一种基于膜技术提取蜜环菌丝体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于膜技术提取蜜环菌丝体的方法，该方法是将蜜环发酵液通过微滤膜处理分离得到蜜环菌丝体。本发明改变了传统蜜环分离所用离心方式，采用高效的膜分离技术进行菌丝体分离，减少进入滤液的菌丝体，既能提高菌丝体的收率，降低滤液的COD，降低污水处理量，又不破坏细胞本身，保证胞内有效成分的全部回收，提高产品质量。与传统的工艺相比，本发明具有显着的经济效益、社会效益和环保效益。
【专利说明】 —种基于膜技术提取蜜环菌丝体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种提取真菌发酵菌丝体的方法，更确切地说是一种基于膜技术提取发酵蜜环菌丝体的新方法。
【背景技术】
[0002]蜜环菌粉(Gastrodia Tuder Halimasch Powder)是白蘑科真菌蜜环菌[Armillaria mellea(Vahl.ex.Fr.)Quel.]经深层液体发酵培养,经分离提取精制而成干燥菌粉。蜜环菌是一种药食兼用的真菌，在天然环境下与天麻共生。中国医学科学院药物研究所进行了药理试验，结果证明蜜环菌发酵物与天麻有类似的药理作用。(I)镇静作用:有加强戊巴比妥钠阈下催眠剂量的作用，能延长小鼠的睡眠时间，明显减少小鼠的自由活动；
[2]抗惊厥作用:对中枢神经系统兴奋药戊烯四唑有一定的拮抗作用；(3)增强小鼠耐缺氧力的作用；(4)增强机体免疫功能的作用；(5)其他作用:能降低尼古丁引起的小鼠死亡率，对小鼠全脑缺血有脑保护作用，能增加犬的脑血流量和冠状动脉血流量
[0003]与天然天麻相比，蜜环菌粉具有如下几大特点:1、在化学成分和药理作用上相类似；2、蜜环菌粉毒性低于天然天麻；3、蜜环菌粉价格远远低于天然天麻，且可大量生产。基于上述独特优点，蜜环菌粉被广泛应用于制药、保健品行业。
[0004]传统蜜环分离工艺多采用卧螺离心机进行分离，该方式因受制于离心机分离因子影响，分离过程中菌丝体遭到剪切力破坏，部分有效成分流失到滤液中导致产品质量和收率下降，分离所得滤液较浑浊，里面含有较多的碎菌丝，导致外排滤液COD偏高，该滤液若达到污水排放标准，需要经过复杂的污水处理，污水处理系统工作量太大，给企业带来了严重的经济负担。部分企业为了尽可能回收滤液中的残留菌丝体，对滤液采取浓缩干燥后添加到蜜环菌丝体，由于滤液量大，干燥时间长，不但浪费大量能源，而且对产品质量造成严重影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决上述蜜环分离提取方法的不足，从而设计了一种基于膜技术分离提取蜜环发酵液的绿色新工艺，该工艺既能提高菌丝体的收率，减少进入滤液的菌丝体，降低滤液的C0D，降低污水处理量；又不破坏细胞本身，保证胞内有效成分的全部回收。该发明不但提高了蜜环菌丝体的收率及有效成分，提高了产品质量，增加了经济效益；又降低了废水中C0D，减轻了污水处理系统压力，增加了社会效益。
[0006]本发明的目的主要按照下述步骤实现的:
[0007]—种基于膜技术提取蜜环菌丝体的方法是按照下述工艺步骤进行:
[0008]I)取残糖小于0.5，还原糖低于0.3，发酵液粘度100?150cP的蜜环发酵液通过微滤膜，得到发酵液的微滤透析液和菌丝体，收集得到菌丝体；微滤膜孔径在0.05?I μ m，操作温度为10?70°C，工作压力:进压为2?8bar，出压为O?5bar ；
[0009]2)低温真空烘干:将步骤2)中所得的菌丝体在真空度为-0.065?-0.095Mpa，70?90°C条件下进行干燥，所得干燥物即为蜜环菌丝体。
[0010]该方法优选微滤膜孔径在0.05?0.5 μ m，操作温度为50?60°C，工作压力:进压为2?4bar，出压为I?2bar。微滤膜为陶瓷膜或有机膜，其截留分子量为8000 —IOOOOODao
[0011]所述的干燥时间为30?35小时，得到的干燥物含水量为3?8%。
[0012]该方法所述的发酵液是通过以下方法制备得到的:蜜环菌株活化后制备蜜环种子液，制备好的种子液接种到发酵培养基，接种量5%?8%，发酵培养基组成为葡萄糖2%，黄豆饼粉3%，蔗糖2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.03%，消泡剂0.1%，用水配制，pH值自然，发酵液结束后检测发酵液浓稠，pH值下降至5.0左右，发酵液结束后得到发酵液pH值下降至
