表达情况对个体进行细分。
[0091](图6a)所有ITM的II/III期受试者。对于119个II/III期的受试者，40个被分类为低的miR-21并接受治疗，41个为低的miR-21但不接受治疗，16为高的miR-21并接受治疗，和22个为高的miR-21但不接受治疗。高的miR-21表达与接受化疗的那些(p=0.003)和不接受化疗的那些(P=0.04)的差的存活相关。
[0092](图6b)所有ITM的II期受试者。对于52个II/III期受试者，10个被分类为低的miR-21并接受治疗，25个为低miR-21但不接受治疗，4为高的miR-21并接受治疗，和13个为高的miR-21但不接受治疗。高的miR-21表达与预后之间的相关性在接受化疗的个体(p=0.11)或不接受化疗的个体(p=0.06)中不是统计学显著的。
[0093](图6c)所有ITM的III期受试者。对于67个III期的受试者，30个被分类为低的miR-21并接受治疗，16个为低miR-21但不接受治疗，12为高的miR-21并接受治疗，和9个为高的miR-21但不接受治疗。高的miR-21表达与在接受化疗的III期受试者中差的存活显著相关(P=0.007)，但在不接受化疗的受试者中不显著相关(p=0.30)。在所有线上的X’s表示检查个体的时间。
[0094]图7a_7c.总的miRNA谱与临床ITM分期和存活预后相关。miRNATIN比例的分级聚类导致形成两个组，任意称为A组和B组。图7a显示所得的HEAT图和聚类分配。这两个组由对ITM分期具有显著不同存活预后的个体组成，其中与A组个体相比，B组个体更有可能被诊断为III或IV期(图7b)。Kaplan-Meier分析显示B组的存活预后更差(图7c)。
[0095]图8a-81.个体miRNA的TIN比例预测存活预后。此处展示的图通过对9个miRNA的每一个进行TW分期(左)和Kaplan-Meier分析(右)显示TIN比例。Y轴(TW分期图显示的TIN比例)显示每一个个体的经log (2)转化的TIN比例，而?!分期(1、I1、III或IV)显示Y轴组个体。显示的权值为通过分期进行分组的个体的平均TIN比值的趋势的非参数测试的结果。Kaplan-Meier图包括对于那个具体的miRNA具有TIN比例数据的所有个体。发现TIN比例与临床分期和存活预后均有关。
[0096]图9a和9b.9个miRNA的miRNA信号预测死于结肠癌的风险。各个miR-21、miR-106a、miR181b、miR_16b、miR-203、let_7g、miR_29a、miR-103-2 和 miR-10a 的 TIN 比例显示对结肠癌预后的预测。这9个miRNA的TIN比例的分级聚类将个体分成具有显著不同存活预后两组(IA) (IB)0 B组个体死于结肠癌的风险比A组高得多。如果个体缺少大于组成miRNA信号的9个TIN比例中的2个，从所述分析中排除它们。
[0097]优选实施方案的详述`
[0098]在一个广义的方面，本文提供对具体微小RNA的鉴定，相对于正常对照细胞，所述微小RNA的表达在与不同结肠癌相关的癌细胞中改变。
[0099]如在本文可互换使用的，“miR基因产物”、“微小RNA”、“miR”或“miRNA”指来自miR基因的未加工(例如，前体)或经加工的(例如，成熟)的RNA转录物。因为所述miR基因产物没有被翻译成蛋白，术语“miR基因产物”不包括蛋白。未加工的miR基因转录物还称为“miR前体”或“miR prec”并典型地包括长度约为70-100个核苷酸的RNA转录物。可以通过用RNAse (例如，Dicer、Argonaut或RNAse III (例如，大肠杆菌RNAse III))消化，将所述miR前体进行加工成具有19-25个核苷酸的活性RNA分子。所述具有19-25个核苷酸的活性RNA分子还称为“经加工的” miR基因转录或“成熟”miRNA。
[0100]所述具有19-25个核苷酸的活性RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，诸如分离的Dicer、Argonaut或RNAse III)获自miR前体。应理解所述具有19-25个核苷酸的活性RNA分子还可以通过生物或化学合成直接产生，无需从miR前体进行加工。当在本文中以名字提及微小RNA时，所述名字对应于前体和成熟形式，除非另外指出。
[0101]在一个方面，本文提供诊断受试者是否患有结肠或处于发展结肠癌风险中的方法，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，并比较测试样品中所述miR基因产物的水平与对照样品中对应miR基因产物的水平。如本文所使用的，“受试者”可以是任何患有或怀疑患有实体癌的哺乳动物。在一个优选的实施方式中，所述受试者是患有或怀疑患有结肠癌的人。
[0102]在一个实施方案中，在所述测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。在一个具体的实施方案中，所述miR基因产物是miR-21。
[0103]所述结肠癌相关疾病可以是任何由结肠组织引起的障碍或癌症。所述癌症典型地与肿瘤块的形成和/或存在相关，例如腺癌。
[0104]在一个实施方案中，所述结肠是腺癌和在所述测试样品中测量的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组。
[0105]在另一个实施方案中，在测试样品中测量的至少一种miR基因产物是miR-21。
[0106]可以测量获自受试者的生物样品(例如，细胞、组织)中至少一种miR基因产物的水平。例如，可以通过常规的活检技术从怀疑患有结肠癌相关疾病的受试者提取组织样品(例如，来自肿瘤)。在另一个实施方式中，可以从受试者提取血液样品，并通过标准技术对血细胞(例如，白血细胞)进行分离以获得DNA提取物。所述血液或组织样品优选获自开始放射治疗、化学疗法或其他治疗性治疗之前的受试者。对应的对照组织样品或血液样品可获自所述受试者未受影响的组织、正常人个体或正常个体群、或对应于所述受试者样品中大多数细胞的培养细胞。然后将对 照组织样品或血液样品与来自受试者的样品一起处理，从而比较由来自受试者样品的细胞中给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的对应miR基因产物水平。所述生物样品的参考miR表达标准也可用作对照。
[0107]相对于对照样品中对应miR基因产物的水平，获自受试者的样品中miR基因产物水平的改变(例如，增加或降低)指示受试者中存在结肠癌相关疾病。
[0108]在一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中对应miR基因产物的水平(即，所述miR基因产物的表达被“上调”)。如本文所使用的，当来自受试者的细胞或组织中的基因产生的miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，miR基因产物的表达被“上调”。
[0109]在另一个实施方案中，测试样品中至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中对应miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被“下调”)。如本文所使用的，当来自受试者的细胞或组织中miR基因产物的量小于对照细胞或组织样品中相同基因产生的量时，miR基因产物的表达被“下调”。
[0110]对照和正常样品中相对的miR基因表达可以相对于一种或多种RNA表达标准进行测定。所述标准例如可以包括零miR基因表达水平、在标准细胞系中所述miR基因的表达水平，受试者未受影响的组织中所述miR基因的表达水平、或之前获自正常人对照群的miR基因表达的平均水平。
[0111]可以使用任何适合检测生物样品中RNA表达水平的技术测定样品中miR基因产物的水平。测定生物样品(例如，细胞、组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)为本领域所述技术人员所熟知的。在一个具体的实施方案中，使用Northern印迹分析测定至少一种miR基因产物的水平。例如,可以在核酸提取缓冲溶液存在下通过匀浆化作用，然后通过离心从细胞分离出总的细胞RNA。沉淀核酸，通过用DNase处理和沉淀除去DNA。然后根据标准技术通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离所述RNA分子，并转移到硝化纤维素滤膜。然后通过加热将所述RNA固定在滤膜上。使用与可疑RNA互补的合适标记的DNA或RNA探针来完成特异性RNA的检测和定量。例如参见，MolecularCloning:A Laboratory Manual, J.Sambrook 等，eds., 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989, Chapter7,其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0112]可以由所述核酸序列产生用于给定miR基因产物Northern印迹杂交的合适探针，其包括但不限于与目的miR基因产物至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或完全互补的探针。标记的DNA和RNA探针的制备方法，以及其与靶核苷酸序列的杂交条件描述于 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, J.Sambrook 等编辑，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989,第10和11章,其公开内容以引用方式并入本文。
[0113]在一个非限制性的实施例中，所述核酸探针例如可以用放射性核素(诸如3H、32P、33P、14C或35S);重金属；能用作经标记配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素、亲和素或抗体)；荧光分子；化学发光分子；酶等进行标记。
