一种促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法
【专利摘要】本发明涉及植物生物【技术领域】，具体地，公开了一种促进麻疯树不定芽芽体生根的方法。本发明主要是在诱导再生不定芽芽条生根的培养基中添加一定浓度的L-谷氨酰胺，由此可以促进芽条生根。应用本发明可以显著提高再生不定芽芽条生根的效率和再生不定根的质量，快速获得生长状态良好的不定根，缩短生根培养的周期（最快只需10天），使麻疯树相关生物技术育种的工作效率得到相应的大幅度的提高。
【专利说明】一种促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物【技术领域】，具体地，涉及一种促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法。
【背景技术】
[0002]伴随着全球对化石燃料的需求日益增长，存储的化石燃料即将耗尽，人们越来越关注可再生的生物柴油。在可产生生物柴油的候选植物中，属于大戟科的麻疯树(JatrophacurcasL.)具有明显的优势,它的种子含油量高,种仁含油量可达40%~60%,同时，麻疯树油中含有活性成分多，如毒蛋白、麻疯酮等有着重要的农药和医药价值。
[0003]然而，大力推广麻疯树的种植却面临一系列问题，虽然麻疯树种子中含油量高，但种子产量不高；种油中活性成分多，但仍需要改变油的成分才能直接替代化石燃料；麻疯树对环境要求较高，耐寒能力弱，分布区域较窄。麻疯树属包括175个种，可以通过种间杂交引入优良性状，但所需周期长，不能够获得特异的外源基因，故主要通过基因转化改变遗传背景。高频率的植株再生体系是基因转化的基础。
[0004]利用组织培养技术对植物进行再生或再生克隆，通常包含两个关键步骤。第一步是从外植体诱导产生不定芽。第二步是促使不定芽芽条生根，以备移栽。对于麻疯树，现有技术中已有很多报道研究其外植体诱导产生不定芽；而至于如何促使这些不定芽芽条良好生根，则很少有人研究。
[0005]现有技术中，迄 今为止已建立起来的诱导麻疯树再生不定芽芽条生根的方法一般都是在生根培养基中不添加激素或者只添加一定浓度的生长素，现有方法存在生根效率低、再生不定根的质量较差、所获得再生植株生长状态不佳、整个培养周期较长等缺点，难以满足实际应用的需要。
[0006]L-谷氨酰胺是一种条件必需性氨基酸，在生命活动中起着重要作用。它是构成蛋白质的氨基酸，又是合成含氮生物物质的氮源，与组织生长和修补有着密切的关系。在不同组织中谷氨酰胺具有不同的代谢作用，起着重要的生理作用。目前仅有一篇论文报道称，L-谷氨酰胺对石斛兰的生根有负面影响，在培养基中添加16mg/L的谷氨酰胺对石斛兰的生根和生长起抑制作用。
【发明内容】
[0007]本发明为了克服现有技术麻疯树不定芽芽条生根率低、生根质量差、培养周期长的缺陷，提供一种促进麻疯树不定芽芽条生根的方法。采用本方法可以在较短时间内就使得再生不定芽芽条的生根率达到较高值，因此可显著缩短再生培养周期；同时减少了生根过程中常见的再生植株叶片发黄现象，提高了所获得再生植株的质量，使麻疯树相关生物技术育种的工作效率得到相应的大幅度的提高。
[0008]本发明通过以下技术方案予以实现上述目的:
[0009]一种促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，将不定芽芽条接种在含有4~32mg/LL-谷氨酰胺的生根培养基上培养10~40天。
[0010]所述L-谷氨酰胺母液的配制方法为:准确称取一定量的L-谷氨酰胺粉末，用去离子水充分溶解后，再用去离子水定容，配制成2mg/mL的L-谷氨酰胺母液。使用前用0.22微米的水系滤膜对已配制好的L-谷氨酰胺母液进行过滤灭菌。使用时，再通过加入无菌水将L-谷氨酰胺母液配置成4、8、16、32、64、128mg/L的L-谷氨酰胺工作液。
[0011]所述不定芽芽条的获取方法为:从培养瓶中取出具有长度大于Icm且至少有2个伸展叶片的不定芽的外植体，用灭过菌的手术刀对伸长的再生不定芽进行横向切割(切割的方向与伸长的再生不定芽的中轴相垂直，切口要平齐)，切去其他部分，获取长度约为Icm的不定芽芽条。
[0012]优选地，将不定芽芽条接种在含有8~32mg/LL_谷氨酰胺的生根培养基上培养10~40天。
[0013]更优选地，将不定芽芽条接种在含有16mg/LL_谷氨酰胺的生根培养基上培养10天或将不定芽芽条接种在含有8~32mg/LL-谷氨酰胺的生根培养基上培养20~40天。
[0014]最优选地，将不定芽芽条接种在含有16mg/LL_谷氨酰胺的生根培养基上培养10~40天。
[0015]优选地，所述接种的方式为竖插方式，即使芽条的中轴与培养基表面相垂直，芽条的形态学下端插入培养基中的深度为0.2~0.4cm。
[0016]优选地，所述培养的条件为光照强度为2000~25001x，光照时间为12~16小时/天，培养温度为25±1°C。
[0017]优选地，所述生根培养`基还含有0.3mg/L吲哚丁酸，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，5g/L琼脂和大量元素减半的MS培养基成分。
[0018]本发明的有益效果:
[0019]本发明主要是改变了传统诱导麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，即在诱导不定根再生的培养基中添加一定浓度的L-谷氨酰胺，由此促使部分细胞以更高的效率直接再分化形成更多的不定根。此外，采用本方法可以在较短时间内就使得再生不定芽芽条的生根率达到较高值，因此可显著缩短再生培养周期；同时减少了生根过程中常见的再生植株叶片发黄现象，提高了所获得再生植株的质量，使麻疯树相关生物技术育种的工作效率得到相应的大幅度的提闻。
[0020]说明书附图
[0021]图1.麻疯树再生不定芽芽条在6种常见的传统生根培养基中进行不定根诱导培养 30 天后的效果；A: MS; B: 1/2MS; C: l/2MS+lmg/LIBA+lmg/LIAA+2mg/LNAA; D: l/2MS+lmg/LNAA;E:l/2MS+lmg/LIAA;F:l/2MS+lmg/LIBA (bar=Icm)D
[0022]图2.不同浓度L-谷氨酰胺对麻疯树再生不定芽芽条生根的作用效果与再生植株生长的效果；A: Omg/L; B: 4mg/L; C: 8mg/L; D: 16mg/L; E: 32mg/L; F: 64mg/L; G: 128mg/LL_ 谷氨酰胺的生根培养基中培养30d后的生根效果图；H:再生植株在土壤中继续生长的效果图(bar=lcm)。
[0023]图3.麻疯树再生不定芽芽条在添加16mg/LL_谷氨酰胺的生根培养基中不同培养时间下的生根效果与再生植株生长的效果;八和￡:10(1;8:20(1;(::30(1;0，F和G:40d后的生根效果图；H:再生植株在土壤中继续生长的效果图(bar=lcm)。[0024]图4.麻疯树再生不定芽芽条在添加了 L-谷氨酰胺的生根培养基中培养10天后的效果；A:8mg/LL-谷氨酰胺；B: 16mg/LL-谷氨酰胺；C:32mg/LL_谷氨酰胺(bar=lcm)。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。
[0026]实施例1
[0027]采用传统方法诱导麻疯树再生不定芽芽条生根的效果
[0028]S1.再生不定芽芽条的获取:从培养瓶中取出具有长度大于Icm且至少有2个伸展叶片的不定芽的外植体，用灭过菌的手术刀对伸长的再生不定芽进行横向切割(切割的方向与伸长的再生不定芽的中轴相垂直，切口要平齐)，切去其他部分，获取长度约为Icm的不定芽芽条。
[0029]S2.将SI获取的芽条以竖插方式(使芽条的中轴与培养基表面相垂直，芽条的形态学下端插入培养基中的深度为0.2~0.4cm。)接种至6种传统生根培养基上培养30天，所获得实验结果如表1和图1所示。
[0030]表1采用传统方法诱导麻疯树再生不定芽芽条生根的效果
[0031]
【权利要求】
1.一种促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，将不定芽芽条接种在含有4~32 mg/L L-谷氨酰胺的生根培养基上培养10~40天。
2.根据权利要求1所述促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，将不定芽芽条接种在含有8~32 mg/L L-谷氨酰胺的生根培养基上培养10~40天。
3.根据权利要求2所述促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，将不定芽芽条接种在含有16 mg/L L-谷氨酰胺的生根培养基上培养10天或将不定芽芽条接种在含有8~32 mg/L L-谷氨酰胺的生根培养基上培养20~40天。
4.根据权利要求3所述促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，将不定芽芽条接种在含有16 mg/L L-谷氨酰胺的生根培养基上培养10~40天。
5.根据权利要求1至4任一项所述促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，所述接种的方式为竖插方式，即使芽条的中轴与培养基表面相垂直，芽条的形态学下端插入培养基中的深度为0.2~0.4 cm。
6.根据权利要求1至4任一项所述促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，所述培养的条件为光照强度为2000~2500 lx，光照时间为12~16小时/天，培养温度为 25±1°C。
7.根据权利要求1至4任一项所述促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，所述不定芽芽条的获取方法为:选取长度大于I cm且至少有2个伸展叶片的不定芽的外植体，将伸长的再生不定芽进行横向切割，切割的方向与伸长的再生不定芽的中轴相垂直，切口要平齐，切去其他部分，获取长度约为I cm的不定芽芽条。
8.根据权利要求1至4任一项所述促进麻疯树再生不定芽芽条生根的方法，其特征在于，所述生根培养基还含有0.3 mg/L吲哚丁酸，30 g/L蔗糖，100 mg/L肌醇，5 g/L琼脂和大量元素减半的MS培养基成分。
【文档编号】A01H4/00GK103477987SQ201310422701
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】刘颖, 杨跃生, 刘振兰, 庄楚雄, 李静, 惠文凯, 彭昌操, 陈晓阳 申请人:华南农业大学