4.9?5.1，发酵液残糖小于0.5，还原糖低于0.3。
[0013]本发明所使用的微滤膜可再生，再生用I 一 2%硝酸和I 一 2%液碱，将碱洗水和酸洗水中和得到含有无机盐离子的中性水，该水作为发酵配料用水。
[0014]本发明适用于任何蜜环菌菌种，如已寄存于中国农业微生物菌种保藏管理中心的蜜环菌菌种Armillaria,保藏编号ACCC50063等可自由分让的虫草头孢菌菌种均可以使用。
[0015]本发明为蜜环分离提取提供了一种新的方法。该方法具有以下几个突出的优点:
[0016]1、提高收率:微滤膜孔径0.05 — I μ m，显著提高了菌丝体得率。
[0017]2、提高产品质量:传统卧螺离心机分离过程中蜜环菌丝体遭到剪切力破坏，主要有效成分部分流失到滤液中导致菌丝体有效成分降低，该工艺采用微滤膜过滤，操作过程中不会产生剪切力，可以有效保证菌丝体有效成分；较滤液浓缩干燥回收工艺相比，该工艺得到产品指标稳定、气味色泽均一。
[0018]3、降低滤出液C0D，减轻环保压力:传统卧螺分离由于菌丝体截留率低，部分菌丝体进入滤液,导致滤液中COD含量增高，本方法分离因子高,对菌丝体截留率大大增加，滤液澄清，滤液中菌丝体少，得到的透析液COD大大降低，其COD指标可以达到直接排放标准，仅污水处理每天就为企业减少30吨处理量，大大降低了污水处理费用。
[0019]4、清洁连续生产，能耗低:本发明方法可连续生产，膜及其配套设备使用寿命长，装置维护方便，投资少，操作过程无噪声污染，易清洁。
[0020]总之，本发明采用适宜的蜜环发酵液结合合适孔径的膜材料，可以最大限度的提取发酵液中的蜜环菌丝体，采用膜技术不但提高了产品得率，得率最高达到61g/L，产品品质也有很大提升，其中多糖含量以无水葡萄糖(C6H12O6)计最高达到7.5%，肽含量最高达到
8.1%，较传统方法分别提高了 I和1.7个百分比，依据WS-10001-(HD-1224)-2002标准方法检验；以孔径0.05 μ m膜计算，膜过滤所得菌丝体较之前卧螺离心得率提高llg/L，每天所放罐批次增加蜜环菌丝体500Kg (干料计)以上，分离所得滤液清澈透亮，COD含量大大降低，减轻了环保压力，给企业带来了显著的经济效益、社会效益和环保效益。
【具体实施方式】
[0021]以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0022]实施例1[0023]I)蜜环菌菌株(Armillaria)由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供并鉴定，保藏编号ACCC50063。将菌株常规活化后制备蜜环种子液，接种环取活化的菌株2?3环接种到种子培养基，26?28°C培养7-8天左右，摇床转速120r/min，种子培养基组成葡萄糖3%，酵母粉2%，蛋白胨1.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.03%,消泡剂0.1%，用水配制，pH值自然。制备好的种子液接种到发酵培养基，接种量5%?8%，发酵培养基组成为葡萄糖2%，黄豆饼粉3%，蔗糖2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.03%,消泡剂0.1%，用水配制，pH值自然。发酵液结束后检测发酵液由稠略转稀，PH值下降至5.0左右，镜检部分菌丝开始自溶，萤光减弱，无杂菌污染，发酵液残糖小于0.5，还原糖低于0.3。
[0024]2)微滤过滤:将蜜环菌种发酵后的5000Kg发酵液(蜜环菌丝体折干含量为7.5%)通过微滤过滤，得到蜜环湿菌丝体1154kg(含水量74%)，微滤透析液3846Kg，透析液的透光率为80 %，COD为65mg/L，可以直接排放。微滤过滤所用的膜材料是孔径为50nm的陶瓷膜，具体工艺条件是:操作温度为50 - 60°C，进压为3.0bar,出压为1.0bar，压力差为2.0bar。微滤膜再生:用浓度为1%硝酸水溶液和1%氢氧化钠水溶液冲洗微滤膜，酸碱洗水中和后打入发酵配料罐，再添加相应培养基及少量无机盐作为发酵培养基。
