一种生防菌株bs102及其在防治植物灰霉病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生防菌株BS102及其在防治植物灰霉病中的应用，所述的生防菌株BS102为枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）BS102，保藏编号为CGMCC?No.7728。所述的应用包括：制备含所述生防菌株BS102的生防菌剂；将所述的生防菌剂喷施在所述的植物上。本发明的生防菌株对灰葡萄孢的拮抗作用强烈，可用于灰霉病的防治。且本发明提供了灰霉病的生物防治方法，不使用化学农药，具有无毒、不易产生抗药性、环境和生物安全等优点，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种生防菌株BS102及其在防治植物灰霉病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于作物病害防控【技术领域】，尤其涉及一种生防菌株BS102及其在防治植物灰霉病中的应用。
【背景技术】
[0002]灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.:Fr.)可以对储存期的梨果造成危害。侵染初期果实表面产生圆形或近圆形水溃状病斑，不凹陷，逐渐扩大后形成浅黄褐色不规则形软腐病斑。后期病部失水，表皮逐渐皱缩凹陷，以至全果软腐皱缩。潮湿条件下，病斑表面可产生疏松的灰白色棉毛状物，后期棉毛状物上产生鼠灰色霉粉，有时还可产生不规则形黑色颗粒。虽然储存期梨上的灰霉病不是梨生产上的主要病害，但由于采收成熟度和采收方法的不当，可造成机械损伤，这些伤口可以作为病原菌的通道。据联合国粮农组织调查报告显示，采收过程中不当的机械损伤可使果蔬损失达8~12%。此外，目前我国水果采集技术和产后水果的储存条件都非常有限，而且对产后病害的防控比较薄弱。因此，储存期梨果上的灰霉病仍能造成严重经济损失。
[0003]在农业生产中，使用化学药剂是防治多种经济作物灰霉病的主要措施，常见药剂有多菌灵、扑海因、嘧霉胺等。但由于产后水果病害的防控是病害控制的最后一道防线，目前可使用的杀菌剂非常有限。此外，灰葡萄孢产孢量大，生长周期短，很容易对杀菌剂产生抗药性，已有研究发现，我国灰霉病菌已对多种杀菌剂如多菌灵、扑海因等产生严重抗药性问题。因此，对于灰霉病的防控，我们急需寻找更为有效的防治方法。此外，由于化学杀菌剂具有广谱性，其大量使用不仅容易破坏微生态环境，而且还导致非靶标抗性。
[0004]在非化学性防治措施中，生物防治为最有前途的方法之一，其具有环境友好、无农残、防效较好等优点。目前虽已有一些灰葡萄孢拮抗微生物的报道，如藤黄灰链霉素(Sti^ptomyces luteogriseus) EC000001 (专利 CN200610048662.1)、粉红粘帚菌(Bionectria ochroleuca) WY-1 (专利 CN200910072862.4)等，但尚未出现对芽孢杆菌的报道。另外，国内已有利用拮抗细菌生物防治由引起的番茄和百合的灰霉病(如和CN200710014340)，但防效较差，且缺乏其他作物灰霉病生防菌株的研究报道。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种生防菌株BS102，对灰葡萄孢菌菌丝生长、孢子萌发有较好的抑制作用，对植物灰霉病尤其是梨灰霉病具有较好的防治效果。
[0006]本发明提供了一种生防菌株BS102，分类命名枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，完整命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS102，已于2013年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCC N0.7728。
[0007]该菌株BS102在LB培养基上菌落表面粗糙、不透明，呈现皱缩、白色，能够形成芽抱，能移动，需氧型。
[0008]本发明还提供了所述生防菌株BS102在防治植物灰霉病中的应用。[0009]所述的植物具体可以为梨。
[0010]梨的品种可以为皇冠。
[0011]所述应用具体包括:
[0012](I)制备含所述生防菌株BS102的生防菌剂；
[0013](2)将所述的生防菌剂喷施在所述的植物上。
[0014]喷施生防菌剂时，喷施至植物表面水珠流动即可。
[0015]如对梨灰霉病进行防治时，可在储藏期将所述的生防菌剂喷施在梨果实上，喷施至梨果实表面水珠流动即可，喷施结束后可将梨果实20~25°C保湿20~24h。
[0016]为达到较好的防治效果，所述的生防菌剂中，所述生防菌株BS102的浓度优选为I X IO8 ~10lclCFU/mL，更优选为 I X 108CFU/mL。
[0017]所述生防菌剂可通过如下方法进行制备:
[0018](I)将所述生防菌株BS102于培养基中培养至OD6tltl为0.5~0.8，获得种子液；
[0019](2)将种子液接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵液中生防菌株BS102的浓度至I X IO8~101(lCFU/mL，获得所述生防菌剂。
[0020]所述的培养基可选用LB液体培养基。
[0021]其中，所述种子液的接种量优选为I~2% (v/v)，优选为1% (v/v)0
[0022]以每升计，所述发酵培养液的配方为:葡萄糖，18~22g ；L-谷氨酸，2.4~2.6g ;L-天门冬酰胺，2.4 ~2.6g ;ΚΗ2Ρ04，0.8 ~1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ;KC1，0.4 ~0.6g ；酵母粉，0.8 ~1.2g ;L-苯丙氨酸，2 ~3X 10_3g ；MnS04.H2O, 5 ~6X IO^3g ；CuSO4.5H20,