[0114]通过Rigby 等(1977)，J.Mol.Biol.113 =237-251 的缺口翻译方法，或通过Fienberg等(1983), Anal.Biochem.132:6-13的随机引物法,探针可以被标记为具有高的特异性活性，其全部公开的内容以引用方式并入本文。后者是从单链DNA或从RNA模板选择合成高特异性活性的32P-标记探针的选择方法。例如，根据缺口翻译方法通过用高放射性的核苷酸替代先前存在的核苷酸，有可能制备超过108cpm/mg的32P标记具有特异性活性的核酸探针。然后通过将杂交的滤膜曝光于胶片来进行杂交的放射自显影检测。由杂交滤膜曝光的胶片的光密度扫描提供miR基因转录水平的准确测量。使用另一种方法，miR基因转录水平可以通过计算机 成像系统(诸如购自Amersham Biosciences, Piscataway, NJ的Molecular Dynamics400-B2DPhosphorimager)进行定量。
[0115]在DNA或RNA探针的放射性核标记是不可行的情况下，可以使用随机引物方法将类似物，例如，dTTP类似物5- (N- (N-生物素酰-e -氨基己酰基)_3_氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸整合到探针分子中。所述生物素探针寡核苷酸可以通过与生物素-结合蛋白反应来检测，诸如亲和素、链霉亲和素与荧光染料或产生颜色反应的酶偶合的抗体(例如，抗生物素抗体)。
[0116]除了 Northern和其他RNA杂交技术外，可以使用原位杂交技术来完成RNA转录水平的测定。所述技术与Northern印迹技术相比需要更少的细胞,且包括将全细胞沉积到显微镜盖玻片上，并用含放射性或经其他方式标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测所述细胞的核酸含量。所述技术特别适合对来自受试者的组织活检样品进行分析。原位杂交技术的实践更详细描述于美国专利N0.5，427，916，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0117]在一个非限制性的实施例中，可以由所述核酸序列产生给定miR基因产物原位杂交的合适探针，其包括但不限于与目的miR基因产物至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或完全互补的探针,如上述所。
[0118]细胞中miR基因转录物的相对数量还可以通过miR基因转录物的逆转录,接下来通过聚合酶链式反应的逆转录(RT-PCR)转录物的扩增来确定。与内标(例如，来自存在于同一样品的“管家”基因的mRNA水平)进行比较来对miR基因转录物的水平进行定量。用作内标的合适“管家”基因例如包括，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。进行定量和半定量RT-PCR的方法，及其变化形式是本领域所属的技术人员所熟知的。
[0119]在一些情况下，可能需要同时测定样品中多种不同miR基因产物的表达水平。在其他情况下，可能需要测定与癌症相关的所有已知miR基因转录物的表达水平。评估数百个miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平是耗时的，且需要大量的总RNA (例如，对于每个Northern印迹至少20 u g)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
[0120]为了克服这些限制，可以构建微芯片形式的寡核苷酸文库(即，微阵列)，其含有一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针，所述探针对一组miR基因具有特异性。使用所述微阵列，通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸并对它们进行杂交来探测微阵列上的寡核苷酸以产生杂交谱或表达谱，可以测定生物样品中多个微小RNA的表达水平。然后比较测试样品和对照样品的杂交谱以测定实体癌细胞中哪个微小RNA具有改变的表达水平。
[0121]如本文所使用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”指能与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”指待检测(例如，经由杂交)的分子。“miR-特异性探针寡核苷酸”或“对miR特异性的探针寡核苷酸”指一种探针寡核苷酸，其具有经选择与特异性miR基因产物或与所述特异性miR基因产物的逆转录物杂交的序列。
[0122]具体样品的“表达谱”或“杂交谱”本质上为样品状态的指纹谱；而两个状态可能使任何具体基因被类似地表达，对许多基因同时进行评价允许产生独特于细胞状态的基因表达谱。即，正常组织可能与癌(例如，肿瘤)组织不同，且可以测定癌组织中不同的预后状态(例如，好的或差的长期存活前景)。通过比较不同状态中结肠癌组织的表达谱，获得关于在这些状态的每一个中哪些基因是重要的(包括基因的上调和下调)的信息。在结肠癌组织中差异表达的序列的鉴定，以及导致不同预后结果的差异表达，允许以多种方式使用所述信息。·
[0123]在一个非限制性的实施例中，可以评价具体的治疗方案(例如，确定化疗药物是否起到改善具体患者中长期预后的作用)。类似地，可以进行诊断或通过比较患者样品与已知表达谱来证实。此外，这些基因表达谱(或个别基因)允许筛选抑制结肠癌表达谱或将差的预后谱转变成较好的预后谱的候选药物。
[0124]因此，本文还提供诊断受试者是否患有结肠癌或处于发展出结肠癌风险中的方法，其包括:对来自获自受试者的测试样品的RNA进行逆转录以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸，使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸，和比较测试样品的杂交谱与对照样品或参考标准产生的杂交谱，其中至少一种miRNA信号的改变指示所述受试者患有实体癌，处于发展实体癌的风险中。
[0125]在一个实施方案中，所述微阵列包括大部分的所有已知人miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸。在一个具体的实施方案中，所述微阵列包括针对一种或多种miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸，所述miRNA选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
[0126]所述微阵列可以由产生自已知miRNA序列的基因特异性寡核苷酸探针制备。所述阵列针对每种miRNA可以包含两种不同的寡核苷酸探针，一种包含活性、成熟的序列和另一种对所述miRNA前体具有特异性。所述阵列还可以包含对照、诸如与人直系同源物的区别仅在于几个碱基的一种或多种小鼠序列，其可用作严格杂交条件的对照。还可以在微芯片上印刷来自这两个物种的tRNA或其他RNA (例如rRNAS、mRNAS)，以提供特异性杂交的内在的、相对稳定的阳性对照。还可以在所述微芯片上包括非特异性杂交的一种或多种合适对照。出于这个目的，基于不存在任何已知miRNA的任何同源来选择序列。
[0127]可以使用本领域已知的技术来制备微阵列。例如，合适长度的探针寡核苷酸(例如，40个核苷酸)，在C6位置为5’-胺修饰的并用商购可得的微阵列系统(例如，GeneMachine 0mniGrid?100microarrayer 和 Amersham CodeLink? activated slides)进行印刷。通过用经标记的引物逆转录靶RNA来制备对应于靶RNA的经标记的cDNA低聚物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交体变性以降解RNA模板。然后，将由此制备的标记靶cDNA在杂交条件下(例如，在25°C下6X SSPE/30%甲酰胺持续18小时，然后在37°C下在0.75XTNT (Tris HCl/NaCl/Tween20)中洗涤40分钟)与微阵列芯片杂交。在阵列上固定的探针DNA识别样品中互补的靶cDNA的位置上发生杂交。经标记的靶cDNA标记所述阵列上结合发生的准确位置，允许自动检测和定量。输出信号由一系列杂交事件组成，指示患者样品中特异性cDNA序列的相对丰度，从而对应的互补miR的相对丰度。 [0128]根据一个实施方案，所述经标记的cDNA低聚物是由生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用，例如，链亲和素-Alexa647缀合物，直接检测含生物素的转录物，对所述微阵列进行操作，并利用常规扫描方法进行扫描。阵列上每一个点的图像强度与患者样品中对应miR的丰度成正比。
[0129]微阵列的使用对于miRNA表达检测来说具有几个优点。第一，可以同时鉴定同一样品中几百个基因的总表达。第二，通过仔细设计寡核苷酸探针可以鉴定成熟和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比,所述芯片需要少量的RNA,并通过使用2.5 y g总RNA提供可重复的结果。相对有限数量的miRNA (几百个/物种)允许构建几个物种的共同微阵列，针对每个物种具有不同的寡核苷酸探针。所述工具允许在不同条件下分析每个已知miR的跨物种(trans-species)表达。
[0130]除了用于特异性MR的定量表达水平测试外，含有对应于大部分miRNome (优选全部miRNome)的miRNA特异性探针寡核苷酸的微芯片,可用来实现miR基因表达分析，以分析miR表达模式。不同的miR信号可以与已确定的疾病标记物，或直接与疾病状态相关。
