黄山贡菊茎尖组织培养的方法
【专利摘要】本发明涉及一种黄山贡菊茎尖组织培养的方法，包括以下步骤：培养基的配制，外植体的选取与消毒、茎尖剥离、茎尖诱导培养、继代增殖培养、生根诱导培养、组培苗驯化与栽培。基本培养基选用MS培养基，0.4～0.6%的琼脂，3%的蔗糖，PH值为5.6～5.8，温度25℃±2；茎尖启动诱导培养基为MS+6-BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L；不定芽继代增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.01～0.1mg/L；试管内生根培养基为2/1MS+NAA0.5～1.5mg/L；试管外生根基质为蛭石和珍珠岩等量混合而成。本发明的优点：建立黄山贡菊组织培养快繁技术体系，试管黄山贡菊不带病，质量好，试管黄山贡菊培养条件可控，可周年工厂化生产，种苗繁殖速度快，周期短，繁殖系数高；健壮均匀，移栽成活率高，可达90%以上，适合规模化生产。
【专利说明】黄山贡菊莖尖组织培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及黄山贡菊茎尖组织培养的方法，具体来说是利用组织培养技术来繁殖黄山贡菊的方法。
【背景技术】
[0002]黄山贡菊iPendranthema morifolium PamatO，属于菊科多年生草本植物，分布在黄山周围的一些地区，茎嫩绿色，直立单株，单叶互生，卵圆至披针形，浅裂，头状花顶上，花色多样，花蒂嫩绿，质柔软，气味清香，均匀不散朵。是具有地方特色名贵中药材，在中医临床治疗上有疏风清热的功效，可用于内热感冒、头昏目眩等诸多症，，对动脉硬化、血压偏高及动脉硬化等症也有显著功效，不仅可以药用而且可以作为高级饮料佳品，可以泡茶、泡酒，常饮者不仅可以排除体内的毒素，有美容的功效闻名中外，是全国四大名菊之一，深受国内外广大客户的青睐。
[0003]黄山贡菊由于长期利用无性繁殖方式进行育苗，不仅质量差，速度慢，而且会使贡菊苗木体内的病毒数量日益增多，导致其发生严重病虫害，生产中大量使用农药防治，污染严重，农药的残留量大，造成商品品质和产量都大幅度降低，严重影响到了黄山贡菊的经济价值和产业发展。因此，通过组组织培养的方法快速繁殖黄山贡菊，可以将植物体内的一些病毒消除，提高黄山贡菊的质量和产量。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对黄山贡菊长期利用无性繁殖的方式进行繁殖，导致贡菊苗木带病和种性退化问题，提供一种组织培养快速繁殖黄山贡菊的方法，提高黄山贡菊的品质和产量，用这种方法培养的贡菊生根率达95%以，成活率在95%以上，从而实现了本发明目的。
[0005]本发明黄山贡菊茎尖组织培养的方法，包括以下步骤:
(1)外植体的消毒处理:剪取生长健壮无病虫害的黄山贡菊顶芽作为组织培养外植体，放入加少许洗衣粉的溶液浸泡10 min，用自来水冲洗Ih左右，在超净工作台上用70%的酒精中浸没15 S，用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加两滴吐温灭菌4 min，最后用无菌水冲洗4~5遍备用。
[0006](2)茎尖诱导分化:将消毒过的黄山贡菊顶芽，用镊子和解剖刀剥去嫩叶，露出生长锥，用刀尖切下0.3~0.5mm的生长点，并带2~3对叶原基，立即接种到启动培养基中，所术启动培养基以MS基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)1.0~2.0mg/L、奈乙酸(NAA)
0.1~0.5mg/L、0.4~0.6%的琼脂，3%的蔗糖，PH值为5.6~5.8，温度25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX，直至萌发形成黄山贡菊小芽。
[0007](3)继代增殖:将茎尖诱导的再生小植株转接到增殖培养基中进行继代增殖培养，所术增殖培养基为MS基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)1.0~3.0mg/L、奈乙酸(NAA)0.01~0.1mg/L、0.4~0.6%的琼脂，3%的蔗糖，PH值为5.6~5.8，温度25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX进行不定芽的增殖。
[0008](4)试管内生根:当步骤(3)的芽高长到瓶口时，将苗剪成茎段接种到生根培养基中，所述的培养基为1/2MS基本培养基，添加奈乙酸(NAA)0.5~1.5mg/L、0.4~0.6%的琼月旨，3%的蔗糖，PH值为5.6~5.8。在温度为25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX培养至正常生根。
[0009](5)试管外炼苗:当步骤(4)的生根试管苗长至4~5cm时，在自然光炼苗3~4天，洗净根部培养基，移至蛭石、珍珠岩和泥碳土等量混合而成的基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养。