0.16 ~0.18X10、；FeS04.7Η20，0.15 ~0.17 X l(T3g ;调节 pH 值为 7.0。
[0023]作为进一步优选，以每升计，所述发酵培养基液的配方为:葡萄糖，20g;L-谷氨酸，2.5g ;L-天门冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ；L-苯丙氨酸，2Xl(T3g ；MnSO4.H20，5Xl(T3g ；CuSO4.5Η20，0.16X10、；FeS04.7H20,0.15X10、；调节pH值为7.0。该发酵培养液由Landy培养基改良而来，更有利于本发明所述枯草芽孢杆菌的增殖。
[0024]本发明中，所述扩大培养是发酵罐中进行的，所述扩大培养的温度为28~30°C，优选为30°C，所述扩大培养的时间为20~24h。在该培养条件下，在保证菌活力的同时使其具有较快的增殖速度。
[0025]扩大培养过程中，发酵液pH值维持在7.0,溶氧量20%，通气量5_7m3/小时，转速240~260r/min，罐压0.05-0.1KPa0发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度为IXlO8 ~1010CFU/mL。
[0026]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0027](I)本发明的生防菌株BS102为枯草芽孢杆菌，生防菌BS102菌体和上清在平板拮抗试验中显示对灰葡萄孢菌菌丝生长、孢子萌发有较好的抑制作用，可将其应用于植物灰霉病的生物防治。
[0028](2)光照培养箱进行的梨果实灰霉病防治试验效果显示，本发明的生防菌株BS102能有效抑制病菌在梨果实表面的病斑扩展，防效高达90%，在贮藏条件下，本发明的生防菌株BS102对梨灰霉病的防效仍可达到68%以上，防治效果好，因此可利用该生防菌株BS102防治梨灰霉病。[0029](3)本发明生防菌株BS102应用于植物灰霉病的防治，可完全克服因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于农产品的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于提高产品质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为生防菌BS102的菌落形态图。
[0031]图2为生防菌BS102平板拮抗灰葡萄孢菌菌丝生长。
[0032]图3为生防菌BS102无菌上清抑制灰葡萄孢菌菌丝生长。
[0033]图4为生防菌BS102无菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌发。
[0034]图5为BS102生防菌剂光照培养箱防治皇冠灰霉病效果。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0036]实施例1 BS102生防菌株的采集、分离和鉴定
[0037]BS102菌株分离自江苏省海安县小麦麦穗上。取小麦麦穗磨碎，80°C水浴10分钟后涂布于LB平板上；次日挑取菌落进行纯化培养。
[0038]菌株BS102在LB培养基上菌落表面粗糙、不透明，呈现皱缩、白色(见图1 )，能够形成芽抱，能移动，需氧型。
[0039]提取该菌株的DNA，扩增16S rDNA序列，进行测序，该菌株的16S rDNA如SEQ IDN0.1所示,序列在NCBI中的比对结果显示与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性`最闻。
[0040]该菌株已保存在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年6月18日，保藏编号为=CGMCCN0.7728。
[0041]实施例2生防菌剂的制备
[0042]1、生防菌剂的制备
[0043](I)将生防菌株BS102接种到LB培养液中，30°C，180r/min振荡培养，12~16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，OD测定过程中以未接菌的培养液来调零；
[0044](2)当振荡培养至菌液的OD值为0.5~0.8之间时即为种子菌液，将种子菌液以体积比为1:100加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，30°C 250r/min振荡培养20~24小时，发酵液PH值维持在7.0，溶氧量为20%，通气量5-7m3/小时，罐压为0.05-0.1KPa0发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度约为I X 109cfu/ml。
[0045]发酵培养液的配方(每升)为:葡萄糖，20g ;L_谷氨酸，2.5g ;L_天门冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2X 10_3g ；MnSO4.H2O,5X 10_3g ；CuSO4.5Η20，0.16X 10_3g ；FeS04.7Η20，0.15X10、；调节 pH 值为 7.0。
[0046]实施例3 BS102生防菌株对灰葡萄孢菌的拮抗活性测定
[0047]1、BS102对灰葡萄孢菌平板拮抗活性测定
[0048](I)试验方法[0049]采用对峙培养法，将保存于4°C中的灰葡萄孢菌GZ22 (模式菌)接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为6_的圆形菌块。将菌丝块接种在WA平板(WA培养基/L:蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，pH=7.0)的中心，在其四周距中心约25mm处分别接种BS102，试验以枯草芽孢杆菌模式菌株PY79、清水和0.3μ g/ml环酰菌胺为对照组。25°C培养，待菌丝接近长满平板时测量抑菌圈的大小(从细菌菌落中心算起)。