[0131]根据本文所述的表达分析方法，来自怀疑患有结肠癌相关疾病的受试者的样品的总RNA被定量逆转录以提供一组与样品中所述RNA互补的经标记的靶寡脱氧核苷酸。然后，所述靶寡脱氧核苷酸与包括miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供样品的杂交谱。所述结果是代表样品中miRNA表达模式的样品杂交谱。所述杂交谱包括来自样品的所述靶寡脱氧核苷酸与微阵列中所述miRNA特异性探针寡核苷酸结合的信号。所述谱可被记录为存在或不存在结合(信号相对零信号)。
[0132]更优选地，所记录的谱包括每个杂交信号的强度。比较所述谱与正常(即，非癌)对照样品产生的杂交谱。信号的改变指示受试者中存在或倾向于发展癌症。
[0133]测量miR基因表达的其他技术也在本领域的技术范围内，包括测量RNA转录和降解速率的各种技术。
[0134]本文还提供确定患有结肠癌的受试者预后的方法，包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其与结肠癌相关疾病中的具体预后(例如，好的或良性预后，差的或不良预后)相关。
[0135]根据这些方法，与对照样品中对应miR基因产物水平相比，与测试样品中具体预后相关的miR基因产物水平的改变指示所述受试者患有具有具体预后的实体癌。在一个实施方案中，所述miR基因产物与不良(即，差的)预后相关。不良预后的实例包括，但不限于低存活率和快速疾病进展。在某些实施方案中，通过对来自获自受试者的测试样品的RNA进行逆转录以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸，使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供所述测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸，并比较测试样品的杂交谱与对照样品产生的杂交谱来测量所述至少一种miR基因产物的水平。
[0136]不希望受任何理论限制，认为细胞中一种或多种miR基因产物水平的改变能导致这些miR的一个或多个目标靶的失调，其能导致实体癌的形成。因此，改变所述miR基因产物的水平(例如，通过降低在实体癌细胞中被上调的miR基因产物的水平，或增加在实体癌细胞中被下调的miR基因产物的水平)可以成功地治疗所述实体癌。
[0137]因此，本文进一步提供抑制患有或怀疑患有实体癌的受试者中肿瘤形成的方法，其中在所述受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物失调(例如，下调、上调)。如果在所述癌细胞中所述至少一种分离的miR基因产物(例如，miR-21)是被下调的，所述方法包括施用有效量的所述至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，从而抑制所述受试者中癌细胞增殖。
[0138]例如,如果miR基因产物在受试者的癌细胞中是被下调的,给所述受试者施用有效量的分离的miR基因产物可以抑制所述癌细胞增殖。给所述受试者施用的分离的miR基因产物与在癌细胞中被下调的内源性野生型miR基因产物(例如，miR基因产物)一致，或可以是其变体或生物活性片段。
[0139]如本文所定义的，miR基因产物的“变体”指与对应的野生型miR基因产物具有低于100%同一性的miRNA并具有对 应野生型miR基因产物的一种或多种生物活性。所述生物活性的实例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表达(例如，抑制靶RNA分子的翻译、调节靶RNA分子的稳定性、抑制靶RNA分子的加工)和抑制与实体癌相关的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)。这些变体包括物种变体和由miR基因中一个或多个突变(例如，置换、删除、插入)导致的变体。在某些实施方案中，所述变体与对应野生型miR基因产物至少具有约 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、或 99% 的同一性。
[0140]如本文所定义的，miR基因产物的“生物活性片段”指miR基因产物的RNA片段，其具有对应野生型miR基因产物的一种或多种生物活性。如上所述,所述生物活性的实例包括，但不限于，抑制靶RNA分子的表达和抑制与结肠癌相关的细胞过程。在某些实施方案中，所述生物活性片段的长度至少为约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在一个具体的实施方案中，分离的miR基因产物可以与一种或多种其他抗癌治疗联合施用于受试者。合适的抗癌治疗包括，但不限于，化学疗法、放射疗法及其组合(例如,化放疗(chemoradiation))。
[0141]如果所述至少一种分离的miR基因产物在所述癌细胞中是被上调的，所述方法包括给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物表达的化合物，本文称为miR基因表达抑制化合物，从而抑制实体癌细胞增殖。在一个具体的实施方案中，所述至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0142]miR基因表达抑制性化合物可以与一种或多种其他抗癌治疗联合施用于受试者。合适的抗癌治疗包括，但不限于，化学疗法、放射疗法及其组合(例如，化放疗)。
[0143]术语“治疗(treat) “治疗(treating) ”和“治疗(treatment) ”,如本文所使用的，指缓解与疾病或病症(例如，实体癌)相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减轻疾病或病症症状的严重性或频率。本文定义术语“受试者(subject)”^患者(patient)”和“个体(individual)”包括动物,诸如哺乳动物,包括,但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿动物或鼠科类。在一个优选的实施方式中，所述动物是人。
[0144]如本文所使用的，分离的miR基因产物的“有效量”是指足以抑制遭受实体癌的受试者中癌细胞增殖的量。通过考虑因素，诸如受试者的尺寸和体重、疾病入侵的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径以及给药是局部的或全身的，本领域的技术人员能容易地确定给给定受试者施用的miR基因产物的有效量。
[0145]例如，分离的miR基因产物的有效量可以基于待治疗的瘤块的近似重量。瘤块的近似重量可以通过计算所述瘤块的近似体积确定，其中一立方厘米体积大约相当于lg。基于瘤块重量，分离的miR基因产物的有效量可以在约10-500 ii g/g瘤块的范围内。在某些实施方案中，所述瘤块至少可以是约IOii g/g瘤块、至少大约60ii g/g瘤块或至少大约IOOii g/g 瘤块。
[0146]分离的miR基因产物的有效量还可以基于待治疗的受试者的近似或估算体重。优选地，如本文所述，所述有效量可以肠胃外或肠内给药。例如，给受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可以在约5-3000ii g/kg体重、约700-1000 y g/kg体重、或大于约1000 u g/kg体重的范围内。
[0147]本领域的技术人员还可以容易地`确定给给定受试者施用分离的miR基因产物的合适给药方案。例如，可以一次给所述受试者施用miR基因产物{例如，以单一注射或沉积(deposition))。或者,可以给受试者施用miR基因产物一天一次或两次,持续约3_28天,更具体地约7-10天的周期。在一个具体的给药方案中，施用miR基因产物一天一次，持续7天。在给药方案包括多次施用的情况下，应理解给受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可以包括整个给药方案中施用的基因产物的总量。
[0148]如本文所使用的，“分离的”miR基因产物是指合成的、或从天然状态通过人干预改变或提取的基因产物。例如，认为合成的miR基因产物、或部分或完全分离自其天然状态的共存材料的miR基因产物是“分离的”。分离的miR基因产物可以以基本上纯的形式存在，或可以存在于所述miR基因产物被递送到的细胞中。因此，有意地被递送到细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据一个具体的实施方案，本文所描述的分离的miR基因产物可用于制备药物，所述药物用于治疗受试者(例如，人)的实体癌。
[0149]使用许多标准技术可以获得分离的miR基因产物。例如，使用本领域中已知的方法可以化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷酸亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成的RNA分子或合成试剂的商品供应商例如包括，Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette,CO, U.S.A.)、Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL, U.S.A.)、GlenResearch (Sterling, VA,U.S.A.)、ChemGenes (Ashland,MA,U.S.A.)和 Cruachem(Glasgow,UK)。
[0150]或者，可以使用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒表达所述miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适启动子例如包括，U6或Hl RNApol III启动子序列，或细胞巨化病毒启动子。其他合适启动子的选择是在本领域技术范围内的。本发明的重组质粒还可以包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调节型启动子。
