建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的方法，包括下述步骤：大鼠经高脂饲料喂养8周后，注射链脲佐菌素，制成糖尿病模型，稳定后在大鼠皮肤上制成深II度烫伤，三天后，每个溃疡处皮下注射菌株为金黄色葡萄球菌混悬液。此外，本发明还公开了一种用于建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的试剂盒，该试剂盒包括金黄色葡萄球菌混悬液。本发明的糖尿病溃疡实验动物模型通过对药物干预后生化指标的变化的检测，结果表明，本模型具有糖尿病足溃疡伴发革兰氏阳性菌感染的特征，溃疡创面愈合时间较长，对药物反应敏感等特点。
【专利说明】建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属实验动物模型领域，具体涉及一种建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]随着我国的糖尿病发病率急剧升高，糖尿病溃疡患者的数量也随之增加，在动物整体水平建立真实模拟糖尿病溃疡的疾病模型，是探讨糖尿病溃疡发病机制及临床前药效学评价等医学研究的必要条件，具有十分重要的科学意义和临床意义。
[0003]目前糖尿病足溃疡动物模型多为诱发性动物模型。文献研究结果显示，现有糖尿病足溃疡的动物模型多模拟单一发病因素(如外周动脉病变，神经病变或感染)，同时动物模型与实际模拟相似程度与研究目的存在较大的差距，而实际上二种以上因素的复合致病在临床上更为普遍。因此，多因素复合的糖尿病足溃疡动物模型更能模拟临床实际的发病情况。
[0004]因此，根据临床实际的发病特征及病理改变建立模拟程度较高的动物模型对于糖尿病溃疡的发病机制的研究及相关的手术，药物等干预的疗效评价具有重要的实际意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题之一是提供一种可重复性高，稳定，疾病模拟程度高，便于评价的金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验动物模型的建立方法。
[0006]本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的试剂盒。
[0007]本发明要解决的技术问题之三是提供一种上述试剂盒在建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型中的应用。
[0008]在本发明的一方面，提供一种建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的方法，包括下述步骤:大鼠经高脂饲料喂养8周后，注射链脲佐菌素，制成糖尿病模型，稳定后在大鼠皮肤上制成深II度烫伤，三天后，每个溃疡处皮下注射菌株为金黄色葡萄球菌混悬液。
[0009]作为优选的技术方案，所述金黄色葡萄球菌混悬液包括金黄色葡萄球菌-ATCC25923和稀释液，该金黄色葡萄球菌混悬液的浓度为I X IO8Ufc.ml—1，该稀释液为PBS 液。
[0010]作为优选的技术方案，所述注射金黄色葡萄球菌混悬液感染后24小时候去创面做病原微生物及药敏检测， 用于确定细菌定植情况。
[0011]作为优选的技术方案，所述注射链脲佐菌素具体为:1.5%链脲佐菌素溶解于PH值4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在大鼠左下腹注射。
[0012]作为优选的技术方案，所述高脂饲料包含以下重量百分比的组分:基础饲料73 %，猪油20 %，奶粉2 %，胆固醇I %，蔗糖4%;所述基础饲料由以下重量百分比的组分组成:大麦15%，小麦31%，玉米15%，麸皮15%,鱼粉6%，豆柏、油和盐共18%。
[0013]在本发明的另一方面，提供一种用于建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的试剂盒，该试剂盒包括金黄色葡萄球菌混悬液。
[0014]作为优选的技术方案，所述金黄色葡萄球菌混悬液包括金黄色葡萄球菌-ATCC25923和稀释液，该金黄色葡萄球菌混悬液的浓度为I X IO8Ufc.ml—1，该稀释液为PBS 液。
[0015]作为优选的技术方案，所述试剂盒还包括1.5%链脲佐菌素，PH值4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，注射器，无菌拭子，无菌手套，安尔碘液。
[0016]在本发明的另一方面，还提供上述试剂盒在建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型中的应用。