[0050]根据抑菌圈的大小对BS102的拮抗灰葡萄孢菌活性进行评估:0mm无抑制作用；< 2mm有轻微的抑制作用；2-5mm中等抑制作用；> 5mm较强的抑制作用。
[0051]抑制率根据以下公式进行计算:
[0052]抑制率=100 (R「R2) /R1, R1为对照病原菌在清水方向上的菌落半径；R2为病原菌在细菌方向的菌落半径。
[0053](2)结果分析
[0054]如图2所示，平板拮抗试验表明:生防菌BS102对灰葡萄孢菌菌丝生长具有较强的抑制效果，抑制圈半径为15.0mm,菌丝抑制率为71.4%，而阴性对照PY79、清水和环酰菌胺处理组无拮抗效果。
[0055]2、生防菌BS102无菌上清抑制灰葡萄孢菌菌丝活性测定
[0056](I)试验方法
[0057]取实施例2的生防菌BS102菌株发酵液，10，000r/min,离心IOmin后取上清。上清经细菌滤器(0.22 μ m)过滤后待用。
[0058]向50°C WA培养基中加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子，至孢子终浓度为IO5个/ml。将含灰葡萄孢菌GZ22孢子的WA培养基倒入9cm直径的平板中，每平板倒入20mL。待冷却凝固后，用7mm直径的打孔器在平板的对称位置打3个孔，每孔分别加入25 μ L制备的无菌上清，以培养液和环酰菌胺为对照组。25°C静止培养后观察拮抗圈大小(从孔中心算起)。
[0059](2)结果分析
[0060]生防菌BS102无菌上清能有有效抑制菌丝生长，抑制圈半径为10.4mm，3倍浓缩无菌上清的抑菌圈半径为12.5mm，见图3。
[0061]3、生防菌BS102无菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌发活性测定
[0062]( I)试验方法
[0063]取实施例2的生防菌BS102菌株发酵液，10，000r/min,离心IOmin后取上清。上清经细菌滤器(0.22 μ m)过滤后待用。
[0064]在上述无菌上清中加入果糖，使果糖终浓度至10mM，加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子。对照组为含IOmM果糖的培养液。取置于果糖溶液中的孢子悬浮液10 μ I置于载玻片上，每处理5次重复。玻片置于保湿盒中，25°C静止培养，每个I小时观察各处理组孢子萌发情况，计算萌发率。
[0065](2)结果分析
[0066]生防菌BS102无菌上清能强烈抑制灰葡萄孢菌孢子的萌发，处理后的孢子不能形成芽管(图4)。诱导萌发后，8、16、24小时分别统计各处理组的萌发率，结果显示当阴性对照组萌发率为100%时，BS102处理组孢子仍无萌发。统计结果见表1。
[0067]表1各处理组灰葡萄孢菌孢子萌发率
【权利要求】
1.一种生防菌株BS102，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS102，保藏编号为 CGMCC N0.7728。
2.如权利要求1所述的生防菌株BS102在防治植物灰霉病中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物为梨。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述梨的品种为皇冠。
5.如权利要求2~4任一项所述的应用，其特征在于，所述的应用包括: (1)制备含所述生防菌株BS102的生防菌剂； (2)将所述的生防菌剂喷施在所述的植物上。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的生防菌剂中，所述生防菌株BS102的浓度为 IXlO8 ~ 1010CFU/mL。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生防菌剂可通过如下方法进行制备: (1)将所述生防菌株BS102于培养基中培养至OD_为0.5~0.8，获得种子液； (2)将种子液接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵液中生防菌株BS102的浓度至I X IO8~101QCFU/mL，获得所述生防菌剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述种子液的接种量为I~2%。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以每升计，所述发酵培养液的配方为:葡萄糖，18~22g ;L-谷氨酸，2.4~2.6g ；L-天门冬酰胺，2.4~2.6g ；KH2PO4,0.8~1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ；KC1,0.4 ~0.6g ;酵母粉，0.8 ~1.2g ；L-苯丙氨酸，2 ~3 X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 ~6 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 ~0.18 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 ~0.17 X 10_3go
【文档编号】A01N63/02GK103571777SQ201310493822
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】陈云, 尹燕妮, 马忠华 申请人:浙江大学