[0151]可由重组质粒表达的miR基因产物可以通过标准技术从培养的细胞表达系统中分离出来。由重组质粒表达的miR基因产物还可以被递送至癌细胞中，并直接在癌细胞中表达。在下面将更详细讨论使用重组质粒将miR基因产物递送至癌细胞中。
[0152]所述miR基因产物可以由分开的重组质粒表达，或它们可以由相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，所述miR基因产物在单一质粒中被表达为RNA前体分子，并且所述前体分子被合适的加工系统加工成功能性miR基因产物，所述加工系统包括但不限于癌细胞中现存(extant)的加工系统。其他合适的加工系统例如包括，体外果蝇细胞裂解系统(例如，如在Tuschl等人的美国公开的专利申请N0.2002/0086356中所述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文)和大肠杆菌RNAse III系统(例如，如在Yang等人的美国公开的专利申请N0.2004/0014113中所述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文)。
[0153]适合表达miR基因产物的质粒的选择，将核酸序列插入到质粒中以表达所述基因产物的方法，和将重组质粒递送到目的细胞中的方法是在本领域技术范围内的。例如参见，Zeng 等(2002)，Molecular Cell9:1327-1333 ；Tuschl (2002), Nat.Biotechnol,20:446-448;Brummelkamp 等(2002)，Science296:550-553 ；Miyagishi 等(2002)，Nat.Biotechnol.20:497-500 ；Paddison 等(2002)，Genes Dev.16:948-958 ；Lee 等(2002)，Nat.Biotechnol.20:500-505 ;和 Paul 等(2002)，Nat.Biotechnol.20:505_508，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0154]在一个实施方案中，表达所述miR基因产物的质粒包含在CMV中间体早期启动子(CMV intermediate-early promoter)的控制下编码miR前体RNA的序列。如本文所使用的，启动子的“控制下”指编码所述miR基因产物的核酸序列被定位在启动子的3'，使得所述启动子能引发miR基因产物编码序列的转录。
[0155]还可以由重组病毒载体表达所述miR基因产物。预期所述miR基因产物可以由两个分开的重组病毒载体表达，或由相同的病毒载体表达。由重组病毒载体表达的RNA可以通过标准技术分离自培养的细胞表达系统，或可以在癌细胞中被直接表达。在下面将更详细讨论重组病毒载体将所述miR基因产物递送至癌细胞中的使用。
[0156]本发明的重组病毒载体包括编码所述miR基因产物的序列和任何用于表达所述RNA序列的合适启动子。合适的启动子包括,但不限于U6或Hl RNApol III启动子序列或细胞巨化病毒启动子。其他合适启动子的选择是在本领域技术范围内的。本发明的重组病毒载体还可以包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调节型启动子。
[0157]可以使用能接受所述miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，衍生自腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录酶病毒(例如，慢病毒(LV)、棒状病毒、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可以通过用来自其他病毒的衣壳蛋白或其他表面抗原假型包装载体，或通过置换不同的病毒壳体蛋白(如果合适的话)来改变所述病毒载体的向性(tropism)。
[0158]例如，本发明的慢病毒载体用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒(Ebola)、Mokola等的表面蛋白进行假型包装。通过改造载体以表达不同的衣壳蛋白血清型，可以使本发明的AAV载体靶向不同的细胞。例如，在血清2型基因组上表达血清2型衣壳的AAV载体被称为AAV2/2。在AAV2/2载体中这种血清2型衣壳基因能被血清5型衣壳基因替代以产生AAV2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术的范围内；例如参见，Rabinowitz, J.E.，等(2002)，J.Virol.76:791_801，其公开的全部内容以引用方式并入本文。[0159]适用于本发明的重组病毒载体的选择，将表达RNA的核酸序列插入到所述载体中的方法，将病毒载体递送至目的细胞的方法，和所表达的RNA产物的回收是在本领域技术范围内的。例如参见，Dornburg (1995), Gene Therapy2:301-310;Eglitis (1988),Biotechniques 6:608-614;Miller (1990), Hum.Gene Therapyl:5-14;and Anderson(1998)，Nature392:25_30，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0160]特别适合的病毒载体是衍生自AV和AAV的那些。表达所述miR基因产物的合适AV载体，构建所述重组AV载体的方法，和将所述载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等(2002)，Nat.Biotech.20:1006_1010，其公开的全部内容以引用方式并入本文。表达miR基因产物的合适AAV载体，构建所述重组AAV载体的方法，和将所述载体递送至靶细胞的方法描述于 Samulski 等(1987)，J.Virol.61:3096-3101;Fisher 等(1996)，J.Virol.,70:520-532 ；Samulski 等(1989)，J.Virol.63:3822-3826 ;美国专利 N0.5252479 ;美国专利N0.5，139,941 ;国际专利申请N0.W094/13788 ;和国际专利申请N0.W093/24641，其公开的全部内容以引用方式并入本文。在一个实施方案中，所述miR基因产物表达自包含CMV中间体早期启动子的单一重组AAV载体。
[0161]在某一实施方案，本发明重组AAV病毒载体包含在人U6RNA启动子的控制下，与PolyT终止序列可操作连接的、编码miR前体RNA的核酸序列。如本文所使用的，“与polyT终止序列可操作连接”指编码正义或反义链的核酸序列与5’方向的polyT终止信号直接相邻。在从载体转录miR序列期间，polyT终止信号起终止转录的作用。
[0162]在本发明治疗方法的其他实施方案中，可以给所述受试者施用有效量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文所使用的，“抑制miR表达”指治疗后miR基因产物的前体和/或活性、成熟形式的产生低于治疗前产生的量。例如使用上面关于诊断方法所讨论的测定miR转录水平的技术，本领域的技术人员能容易地确定癌细胞中miR的表达是否受到抑制。抑制在基因表达水平上(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或在加工水平上(例如，通过抑制将miR前体加工成成熟、活性的miR)发生。
[0163]如本文所使用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是指足以抑制遭受癌症(例如，结肠癌)的受试者中癌细胞增殖的量。通过考虑因素，诸如受试者的尺寸和体重、疾病入侵的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径以及给药是局部的或全身的，本领域的技术人员能容易地确定给给定受试者施用的miR表达抑制化合物的有效量。
[0164]例如，如本文所述，所述表达抑制化合物的有效量可以基于待治疗瘤块的近似重量。如本文所述，抑制miR表达的化合物的有效量还可以基于待治疗受试者的近似或估算体重。
[0165]本领域的技术人员还可以容易地确定给给定受试者施用抑制miR表达的化合物的合适给药方案。
[0166]抑制miR基因表达的合适化合物包括双链RNA (诸如短或小的干扰RNA或“siRNA”)，反义核酸和酶促RNA分子(诸如核酶)。这些化合物的每一个可以靶向给定miR基因产物并干扰靶miR基因产物的表达(例如，抑制靶miR基因产物翻译、诱导靶miR基因产物的切割或破坏)。
[0167]例如，通过用分离的双链RNA (“dsRNA”)分子诱导对miR基因的RNA干扰，可以抑制给定miR基因的表达，所述双链RNA分子与所述miR基因产物的至少一部分具有至少90 %，例如至少95 %、至少98 %、至少99 %或100 %的序列同一性。在一个具体的实施方案中，所述dsRNA分子是“短或小的干扰RNA”或“siRNA”。
[0168]本发明方法中有用的siRNA包括长度为约17个核苷酸至约29个核苷酸的短双链RNA,优选长度为约19至约25个核苷酸。所述siRNA包括一个正义RNA链和一个互补的反义RNA链，通过标准的Watson-Crick碱基配对相互作用(以下称为”碱基配对”)退火在一起。正义链包括与包含在所述靶miR基因产物内的核酸序列基本一致的核酸序列。
[0169]如本文所使用的，在siRNA中与包含在所述靶mRNA基因产物内的核酸序列“基本一致”的核酸序列是与所述靶序列一致或与所述靶序列区别在于一个或两个核苷酸的核酸序列。siRNA的正义链和反义链可包括两个互补的单链RNA分子，或可包括其中两个互补部分通过单链“发夹”区碱基配对和共价连接的单一分子。