[0017]本发明实验动物模型属于复合制备糖尿病足溃疡大鼠模型，模型制备分为三个阶段，各有其具体的制备方法及评价方法，具体分为糖尿病模型制备阶段，溃疡模型制备阶段，复合感染模型制备阶段。
[0018]本发明的糖尿病溃疡实验动物模型通过对药物干预后生化指标的变化的检测，结果表明，本模型具有2性糖尿病足慢性溃疡的特征，金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡创面愈合时间较普通溃疡的愈合时间更长，对药物反应敏感等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明实施例1中糖尿病足溃疡大鼠动物模型制作方法流程图。
[0020]图2是本发明实施例1中大鼠烫伤后的病理切片HE染色示意图。
【具体实施方式】
[0021]本发明的模型制备及验证通过下述实验证实:
[0022]实施例1
[0023]运用高脂饲料配合链脲佐菌素诱导的大鼠2型糖尿病，使用烫伤仪制成深II度烫伤诱导皮肤溃疡，采用皮下注射质控菌金黄色葡萄球菌-ATCC25923 (Staphylococcusaureus)株制成糖尿病足溃瘍感染大鼠模型。
[0024]I材料和方法
[0025]1.1动物:SD雄性大鼠，SPF级，体重(180±10)g，由上海中医药大学实验动物中心提供。
[0026]1.2主要试剂及药物:链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ),购自Alexis公司；高脂饲料(成份:基础饲料73 %，猪油20 %，奶粉2 %，胆固醇I %，蔗糖4 % ;其中基础饲料配方:大麦15%，小麦31%，玉米15%，麸皮15%，鱼粉6%，豆柏、油和盐共18%，该基础饲料购自中国人民解放军海军医学研究所)，高脂饲料的制备方法为:首先，将大麦15%，小麦31%，玉米15%，麸皮15%，鱼粉6%按比例搅拌混合均匀后，加入豆柏、油、盐混匀后加压成型制成基础饲料，然后，将基础饲料73 %，猪油20 %，奶粉2 %，胆固醇I %，蔗糖4%按比例搅拌混合均匀后加压成型制成高脂饲料，成品为圆柱块状；质控菌株金黄色葡萄球菌-ATCC25923 (Staphylococcus aureus)，由曙光医院病原微生物室提供，原始来源:购自美国模式培养物集存库(American type culture collection),间接来源为:上海市疾病预防控制中心国际实验工作站；外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子(商品名:贝复济，Recombinant Bovine Basic Fibroblast Growth Factor For External Use,rb_bFGF),珠海亿胜生物制药有限公司，国药准字S10980077。安尔碘液(遗弃菌液灭活使用)；lml注射器，无菌拭子，无菌手套。
[0027]1.3主要仪器:烫伤仪SQL-5Q烫伤仪，上海欣软信息科技有限公司。
[0028]1.4方法:60只大鼠随机分为正常溃疡组(N)(12只)，糖尿病对照组(DM) (12只)，糖尿病溃疡组(DU) (12只)，金葡菌对照组(SD-C) (12只)，金葡菌治疗组(SD-T) (12只)。正常溃疡组普通饲料喂养；糖尿病对照组及金葡菌对照组、金葡菌治疗组高脂饲料饲养8周，空腹24小时后，腹腔注射1.5%STZ35mg.kg_S 3天后尾静脉取血测量血糖>16.7mmol.?Λ制成糖尿病模型；模型组血糖>16.7mmol -L-1 一周后；正常溃疡组(N)，糖尿病溃疡组(DU)，金葡菌对照组(SD-C)，金葡菌治疗组(SD-T) 3%戊巴比妥钠2ml.Kg—1剂量腹腔注射麻醉下烫伤仪烫伤(9.8N，90°C，10S)，三天后，糖尿病溃疡组(DU)，金葡菌对照组(SD-C)，金葡菌治疗组(SD-T)分别溃疡部位注射0.1ml的PBS液，0.1ml的PBS液，IO8Ufc.ml-1金黄色葡萄球菌。48小时后各组无菌拭子取溃疡面分泌物做病原微生物培养及药敏检验，取皮肤组织10%甲醛固定后备检。流程图见图1。
[0029]如图1所示，糖尿病足实验动物模型的制备及评价方法如下，具体分为3个试验阶段:
[0030]①糖尿病模型制备阶段
[0031]方法:高脂饲料喂养8周后，1.5%链脲佐菌素溶解于PH值4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按35mg/kg的剂量左下腹注射。
[0032]结果:注射24小时后血糖大于16.7mml/L,稳定3天后检测血糖仍大于16.7mml/L，糖尿病模型成功，稳定2周后，进入下一阶段实验。
[0033]②糖尿病溃疡模型制备阶段