[0010](6)试管外生根:当步骤(3)的芽高长到瓶口时，将其剪成茎段，用生根粉处理后，扦插到蛭石和珍珠岩等量混合而成的基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养，10 d左右开始生根，成活率达90%以上。
[0011]步骤(1)在外植体消毒处理中，用70%的酒精中浸没15 S，添加两滴吐温(表面活性剂)，提高杀菌的效果，提高黄山贡菊茎尖成活率5~10百分点。
[0012]步骤(2)芽诱导培养中，15~20 d能在外植体上形成不定芽。
[0013]步骤(3)中的一个继代周期为25~30d，每个继代增殖周期后的增殖倍数为10~20倍，继代10代后仍能保持增殖率。
[0014]步骤(4)所述的茎段为2~3cm，培养的时间一般是15~20 d，每株苗有根数5~15条，在1/2MS基本培养基中添加奈乙酸生根快、生根整齐且粗壮，不添加奈乙酸生根快慢不一且细弱。
[0015]步骤(5)中移栽7~15 d即可移至大田栽培。
[0016]步骤(6)所述莖段4~5cm,用0.5~0.8g/L的生根粉速蘸5 s,基质在扦插之前用0.3%~0.5%高锰酸钾消毒，培养20~25 d即可移至大田栽培，每株苗有根数10~15条，和试管内长出根的数量、质量相当。试管外生根由于减少了一个无菌操作步骤，因而可降低成本。
[0017]本发明通过组织培养进行试管黄山贡菊的繁殖，具有以下优点:
1，繁殖系数高，繁殖周期短，且整个繁殖均在人工控制的条件下进行，不受外界环境的影响，可以周年进行生产，一年可可繁殖7~9代，而黄山贡菊常规生产用苗一年只可繁殖I~2代。本发明极大提高了黄山贡菊繁殖速度，有利于优新黄山贡菊品种的推广应用。
[0018]2，试管黄山贡菊苗不带病，解决了黄山贡菊常规用苗易带病的问题，通过茎尖组织快繁脱去黄山贡菊苗各种病毒，恢复贡菊的优良品质，提高产量。田间生长抗病能力强，表现为叶色浓绿，茎杆粗壮，生长势强，开花时间比常规苗提前10天左右、且花朵大、层次多，色泽洁白，整株无病虫害、无枯叶。经测算，预计干花亩产达到90kg，比常规苗增产40%左右，各项指标均优于常规苗。
[0019]综上所述，本发明为黄山贡菊产业的发展，为满足优质种苗市场的需要，提供了一种快速、方便、有效的繁殖方法。
[0020]3、黄山贡菊现有的育苗方式是农户各自用扦插、分株等无性繁殖方式，速度慢，苗木质量标准不能统一，不能满足生产需求，本发明可以进行黄山贡菊的规模化、工厂化育苗，为市场提供规格整齐一致的优质种苗。
[0021]4、生产中黄山贡菊长期利用无性繁殖方式进行育苗，会使贡菊苗木体内的病毒数量日益增多，导致其发生严重病虫害，生产中大量使用农药防治，污染严重，且农药的残留量大，造成商品品质和产量都大幅度降低，严重影响到了黄山贡菊的产业发展。本发明用黄山贡菊茎尖组织培养生产出脱毒的黄山贡菊种苗，解决了品质退化问题。
【具体实施方式】
[0022]以下的实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0023]实施例1:
在生长季节选取生长健壮无病虫害的黄山贡菊顶芽，放入加少许洗衣粉的溶液浸泡10min,用自来水冲洗Ih左右，在超净工作台上用70%的酒精中浸没15 S，用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加两滴吐温灭菌4min，最后用无菌水冲洗4~5遍。将消毒过的黄山贡菊顶芽，用镊子和解剖刀剥去嫩叶，露出生长锥，用刀尖切下0.5mm的生长点，接种到诱导培养基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)，PH值为5.8，温度25V ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX，进行培养至长出小芽，25天后将诱导出贡菊小芽，转接到增殖培养基中(MS+ 6-BA3.0mg/L+NAA0.01mg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)PH值为5.8，温度25°C ±2，每天光照12h，光照强度为2000~3000LX进行不定芽的增殖，25d为I个继代增殖周期，I个继代增殖周期后的增殖倍数为10倍。当芽高长到6~8cm时，将苗剪成2~3cm茎段接种到生根培养基中(l/2MS+NAAlmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)，PH值为5.8，在温度为25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX培养至正常生根。培养15 d生根时生根率为95%以上，每株苗有根数5~10条。当生根试管苗长至4~5cm时，在自然光炼苗3~4 d，洗净根部培养基，移至蛭石、珍珠岩和泥碳土等量混合而成的基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养，成活率达90%以上，移栽后15 d即可移至大田栽培。