[0170]所述siRNA还可以是改变的RNA，其通过添加、删除、置换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。所述改变可包括诸如将非核苷酸材料添加到所述siRNA的端上或所述siRNA的一个或多个内部核苷酸上，或使siRNA对核酸酶消化具有抗性的修饰，或用脱氧核糖核苷酸置换所 述siRNA中的一个或多个核苷酸。
[0171]所述siRNA的一条或两条链还可以包含一个3’突出端。如本文所使用的，“3’突出端”指延伸自双重RNA链的3’-端的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，所述siRNA包括至少一个长度为I至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，长度为I至约5个核苷酸,长度为I至约4个核苷酸,或长度为约2至约4个核苷酸的3’突出端。在一个具体的实施方案中，所述3’突出端存在于所述siRNA的两条链，且长度为2个核苷酸。例如，所述siRNA的每一条链可包括二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3关出立而。
[0172]如上面关于所述分离的miR基因产物的描述，所述siRNA可以化学或生物制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达。制备和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gewirtz的美国公开的专利申请N0.2002/0173478和Reich等人的美国公开的专利申请N0.2004/0018176，两者公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0173]给定miR基因的表达还可以被反义核酸抑制。如本文所使用的，“反义核酸”指通过RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用的方式与靶RNA结合的核酸分子，其改变所述靶RNA的活性。适用于本发明方法的反义核酸是单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合体、肽核酸(PNA))，其通常包含与miR基因产物中连续核酸序列互补的核酸序列。所述反义核酸可包含与miR基因产物中连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补、或95-100%互补的核酸序列。
[0174]不希望受任何理论限制，认为所述反义核酸激活RNase H或另一个消化所述miR基因产物/反义合适双链体的细胞核酸酶。
[0175]反义核酸还可含有对所述核酸骨架或对糖和碱基部分(或其等价物)的修饰以增强靶特异性、核酸酶抗性、与分子功效相关的递送或其他性质。所述修饰包括胆固醇部分、双链嵌入剂(诸如，吖啶)，或一种或多种抗核酸酶基团。
[0176]如上面关于所述分离的miR基因产物的描述，反义核酸可以化学或生物制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达。示例性的制备和测试方法是在本领域的技术范围内的；例如参见，Stein and Cheng (1993), Science261:1004 和 Woolf 等的美国专利N0.5，849，902，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0177]给定miR基因的表达还可以被酶促核酸抑制。如本文所使用的，“酶促核酸”指包含与miR基因产物的连续核酸序列互补的底物结合区的核酸，且其能特异性切割miR基因产物。所述酶促核酸底物结合区例如可以与miR基因产物中的连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补、或95-100%互补。所述酶促核酸还可在碱基、糖和/或磷酸基团处包含修饰。用于本发明方法的示例性酶促核酸是核酶。
[0178]如上面关于分离的miR基因产物的描述，所述酶促核酸可以化学或生物制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达。制备和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995), Nucl.Acids Res.23:2092-96;Hammann 等人(1999)，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9:25-31 ;和 Cech 等的美国专利 N0.4，987，071,其公开的全部内容以引用 方式并入本文。
[0179]施用至少一种miR基因产物或至少一个抑制miR表达的化合物将抑制在患有实体癌的受试者中癌细胞增殖。如本文所使用的，“抑制癌细胞增殖”指杀死所述细胞、或长期或临时妨碍或减慢所述细胞的生长。如果在施用所述miR基因产物或miR基因表达抑制化合物后，受试者中所述细胞的数量维持不变或降低，可以推定癌细胞增殖的抑制。如果所述细胞的绝对数量增加但肿瘤的生长速率降低，也可以推定癌细胞增殖的抑制。
[0180]受试者体内的癌细胞数量可以通过直接测量，或通过根据原发性或转移性瘤块的大小估计测定。例如，受试者中癌细胞的数量可以通过免疫组织学方法，流式细胞仪，或其他设计用于检测癌细胞特征表面标记物的技术进行测量。
[0181]瘤块的大小可以通过直接目测法、或通过诊断显像方法(诸如，X-射线、核磁共振成像、超声波和闪烁扫描法)确定。如本领域已知的，用于确定瘤块大小的诊断显像方法-可以与或不与造影剂一起使用。瘤块的大小还可以通过物理手段(诸如组织块的触诊或用测量仪器(如卡钳)测量组织块)确定。
[0182]可以通过任何适合给受试者的癌细胞递送这些化合物的方式给受试者施用所述miR基因产物或miR基因表达抑制化合物。例如，可以通过适合用这些化合物或用包括编码这些化合物的序列的核酸转染受试者细胞的方法施用所述miR基因产物或miR表达抑制化合物。
[0183]在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的质粒或病毒载体转染所述细胞。
[0184]真核细胞的转染方法是本领域所熟知的，例如包括，将所述核酸直接注入细胞的核或原核中；电穿孔；脂质体转移或亲脂性材料介导的转移；受体介导的核酸递送、生物弹道(bioballistic)或粒子加速；磷酸沉淀，和病毒载体介导的转染。
[0185]例如，用脂质体转移化合物例如，DOTAP (N-[l- (2，3_ 二油酰基氧基)丙基]_N, N, N-三甲基-甲基硫酸铵,Boehringer-Mannheim)或等价物(诸如LIPOFECTIN)转染细胞。所使用的核酸的量对本发明实践来说不是关键的；用0.1-1OOii g核酸/IO5细胞可获得可接受的结果。例如，可以使用在3iig D0TAP/105细胞中约0.5iig质粒载体的比例。
[0186]还可以通过任何合适的肠内或肠胃外施用途径给受试者施用miR基因产物或miR基因表达抑制化合物。本发明方法的合适肠内施用途径例如包括，口服、直肠或鼻内递送。合适的肠胃外施用途径例如包括，血管内施用(例如，静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和导管灌注到脉管系统中)；组织周围和组织内注射(例如,肿瘤周围和肿瘤内注射、视网膜内注射、或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(诸如通过渗透泵)；直接施用到目的组织；例如通过导管或其他敷设装置(例如，视网膜丸粒或栓剂或包括多孔、无孔或凝胶材料的植入物);和吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和直接注射到肿瘤中。
[0187]在本发明的方法中，miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物可以以裸RNA，或与递送剂组合，或以包含表达所述miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)给受试者施用。合适的递送剂例如包括，Mirus TransitTKO亲脂试剂；脂质转染(Iipofectin);脂质转染胺(lipofectamine) ;cellfectin ;聚阳离子(例如，聚赖氨酸)和脂质体。
[0188]包含表达所述miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物的序列的重组质粒和病毒载体，和将所述质粒和载体递送至癌细胞的技术如本文所讨论的和/或在本领域中是熟知的。
·[0189]在一个具体的实施方案中，使用脂质体将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或包括编码它们的序列的核酸)递送到受试者中。脂质体还可以增加所述基因产物或核酸的血液半衰期。用于本发明的合适脂质体可以由标准微泡形成脂形成，其通过包括中性或带负电的磷酸脂和固醇，诸如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素，诸如所需脂质体的大小和血液中所述脂质体的半衰期来进行指导。已知许多制备脂质体的方法例如，如Szoka等(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467 ;和美国专利 Nos.4，235，871、4，501，728、4，837，028和5，019，369中所描述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0190]用于本发明方法的脂质体可包括使脂质体靶向癌细胞的配体分子。优选与癌细胞中普遍存在的受体结合的配体，诸如与肿瘤细胞抗原结合的单克隆抗体。