[0025]3)低温干燥:将步骤2得到的1154kg蜜环湿菌丝体进入双锥干燥器进行烘干，得到304.5kg水分含量1.48%的蜜环菌丝体，该菌丝体多糖7.5%，肽含量8.1%，依据WS-10001-(HD-1224)-2002标准方法检验。具体工艺条件是:干燥温度75_85°C，真空度为-0.085Mpa，干燥时间31h。
[0026]实施例2
[0027]I)微滤过滤:将按照实施例1方法制备得到的蜜环菌种发酵后的5000Kg发酵液(蜜环菌丝体折干含量为7.5%)通过微滤过滤，得到蜜环湿菌丝体1130kg (含水量75%)，微滤透析液3870Kg，透析液的透光率为80%，COD为65mg/L，可以直接排放。微滤过滤所用的膜材料是孔径为IOOnm的陶瓷膜，具体工艺条件是:操作温度为50 — 60°C，进压为4.0bar,出压为2.0bar,压力差为2.0bar。微滤膜再生:用浓度为1%硝酸水溶液和1%氢氧化钠水溶液冲洗微滤膜，酸碱洗水中和后打入发酵配料罐，再添加相应培养基及少量无机盐作为发酵培养基。
[0028]2)低温干燥:将步骤2得到的1130kg蜜环湿菌丝体进入双锥干燥器进行烘干，得到288.5kg水分含量2.1%的蜜环菌丝体，该菌丝体多糖7.3%，肽含量7.9%，依据WS-10001- (HD-1224) -2002标准方法检验。具体工艺条件是:干燥温度85?90°C，真空度为-0.075Mpa，干燥时间30h。
[0029]实施例3
[0030]I)微滤过滤:将按照实施例1方法制备得到的蜜环菌种发酵后的5000Kg发酵液(蜜环菌丝体折干含量为7.5%)通过微滤过滤，得到蜜环湿菌丝体1169kg (含水量74%)，微滤透析液3831Kg，透析液的透光率为80%，COD为65mg/L，可以直接排放。微滤过滤所用的膜材料是孔径为50nm的陶瓷膜，具体工艺条件是:操作温度为30 — 40°C，进压为8.0bar,出压为3.0bar，压力差为5.0bar。微滤膜再生:用浓度为1%硝酸水溶液和1%氢氧化钠水溶液冲洗微滤膜，酸碱洗水中和后打入发酵配料罐，再添加相应培养基及少量无机盐作为发酵培养基。
[0031]2)低温干燥:将步骤2得到的1169kg蜜环湿菌丝体进入双锥干燥器进行烘干，得到308kg水分含量1.9%的蜜环菌丝体，该菌丝体多糖7.2%，甘露醇含量7.8%，依据WS-10001- (HD-1224)-2002标准方法检验。具体工艺条件是:干燥温度75?80°C，真空度为-0.085Mpa，干燥时间32.5h。
【权利要求】
1.一种基于膜技术提取蜜环菌丝体的方法，其特征是该方法包括下述步骤: 1)取残糖小于0.5，还原糖低于0.3，发酵液粘度100?150CP的蜜环发酵液通过微滤膜，得到发酵液的微滤透析液和菌丝体，收集得到菌丝体；微滤膜孔径在0.05?I μ m，操作温度为10?70°C,工作压力:进压为2?8bar,出压为O?5bar ； 2)低温真空烘干:将步骤2)中所得的菌丝体在真空度为-0.065?-0.095Mpa, 70?90 V条件下进行干燥，所得干燥物即为蜜环菌丝体。
2.根据权利要求1所述的基于膜技术提取蜜环的方法，其特征是该方法所述的微滤膜孔径在0.05?0.5 μ m，操作温度为50?60°C，工作压力:进压为2?4bar，出压为I?2bar。
3.根据权利要求1所述的基于膜技术提取蜜环的方法，其特征是该方法所述的步骤I中的微滤膜为陶瓷膜或有机膜。
4.根据权利要求1所述的基于膜技术提取蜜环的方法，其特征是所述的干燥时间为30?35小时，得到的干燥物含水量为I?3%。
5.根据权利要求1所述的基于膜技术提取蜜环的方法，其特征是该方法所述的发酵液是通过以下方法制备得到的:蜜环菌株活化后制备蜜环种子液，制备好的种子液接种到发酵培养基，接种量5%?8%，发酵培养基组成为葡萄糖2%，黄豆饼粉3%，蔗糖2%，磷酸二氢钾.0.1%，硫酸镁0.03%，消泡剂0.1%，用水配制，pH值自然，发酵液结束后检测发酵液由稠略转稀，PH值下降至5.0左右，发酵结束后得到发酵液pH值下降至4.9?5.1，发酵液残糖小于.0.5，还原糖低于0.3。
【文档编号】A01G1/04GK103504287SQ201310441259
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】袁兵兵, 王英燕, 张瑞华 申请人:江苏神华药业有限公司