[0024]实施例2:
在生长季节选取生长健壮无病虫害的黄山贡菊顶芽，放入加少许洗衣粉的溶液浸泡10min,用自来水冲洗Ih左右，在超净工作台上用70%的酒精中浸没15 S，用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加两滴吐温灭菌4min，最后用无菌水冲洗4~5遍。将消毒过的黄山贡菊顶芽，用镊子和解剖刀剥去嫩叶，露出生长锥，用刀尖切下0.5mm的生长点，接种到诱导培养基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)，PH值为5.8，温度25V ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX，进行培养至长出小芽，25天后将诱导出贡菊小芽，转接到增殖培养基中(MS+ 6-BA2.0mg/L+NAA0.0 lmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)PH值为5.8，温度25°C ±2，每天光照12h，光照强度为2000~3000LX进行不定芽的增殖，25d为I个继代增殖周期，I个继代增殖周期后的增殖倍数为8倍。当芽高长到6~8cm时，将苗剪成2~3cm茎段接种到生根培养基中(l/2MS+NAAlmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)，PH值为5.8，在温度为25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX培养至正常生根。培养15 d生根时生根率为95%以上，每株苗有根数5~10条。当生根试管苗长至4~5cm时，在自然光炼苗3~4 d，洗净根部培养基，移至蛭石、珍珠岩和泥碳土等量混合而成的基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养，成活率达90%以上，移栽后15 d即可移至大田栽培。
[0025]实施例3:在生长季节选取生长健壮无病虫害的黄山贡菊顶芽，放入加少许洗衣粉的溶液浸泡10min,用自来水冲洗Ih左右，在超净工作台上用70%的酒精中浸没15 S，用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加两滴吐温灭菌4min，最后用无菌水冲洗4~5遍。将消毒过的黄山贡菊顶芽，用镊子和解剖刀剥去嫩叶，露出生长锥，用刀尖切下0.5mm的生长点，接种到诱导培养基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)，PH值为5.8，温度25V ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX，进行培养至长出小芽，25天后将诱导出贡菊小芽，转接到增殖培养基中(MS+ 6-BA3.0mg/L+NAA0.0 lmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)PH值为5.8，温度25 V ±2，每天光照12h，光照强度为2000~3000LX进行不定芽的增殖，30d为I个继代增殖周期，I个继代增殖周期后的增殖倍数为15倍。当芽高长到6~8cm时，将苗剪成2~3cm茎段接种到生根培养基中(l/2MS+NAAlmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)，PH值为5.8，在温度为25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX培养至正常生根。培养20天生根时生根率为95%以上，每株苗有根数10~15条。当生根试管苗长至4~5cm时，在自然光炼苗3~4 d，洗净根部培养基，移至蛭石、珍珠岩和泥碳土等量混合而成的基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养，成活率达90%以上，移栽后15 d即可移至大田栽培 。
[0026]实施例4:
在生长季节选取生长健壮无病虫害的黄山贡菊顶芽，放入加少许洗衣粉的溶液浸泡10min,用自来水冲洗Ih左右，在超净工作台上用70%的酒精中浸没15 S，用无菌水冲洗2遍，再用0.1%的氯化汞溶液加两滴吐温灭菌4min，最后用无菌水冲洗4~5遍。将消毒过的黄山贡菊顶芽，用镊子和解剖刀剥去嫩叶，露出生长锥，用刀尖切下0.5mm的生长点，接种到诱导培养基中(MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.lmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)，PH值为5.8，温度25V ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX，进行培养至长出小芽，25天后将诱导出贡菊小芽，转接到增殖培养基中(MS+ 6-BA3.0mg/L+NAA0.0 lmg/L+0.5%琼脂+3%蔗糖)PH值为5.8，温度25 V ±2，每天光照12h，光照强度为2000~3000LX进行不定芽的增殖，30天为I个继代增殖周期，I个继代增殖周期后的增殖倍数为15倍。当芽高长到8~IOcm时，