[0191]还可以修饰用于本发明方法的脂质体以避免被单核巨噬细胞系统(“丽S”)和网状内皮组织系统(“RES”)清除。如此修饰的脂质体在表面上具有调理抑制(opsonization-1nhibition)部分或使调理抑制部分整合到所述脂质体结构中。在一个特别优选的实施方案中，本发明的脂质体可包括调理抑制部分和配体。
[0192]用于制备本发明脂质体的调理抑制部分典型地为与脂质体膜结合的大的亲水聚合物。如本文所使用的，当调理抑制部分与膜化学或物理连接时(例如，通过将脂溶性锚插入膜自身中，或通过直接与膜脂的活性基团结合)，调理抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理抑制亲水聚合物形成保护的表面层，其通过MMS和RES显著降低所述脂质体的摄取；例如，如在美国专利N0.4,920,016中所描述的，其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0193]适合修饰脂质体的调理抑制部分优选是数均分子量优选为约500-40000道尔顿，和更优选为约2000-20000道尔顿的水溶性聚合物。所述聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPGJP PEG或PPG硬脂酸脂；合成聚合物，诸如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯吡咯烷酮；直链、支链或树枝状聚酰氨基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如，与羧基或氨基化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂(诸如神经节苷脂GMl) JEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物、或其衍生物也是合适的。此外，所述调理抑制聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰氨基胺、聚乙烯胺或聚核苷酸之一的嵌段共聚物。所述调理抑制聚合物还可以是含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如，半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶、胺化多糖或寡糖(直链或支链)；或羧化多糖或寡糖，例如，与具有羧酸基团所得连接的碳酸衍生物反应。优选地，所述调理抑制部分是PEG、PPG、或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物改性的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
[0194]可以通过众多熟知技术中之一，将所述调理抑制部分与脂质体膜连接。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯可以与磷脂酰乙醇胺的脂溶性锚结合，然后与膜结合。类似地，葡聚糖聚合物可以在60°C下经由使用Na (CN) BH3和溶剂混合物(诸如30:12的四氢呋喃和水)的还原性胺化(amination)用硬脂酰氨脂溶性锚衍生。
[0195]经调理抑制部分改性的脂质体比未改性的脂质体在循环中维持更长时间。因此，所述脂质体有时称为“隐形”脂质体。已知隐形脂质体在由多孔或“渗透”微血管系统供养的组织中聚集。因此，这种微血管系统缺陷表征的组织，例如，实体瘤将有效聚集这些脂质体，参见 Gabizon,等(1988)，Proc.Natl.Acad.Sc1.，U.S.A.，18:6949_53。此外，RES 摄取的降低通过防止肝和脾内脂质体显著的积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理抑制部分改性的脂质体特别适合于将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或包括编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。
[0196]根据本领域中已知的技术，所述miR基因产物或miR基因表达抑制化合物可配制成药物组合物，在给受试者施用它们之前，有时称为“药物”。因此，本发明包括治疗实体癌的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一个分离的miR基因产物或其分离的变体或生物活性片段，和药学可接受的载体。在一个具体的实施方案中，所述至少一种miR基因产物对应于一种miR基因产物，其相对于合适的对照细胞，在实体癌细胞中具有降低的表达水平。在一些实施方案中，所述分离的miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0197]在其他实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制化合物。在一个具体的实施方案中，所述至少一种miR基因表达抑制化合物对miR基因具有特异性，所述miR基因在结肠癌细胞中的表达高于在对照细胞中的表达。在某些实施方案中，所述miR基因表达抑制化合物对一种或多种miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
[0198]本发明的药物组合物特征在于至少是无菌和无致热原的。如本文所使用的，“药物组合物”包括用于人和兽医用途的制剂。本发明药物组合物的制备方法是在本领域的技术范围内的，例如，如在 Remington’s Pharmaceutical Science,第 17 版，Mack PublishingCompany, Easton, Pa.(1985)中所述的,其公开的全部内容以引用方式并入本文。
[0199]本发明的药物组合物包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)(例如，0.1-90重量％)或其生理学可接受的盐，与药学可接受的载体混合。在某些实施方案中，本发明的药物组合物还包含一种或多种抗癌试剂(例如，化疗试剂)。本发明的药物制剂还包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)，其被脂质体和药学可接受的载体封装成胶囊。在一个实施方案中，所述药物组合物包含为miR-21的miR基因或基因产物。
[0200]尤其适合的药学可接受的载体是水、缓冲水溶液、正常盐水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸等。
[0201]在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物包含对核酸酶降解具有抗性的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。本领域的技术人员能容易地合成核酸酶抗性的核酸，例如，通过将一种或多种在2’-位置修饰的核糖核苷酸整合到所述miR基因产物中。合适的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’ -位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修饰的那些。
[0202]本发明的药物组合物还包含常规的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、等渗调节剂、缓冲剂和PH调节剂。合适的添加剂例如包括，生理学上生物相容的缓冲溶液(例如，盐酸氨丁三醇)，加入螯合剂(诸如，例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合复合物(诸如，例如，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)、或任选地加入钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)。可包装本发明的药物组合物以液体形式使用或可将其冻干。
[0203]对于本发明的固体药物组合物，可以使用常规无毒的固体药学可接受载体；例如，医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
[0204]例如，口服施用的固体药物组`合物可包含上面所列的任何载体和赋形剂，且包含10-95%、优选25 % -75 %的所述至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气溶胶(吸入)施用的药物组合物可包含如上所述封装在脂质体中的0.01-20重量％、优选I重量％ -10重量％的所述至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)，和推进剂。还可以根据需要包含载体，例如，用于鼻内递送的卵磷脂。
[0205]本发明的药物组合物可进一步包含一种或多种抗癌试剂。在一个具体的实施方案中，所述组合物包含至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和至少一种化疗试剂。适用于本发明方法的化疗试剂包括，但不限于，DNA-烷基化试剂、抗肿瘤抗生素试剂、抗代谢试剂、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、荷尔蒙拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、CDK抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三螺旋DNA、核酸适配体(nucleic acids aptamers),以及分子改良的病毒、细菌和外毒素试剂。适合本发明组合物的试剂的实例包括，但不限于:胞苷阿拉伯糖苷、甲氨蝶呤、长春新碱、依托泊甙(VP-16)、阿霉素(亚德里亚霉素)、顺钼(⑶DP)、地塞米松、arglabin、环磷酰胺、沙可来新、甲基亚硝基脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、长春花碱、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、过氧化氢、奥沙利钼、依立替康、拓扑替康、醛氢叶酸、卡氮芥、链脲佐菌素、CPT-11、紫杉醇、他莫昔芬、达卡巴嗪、利妥昔单抗、柔红霉素、1-0-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、伊马替尼、氟达拉滨、多西他塞、F0LF0X4。