[0034]方法:使用SQL-5Q烫伤仪，温度90°C，接触时间10S，压力9.8N,面积4cm2，麻醉后于后背部皮肤进行烫伤。
[0035]结果:观察记录烫伤处皮肤变化。烫伤后24h后取交界区皮肤做病理切片，HE染色观察达到深度II烫伤，如图2所示，糖尿病对照组(DM)皮肤组织，表皮存在，可见大量皮肤附属器，正常溃疡组(N)，糖尿病对照组(DM)，糖尿病溃疡组(DU)，金葡菌对照组(SD-C)，金葡菌治疗组(SD-T)皮肤组织破坏达真皮层，毛囊，汗腺等皮肤附件破坏，炎症细胞浸润，符合深II度烫伤。稳定48小时后进入下一阶段实验。
[0036]③复合感染模型(湿性糖尿病足模型)制备阶段
[0037]方法:选用微生物检测质控菌种，金黄色葡萄球菌-ATCC25923，菌悬液浓度:
IX IO8Ufc/ml 0操作方法:细菌悬液10倍梯度稀释后计数使用分光光度计，OD值600，析光度为I，即为l*108ufc/ml。每个创面皮下注射剂量0.1ml0
[0038]结果:注射后48小时取脓培养检测:使用Phoenix-100-BD，做细菌鉴定及药敏。24小时后开放创面，进行药物干预评价。
[0039]实施例2西药-外用重组牛碱件成纤维细胞牛长因子(商品名:贝复济)干预试验结果[0040]1.方法:糖尿病对照组(DM)无处理；正常溃疡组(N)，糖尿病溃疡组(DU)，金葡菌对照组(SD-C)，每天生理盐水换药；金葡菌治疗组(SD-T)，贝复济SOOiu伤口每日换药。测量换药后0d，3d，10d，愈合后创面面积，愈合后3%戊巴比妥钠按2ml -Kg^1剂量腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，离心分离血清，取皮肤组织备检。
[0041]2.数据处理:均采用SPSS16.0进行统计分析，计量资料用J ± s表示，符合正态性
和方差齐性的数据用单因素方差分析，组件采用配对t检验，不符合正态性或方差齐性的数据用非参数检验，以P < 0.05有统计学意义。
[0042]表1各组血清NO治疗后比较6?S? μπιο?/?)
【权利要求】
1.一种建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的方法，其特征是包括下述步骤:大鼠经高脂饲料喂养8周后，注射链脲佐菌素，制成糖尿病模型，稳定后在大鼠皮肤上制成深II度烫伤，三天后，每个溃疡处皮下注射菌株为金黄色葡萄球菌混悬液。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌混悬液包括金黄色葡萄球菌-ATCC25923和稀释液，该金黄色葡萄球菌混悬液的浓度为I X IO8Ufc.ml—1，该稀释液为PBS液。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述注射金黄色葡萄球菌混悬液感染后24小时候去创面做病原微生物及药敏检测,用于确定细菌定植情况。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述注射链脲佐菌素具体为:1.5%链脲佐菌素溶解于PH值4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在大鼠左下腹注射。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高脂饲料包含以下重量百分比的组分:基础饲料73%，猪油20%，奶粉2%，胆固醇1%，蔗糖4% ;所述基础饲料由以下重量百分比的组分组成:大麦15%，小麦31%，玉米15%，麸皮15%，鱼粉6%，豆柏、油和盐共18%。
6.一种用于建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括金黄色葡萄球菌混悬液。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌混悬液包括金黄色葡萄球菌-ATCC25923和稀释液，该金黄色葡萄球菌混悬液的浓度为I X IO8Ufc.ml—1，该稀释液为PBS液。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括1.5%链脲佐菌素，PH值4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，注射器，无菌拭子，无菌手套，安尔碘液。`
9.如权利要求6-8任一项所述的试剂盒在建立金黄色葡萄球菌感染的糖尿病足溃疡大鼠实验模型中的应用。
【文档编号】A01K67/02GK103479680SQ201310424824
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】柳国斌, 韩强 申请人:上海中医药大学附属曙光医院