一种麻疯树基因、重组质粒及在提高植物抗盐、耐旱性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程领域，提供了一种从麻疯树克隆得到的基因JcSnRK2、含所述基因的真核重组质粒及植物转化体，实验表明：JcSnRK2基因的表达能够促进拟南芥SnRK2.8缺失型植株根系的生长，明显提高其耐高盐及抗干旱能力，降低叶片的失水率，能够激发响应渗透胁迫的下游基因的表达。因此，本发明所述JcSnRK2基因和真核重组质粒可在提高植物抗盐、耐旱性中应用。
【专利说明】一种麻疯树基因、重组质粒及在提高植物抗盐、耐旱性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种从麻疯树克隆得到的基因、含所述基因的真核重组质粒及其应用。
【背景技术】
[0002]在植物的生长和发育过程中，经常会遭遇到各种环境压力，譬如干旱、盐碱、高温或寒冷、氧化、营养缺乏、病原体侵入等等，特别是全球水资源紧张以及近一半农业灌溉土地受到高盐胁迫的影响，造成农作物产量下降甚至引起植物死亡。近年来，通过基因工程手段进行人工育种已经成为赋予植物逆境耐受能力的主要生物手段。
[0003]SnRK2 (鹿糖非酵解型蛋白激酶 2，sucrose non-fermentingl-related proteinkinase2)与植物的逆境胁迫应答关系密切，目前认识相对全面的是拟南芥和水稻，均各有 10 个家族成员，前者命名为 SnRK2.1 -SnRK2.10 (Hrabak EM, et al.,2003, TheArabidopsis CDPK - SnRK superfamily of protein kinases, Plant Physiology,132,666 - 680)，后者命名为 SAPKl -SAPK10 (Kobayashi Y, et al.,2004, Differentialactivation of the rice sucrose nonfermentingl-related protein kinase2familyby hyperosmotic stress and abscisic acid, The Plant Cell,16(5):1163-1177)。最近也有关于小麦TaSnRK2.4和玉米ZmSAPK8基因功能的分析，其在拟南芥中的过量表达均能提高转基因植株的多种抗胁迫能力(Mao XG, et al.,2010, TaSnRK2.4, an SNFl-typeserine/threonine protein kinase of wheat(Triticum aestivum L.)，confersenhanced multistress tolerance in Arabidopsis, Journal of Experimental Botany,61 (3):683 - 696 ;Ying S, et al.,2011, Cloning and characterization of a maizeSnRK2protein kinase gene conf`ers enhanced salt tolerance in transgenicArabidopsis, Plant Cell R印，30:1683 - 1699)。虽然SnRK2家族受到关注和研究，但在木本植物中却鲜有研究，在麻疯树(Jatropha curcas L.)的研究中也尚未见报道。通过克隆技术筛选出更多的SnRK2基因，对于提高植物抗性，培育出能够在高盐、干旱条件下仍能正常生长的植物具有重要作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供一种从麻疯树克隆得到的基因、含所述基因的真核重组质粒及植物转化体，本发明的目的之二是将所述基因和真核重组质粒在提高植物抗盐、耐旱性中应用，以培育出具有高盐、干旱抗性的植株。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]利用现有草本植物SnRK2基因的保守序列设计扩增中间片段的简并引物，根据所得中间片段序列进行5' Race和3' Race分别获得上、下游序列，然后根据拼接序列设计特异引物，以麻疯树叶片总RNA为模板进行RT-PCR扩增得到基因全长，命名为JcSnRK2。序列分析显示，所述JcSnRK2基因的mRNA包含1017个碱基的开放阅读框，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示,其基因组DNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示,所述JcSnRK2基因编码的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示。生物信息学分析和基因表达模式分析显示，JcSnRK2基因属于SnRK2家族成员。
[0007]本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列与真核表达载体构成，序列表中SEQ ID No:1所示核苷酸序列正向插入真核表达载体的Xba I和BamH I双酶切位点，所述真核表达载体为pBI121、pBI221或pBin438。