[0206]本发明还提供肿瘤形成抑制剂的鉴定方法，包括给细胞提供测试试剂并测量所述细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，所述方法包括给细胞提供一种测试试剂并测量癌细胞中与表达水平降低相关的至少一种miR基因产物的水平。在提供所述试剂后，相对于合适的对照细胞(例如，没有提供试剂)，所述细胞中miR基因产物水平的增加指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。在一个具体的实施方案中，在癌细胞中与表达水平降低相关的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组。
[0207]在其他实施方案中，所述方法包括给细胞提供一种测试试剂并测量癌细胞中与表达水平增加相关的至少一种miR基因产物的水平。在提供试剂后，相对于合适的对照细胞(例如，没有提供试剂)，所述细胞中miR基因产物水平的降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。在一个具体的实施方案中，在癌细胞中与表达水平增加相关的至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组。
[0208]合适的试剂包括，但不限于药物(例如，小分子、多肽)，和生物大分子(例如，蛋白、核酸)。所述试剂可以重组、合成产生，或其可以由天然来源分离(即，纯化)。给细胞提供所述试剂的各种方法(例如，转染)是本领域中熟知的，所述方法中的几个描述于上文中。检测至少一种miR基因产物表达的方法(例如，Northern印迹、原位杂交、RT-PCR、表达分析)也是本领域中熟知的。这些方法中的几个也描述于上文中。
[0209]本发明现在将通过下述非限制性实施例进行描述。
实施例
[0210]实施例1
[0211]结肠肿瘤中微小RNA表达模式的改变
[0212]使用微小RNA微阵列比较84对结肠肿瘤和临近非肿瘤组织的微小RNA谱3°。这84个受试者是招募自马里兰巴尔的摩地区的患者，所述患者患有易发性结肠腺癌(incidentcolon adenocarcinoma),并称为马里兰测试群(cohort)(表 I)。
[0213]表1一群(population)和肿瘤的特征
[0214]
【权利要求】
1.一种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法，包括:测量来自受试者的测试样品中至少一种HliR基因产物的水平，其中相对于对照样品中对应HliR基因产物的水平，测试样品中所述HliR基因产物水平的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病或处于发展出结肠癌相关疾病的风险中。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
3.权利要求1的方法,其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
4.一种测试结肠癌相关疾病应答的引发、对结肠癌相关疾病应答的倾向、或降低的结肠癌相关疾病应答存活预后中至少一种的方法，其包括: (1)测定来自受试者的样品中至少一种标记物的表达水平；所述至少一种标记物包括至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组； (2)比较步骤(1)中测定的表达水平与来自健康受试者的样品中所述标记物的对照表达水平；和 (3)当步骤(2)中的比较结果指示i)受试者中所述至少一种标记物的表达水平比对照中的高，或ii)受试者中所述至少一种标记物的表达水平比对照中的低时，判断受试者患有结肠癌相关疾病。
5.权利要求4的测试方法，其中所述样品包括组织、血液、血浆、血清、尿和粪便的一种或多种。
6.权利要求4的测试方法，其中所有的方法步骤在体外进行。
7.—种诊断受试者是否患有结肠癌相关疾病、处于发展出结肠癌相关疾病的风险中、或具有降低的结肠癌相关疾病存活预后的方法，包括: (1)对来自获自受试者的测试样品的RNA进行逆转录以提供一组靶寡聚脱氧核苷酸； (2)使所述靶寡聚脱氧核苷酸与微阵列杂交以提供所述测试样品的杂交谱，所述微阵列包括miRNA特异性探针寡核苷酸；和 (3)比较所述测试样品的杂交谱与对照样品产生的杂交谱， 其中至少一种miRNA信号的改变指示所述受试者患有结肠癌相关疾病，处于发展出结肠癌相关疾病的风险中，或具有降低的结肠癌相关疾病的存活预后。
8.权利要求7的方法,其中相对于对照样品产生的信号,至少一种miRNA信号是被上调或下调的。
9.权利要求7的方法，其中所述微阵列包括针对一种或多种miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸，所述miRNA选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
10.一种抑制受试者中肿瘤形成的方法，所述受试者患有或怀疑患有结肠癌相关疾病，其中相对于对照细胞，在受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物是被上调或下调的，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，包括: (I)如果癌细胞中所述至少一种miR基因产物是被下调的，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成；或 (2)如果癌细胞中所述至少一种miR基因产物是被上调的，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因产物表达的化合物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203及其组合组成的组，从而抑制受试者中肿瘤形成。
11.权利要求10的方法，其中在步骤(1)和/或步骤(2)中所述至少一种分离的miR基因产物是miR-21、或其分离的变体、或其生物活性片段或功能等价物，或与其结合的抗体。
12.—种抑制患有结肠癌的受试者中肿瘤形成的方法，包括: (1)测定相对于对照细胞，来自所述受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物的量；和 (2)改变在癌细胞中表达的miR基因产物的量，通过: (i )如果在癌细胞中表达的所述miR基因产物的量少于对照细胞中表达的miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其组合组成的组；或 (ii)如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种抑制所述至少一种miR基因产物的化合物； 从而抑制受试者中的肿瘤形成。
13.权利要求12的方法，其中在步骤(i)中所述至少一种分离的miR基因产物是miR-21或其分离的变体或生物活性片段。`
14.权利要求12的方法，其中在步骤(ii)中所述至少一种miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-18lb、miR-203及其组合组成的组，或其分离的变体或生物活性片段。
15.一种鉴定肿瘤形成抑制剂的方法，包括: 给细胞提供一种测试试剂，并 测量与结肠癌相关疾病中改变的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中所述miR基因产物水平的升高或降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。
16.权利要求15的方法，其中所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
17.一种鉴定肿瘤形成抑制剂的方法，包括: 给细胞提供一种测试试剂，并 测量与结肠癌相关疾病中改变的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平，其中相对于合适的对照细胞，所述细胞中所述miR基因产物水平的降低指示所述测试试剂为肿瘤形成的抑制剂。
18.权利要求25的方法，其中所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
19.权利要求26的方法，其中所述结肠癌相关疾病是腺癌。
20.一种评估一种或多种代谢途径的标记物，所述代谢途径对至少一种结肠癌相关疾病的引发、进展、严重性、病理、恶性、分期、活性、残疾、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在致病或病理特征的至少一种有贡献，其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
21.—种包含一种或多种权利要求20的标记物的组合物。
22.一种鉴定受试者中至少一种结肠癌相关疾病引发或发展的潜力的方法，所述方法提供对权利要求20的标记物的一种或多种的测量。
23.权利要求22的方法，其中在分离的样品中存在一种或多种标记物，且所有的方法步骤在体外进行。