[0008]本发明所述植物转化体，是将上述真核重组质粒通过农杆菌侵染花序法导入拟南芥SnRK2.8缺失型植株形成，经过卡那霉素抗性筛选、⑶S染色及PCR鉴定，得到JcSnRK2基因稳定表达的转基因拟南芥种子。实验表明:JcSnRK2基因的表达能够促进拟南芥SnRK2.8缺失型植株根系生长，明显提高其耐高盐及抗干旱能力，降低叶片的失水率，能够激发响应渗透胁迫的下游基因的表达。因此，本发明所述JcSnRK2基因和真核重组质粒可在提高植物抗盐、耐旱性中应用。
[0009]本发明具有以下有益效果: [0010]1、本发明通过Race法克隆了一个新的麻疯树基因JcSnRK2，将该基因与真核表达载体构建真核重组质粒，为提高植物抗盐、耐旱性提供了一种新的真核重组质粒。
[0011]2、本发明通过实验证明所述真核重组质粒能够提高植物耐高盐及抗干旱的能力，能够降低叶片的失水率，能够激发响应渗透胁迫的下游基因的表达，因而可将所述重组质粒在人工抗性育种中应用，以培育出具有高盐、干旱抗性的植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为实施例1中麻疯树叶片总RNA的琼脂糖凝胶电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker，购自艾德莱公司)，I泳道:麻疯树叶片总RNA。
[0013]图2为实施例1中JcSnRK2中间片段的PCR扩增电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2中间片段的扩增结果。
[0014]图3为实施例1中3’ Race扩增JcSnRK2基因的下游片段电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2下游片段的PCR扩增结果。
[0015]图4为实施例1中5’ Race扩增JcSnRK2基因的上游片段电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker)，I泳道:JcSnRK2上游片段的PCR扩增结果。
[0016]图5为实施例1中JcSnRK2基因ORF的PCR扩增结果电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker)，1、2泳道:JcSnRK2基因ORF的PCR扩增结果。
[0017]图6为实施例1中JcSnRK2基因ORF的菌落PCR结果电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker)，1-10泳道:10个转化子的PCR扩增结果。
[0018]图7为实施例1中JcSnRK2基因组DNA的PCR扩增结果电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL15000DNAMarker，购自艾德莱公司)，泳道1、2为JcSnRK2基因组DNA的PCR扩增结果。
[0019]图8为实施例1中JcSnRK2基因组DNA的序列结构分析图。
[0020]图9为实施例2中麻疯树与6种其它植物的SnRK2基因的系统进化树分析图。
[0021]图10为实施例2中麻疯树JcSnRK2与拟南芥SnRK2蛋白家族的系统进化树分析图。
[0022]图11为实施例2中JcSnRK2基因编码的多肽的氨基酸序列分析。
[0023]图12为实施例2中JcSnRK2基因的组织特异性表达分析图。
[0024]图13为实施例2中JcSnRK2基因在ABA处理下的表达情况分析图。
[0025]图14为实施例2中JcSnRK2基因在盐胁迫下的表达情况分析图。
[0026]图15为实施例2中JcSnRK2基因在干旱胁迫下的表达情况分析图。
[0027]图16为实施例2中JcSnRK2基因在冷胁迫下的表达情况分析图。
[0028]图17为本发明所述真核重组质粒的一种示意图。
[0029]图18为实施例3中双酶切电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker)，I泳道:pBI121质粒XbaI和BamHI双酶切产物，2泳道:pBI121质粒；3泳道:pET-JcSnRK2质粒；4泳道:PET-JcSnRK2质粒的XbaI和BamHI双酶切产物。
[0030]图19为实施例3中转pBI121-JcSnRK2农杆菌菌落PCR电泳图，图中，M泳道:分子量标记(AL2000DNAMarker)，1-7泳道-J个转化子的扩增结果。
[0031]图20为实施例3中转JcSnRK2基因拟南芥⑶S染色图，其中，图A、B、C分别为幼苗、角果和花的GUS染色图。
[0032]图21为实施例3中转JcSnRK2基因拟南芥PCR验证电泳图，图中，图(A)为转JcSnRK2基因拟南芥基因组PCR鉴定结果，图(B)为RNA的RT-PCR鉴定结果；1-6泳道:转基因拟南芥的PCR结果；7泳道:非转基因拟南芥的PCR结果。
[0033]图22是实施例3中snf2.8和JK2根生长情况分析图，其中，图㈧为snf2.8和JK2于MS培养基生长I周后幼苗的根长情况图，图(B)为snf2.8和JK2于MS培养基生长I周后幼苗的根长情况统计图，图(C)为snf2.8和JK2在土中培养45天的幼苗根系生长情况图。
[0034]图23是实施例3中snf2.8和JK2发芽率统计图。
[0035]图24是实施例3中snf2.8和JK2在盐胁迫下的生长状况图，其中，上排和下排分别为snf2.8和JK2在含有不同浓度NaCl的MS培养基上生长I个月后的状况图。
[0036]图25是实施例3中snf2.8和JK2植株抗盐性分析图，其中，图A为生长30天的幼苗被450Mm NaCl溶液胁迫2周和I个月后的生长状况图，图B为生长45天的幼苗被450MmNaCl溶液胁迫2周和I个月后的生长状况图。
[0037]图26是实施例3中snf2.8和JK2在干旱胁迫下的生长状况图，其中，图A为snf2.8和JK2在含不同浓度甘露醇的MS培养基上生长I个月后的概况，图B为snf2.8和JK2在含不同浓度甘露醇的MS培养基上生长I个月后的具体表型。
[0038]图27是实施例3中snf2.8和JK2植株抗旱性分析图，其中，上排和下排分别为生长30天、45天的snf2.8和JK2幼苗停止供水I个月后的生长状况图。
[0039]图28是实施例3中离体叶片失水率检测结果图。
[0040]图29是实施例3中JcSnRK2及其下游基因AREBl、LEA、RD29A、RD29B在干旱胁迫下的表达水平检测结果图。
【具体实施方式】
[0041]以下结合实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),实验动物常规手册(国家实验动物规范中心，2004年11月):基本技术指南第五版(John ffiley&Sons, Inc, 2005)中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。
[0042]下述实施例中，麻疯树成熟种子和麻疯树花采自海南省三亚市凤凰镇水蚊村，麻疯树根、茎、叶取自用麻疯树成熟种子培育的麻疯树幼苗，培育操作:将麻疯树成熟种子播种于花盆中，在温室(30~35°C)、24h全光照条件下培养一至两个月。
[0043]实施例1:麻疯树JcSnRK2基因的分子克隆
[0044]1、麻疯树叶片总RNA的提取
[0045]麻疯树叶片总RNA的提取使用Plant RNeasy Kit (Qiagen),具体步骤如下:
[0046]I)取麻疯树叶片≤0.lg，液氮充分研磨，加入450 μ I RLC (预先加入β -巯基乙醇)，剧烈振荡；
[0047]2)将液体移入紫色滤柱中，置于2ml收集管，室温，14，OOOrpm离心2min，滤液入
1.5mlEP管，小心勿吸入沉淀；
[0048]3)加入相当于滤液1/2体积的无水乙醇，抽打混匀；
[0049]4)将样品，包括沉淀移入粉色滤柱，室温，10，OOOrpm离心15s，弃滤液；
[0050]5)加入 700μ1 RWlbuffer,室温，10，OOOrpm 离心 15s,清洗过柱;
[0051]6)加入500μ1 RPE，室温，10，OOOrpm离心15s，清洗过柱，重复该操作一次；
[0052]7)室温，14, OOOrpm 离心 Imin,弃滤液；
[0053]8)将滤柱放入1.5ml收集管中，加入30~50 μ I RNase-free水，室温，10, OOOrpm离心Imin即得麻疯树叶片总RNA。
[0054]其琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
[0055]2、JcSnRK2基因中间片段的获得
[0056]2.1Reverse Transcriptase M-MLV 合成 cDNA 第一链
[0057]按照反转录酶M-MLV (TaKaRa)的操作说明进行，以步骤I所得麻疯树叶片总RNA为模板，Olig0(ClT)18S引物。
[0058]在RNase-free 的 0.2ml PCR 管中加入
[0059]麻疯树叶片总RNA3 μ I (约500ng)
[0060]01igo(dT)18 (50 μ Μ) I μ I
[0061]用RNase-free ddH20 将体积补充至 6 μ I。
[0062]混匀后，70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min以上，然后短暂离心使管中溶液集于EP管底部。在冰上依次加入以下试剂:5XM-MLV Buffer2 μ I ；dNTP (10 μ Μ) 0.5 μ I ；RNaseInhibitor0.3 μ I ；RTase M-MLV0.5 μ I ；RNase-free ddH200.7 μ I。混合均匀后再次放入PCR仪42°C反应lh，70°C反应lOmin，存于_20°C备用。
[0063]弓丨物Oligo(ClT)18 序列为:5 ' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3/
[0064]2.2PCR
[0065]于冰上在一个0.2ml的EP管中加入以下组分:
[0066]
【权利要求】
1.一种从麻疯树克隆得到的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo:1所示。
2.一种真核重组质粒，其特征在于该重组质粒由序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列与真核表达载体构成。
3.根据权利要求2所述真核重组质粒，其特征在于所述真核表达载体为PBI121、PBI221 或pBin438。
4.一种植物转化体，其特征在于该转化体是将权利要求2或3所述真核重组质粒导入拟南芥中形成。
5.权利要求2 或3所述真核重组质粒在提高植物抗盐、耐旱性中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103451215SQ201310398768
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】淳俊, 王胜华, 陈放 申请人:四川大学