24.—种测试结肠癌相关疾病的试剂,其中所述试剂包含多核苷酸,所述多核苷酸包括权利要求20的标记物的至少一种的核苷酸序列或与所述标记物的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
25.一种测试结肠癌相关疾病的试剂，其中所述试剂包含抗体，所述抗体识别由权利要求20的标记物的至少一种编码的蛋白。
26.—种测试结肠癌相关疾病的DNA芯片，探针固定在所述芯片上以测试权利要求20的标记物的至少一种。
27.一种评估疗法 对预防、诊断和/或治疗至少一种结肠癌相关疾病的效力的方法，包括: 1)给动物实施一种疗法，对所述疗法的效力进行评估，和 2)通过评价权利要求20的标记物的至少一种以测定在治疗或预防结肠癌相关疾病中被测试的治疗的效力水平。
28.权利要求27的方法，其中所述候选治疗剂包括药物组合物、保健组合物和顺势疗法组合物的一种或多种。
29.权利要求27的方法，其中所述被评估的疗法可用于人受试者。
30.权利要求27的方法，其中所述方法不是通过手术或疗法来治疗人体或动物体的方法。
31.一种评估至少一种材料在动物模型中引发结肠癌相关疾病应答的潜力的方法，所述方法提供: 1)在使动物与足以引发动物中结肠癌相关疾病应答的量的一种或多种材料接触后，测量一种或多种被上调或下调的权利要求20的标记物；和 2)测定所述被上调或下调标记物的至少一种是否具有引发结肠癌相关疾病应答的能力。
32.—种治疗结肠癌相关疾病的药物组合物，包括: 至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR_106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组；和 药学可接受的载体。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述至少一种miR基因产物对应于在癌细胞中相对于合适的对照细胞被上调或下调的miR基因产物。
34.权利要求32的药物组合物，其中所述miR基因产物是miR-21。
35.权利要求32的药物组合物，其中所述结肠癌相关疾病是腺癌。
36.一种治疗结肠癌的药物组合物，包括:至少一种miR表达抑制化合物，和 药学可接受的载体， 其中所述的至少一种miR表达抑制化合物对miR基因产物具有特异性，所述miR基因产物选自由 miR20a、miR-21、miR_106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述至少一种miR表达抑制化合物对在癌细胞中相对于合适的对照细胞被上调或下调的miR基因产物具有特异性。
38.一种产品包括:至少一种与结肠癌相关疾病的标记物结合的捕获试剂，所述标记物选自权利要求20的标记物的至少一种。
39.一种用于筛选用于治疗结肠癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括: 至少一种权利要求20的标记物的一种或多种试剂，和 表达至少一种标记物的细胞。
40.权利要求39的试剂盒，其中使用包括抗体或抗体片段的试剂以检测所述标记物的存在，所述抗体或抗体片段与至少一种标记物特异性结合。
41.权利要求40的试剂盒，其中所述试剂是标记的、放射标记的、或生物素标记的，和/或其中所述抗体或抗体片段是放射标记的、生色团标记的、荧光团标记的或酶标记的。
42.权利要求39的试剂盒进一步包括容器，其包含所述标记物的至少一种。
43.权利要求39的试剂盒`，其中所述试剂包括抗体、与所述附带或可附带的探针、和固定金属螯合物的一种或多种。
44.一种结肠癌相关疾病的筛选测试包括: 使权利要求20的标记物的一种或多种与所述标记物的底物和与测试试剂接触，并 测定所述测试试剂是否调节所述标记物的活性。
45.权利要求44的筛选测试，其中所有的方法步骤在体外进行。
46.一种预测受试者中结肠癌相关疾病存在的微阵列，包括抗体，其针对权利要求20的标记物的至少一种。
47.前述权利要求中任一项的方法，其中通过检测经转录的多核苷酸或其部分的存在以评估所述标记物的表达水平，其中所述经转录的多核苷酸包括所述标记物的编码区。
48.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是结肠癌相关体液或组织。
49.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品包括获自患者的细胞。
50.一种治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括: 给所述个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂，以足以干扰所述信号传导的量， 其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
51.权利要求50的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
52.—种干扰至少一种结肠癌相关疾病应答信号传导途径的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性， 其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
53.权利要求52的用途，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
54.一种治疗、预防、逆转或限制在需要其的个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性的方法，包括: 给所述个体施用干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂， 其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR-181b，miR-203 及其组合组成的组。
55.权利要求55的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
56.一种干扰至少一种结肠癌相关疾病应答级联的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防、逆转或限制个体中结肠癌相关疾病并发症的严重性， 其中所述试剂包含至少一种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR_21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。
57.权利要求56的用途，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
58.一种包含数据库的计算机可读介质，所述数据库具有多种数字编码的参考谱，其中至少第一参考谱代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第一标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记， 其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203 及其组合组成的组。
59.权利要求58的计算机可读介质，包含至少第二参考谱，其代表来自一个或多个受试者的一个或多个样品中至少第二标记物的水平，所述受试者展示结肠癌相关疾病应答的标记，或受试者患有结肠癌相关疾病。
60.一种测定患者是否患有，或倾向于患有结肠癌相关疾病，或具有差的结肠癌相关疾病存活预后的计算机系统，包括: 权利要求58的数据库，和 包含计算机执行代码的服务器，所述代码使计算机接收受试者的谱，从数据库中识别在诊断上与受试者谱相关的匹配参考谱,并产生所述受试者是否患有或倾向于患结肠癌相关疾病的指示。
61.一种评价受试者中结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度的计算机辅助方法，包括: 1)提供一种计算机，其包括对获自所述受试者的样品的数据进行分类的模型或运算法则， 其中，所述分类包括就至少一种标记物的存在、不存在或量针对所述数据进行分析，和 其中所述标记物包括一种或多种miR基因产物，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR_181b、miR-203 及其组合组成的组。 2)输入获自受试者的生物样品的数据；和 3 )对生物样品进行分类以指示结肠癌相关疾病的存在、不存在、性质或程度。
62.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种miR基因产物及其组合包括其分离的变体、或生物活性片段或功能等价物、或与其结合的抗体。
63.前述权利要求中任一项的方法，其中所述结肠癌相关疾病是腺癌。
64.—种结肠癌的动物模型，其中存在一种或多种miR基因产物中至少一种改变的表达，所述miR基因产物选自由miR20a、miR-21、miR-106a、miR-181b、miR-203及其组合组成的组。
65.权利要求64的动物模型，其中所述动物模型是非人脊椎动物。
66.权利要 求64的标记物，其中所述动物模型是小鼠、大鼠、兔或灵长类动物。
【文档编号】A01K67/027GK103589784SQ201310396056
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2007年7月12日 优先权日:2006年7月13日
【发明者】C·M·克罗斯, C·C·哈里斯, A·J·斯彻特 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会, 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府