将其剪成3~4m的茎段，用0.5~0.8g/L的生根粉速蘸5 S，扦插到蛭石和珍珠岩等量混合而成的基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养，10 d左右开始生根，每株苗有根数10~15条，成活率为90%以上，培养20 d即可移至大田栽培。
【权利要求】
1.一种黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一，对外植体进行消毒处理； 步骤二，将消毒处理后的茎尖外植体进行诱导培养，获得不定芽； 步骤三，将诱导培养出不定芽进行继代增殖培养； 步骤四，将增殖培养后的不定芽进行试管内生根培养，试管外炼苗，得到再生植株； 步骤五，将增殖培养后的不定芽进行试管外生根培养，得到再生植株。
2.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，步骤一中，所述消毒处理包括以下步骤:剪取生长健壮无病虫害的黄山贡菊顶芽作为组织培养外植体，放入饱和洗衣粉的溶液中浸泡10 min左右，用自来水冲洗Ih左右，在超净工作台上用浓度为70%左右的酒精中浸没15 s左右，用无菌水冲洗2遍，再用浓度为0.1%左右的氯化汞溶液加两滴吐温灭菌4 min,最后用无菌水冲洗4-5遍。
3.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，在进行步骤二前，先将所述将消毒过的黄山贡菊顶芽外植体用镊子和解剖刀剥去嫩叶，露出生长锥，用刀尖切下0.3-0.5mm的生长点，并带2_3对叶原基，立即接种到诱导培养基中。
4.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，步骤二中，所述诱导培养需要使用诱导培养基，其原料配比为:在MS基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤1.0~2.0mg/L、奈乙酸0.1~0.5mg/L、0.4~0.6%的琼脂，3%左右的蔗糖，PH值为5.6~5.8，温度25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX，时间为20~25 d。
5.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，步骤三中，所述的增殖培养需要使用增殖培养基，其原料配比为:在MS基本培养基中添加6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)1.0 ~3.0mg/L、奈乙酸(NAA)0.01 ~0.1mg/L、0.4 ~0.6% 的琼脂，3% 左右的蔗糖，PH值为5.6~5.8，温度25°C ±2，每天光照12h左右，光照强度为1500~2000LX，时间为25 ~30 do
6.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，步骤四中，所述的生根培养需要使用生根培养基，其原料配比为:在1/2MS基本培养基中添加奈乙酸(NAA)0.5~1.5mg/L、0.4~0.6%的琼脂，3%的蔗糖，PH值为5.6~5.8，在温度为25°C ±2，每天光照12h，光照强度为1500~2000LX，时间为15~20 d。
7.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，步骤四中，所述试管苗外炼苗:在蛭石、珍珠岩和泥碳土等量混合而成的基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养，时间为7~15 d。
8.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，步骤五中，所述试管外生根培养的方法为:当贡菊芽长到8~IOcm时，将其剪成茎段，用生根粉处理后，扦插到基质中，用塑料薄膜搭成小拱棚保持其湿度为85%~95%，遮荫60%~70%，保温20~30°C培养，时间为20~25 do
9.根据权利要求7所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于，步骤五中，所述茎段为4~5cm， ABT生根粉浓度为0.5~0.8g/L，处理时间为5 S，基质为蛭石和珍珠岩等量混合而成，基质在扦插之前用浓度为0.3%~0.5%的高锰酸钾溶液消毒。
10.根据权利要求1所述的黄山贡菊茎尖组织培养的方法，其特征在于: 基本培养基选用MS培养基，0.4~0.6%的琼脂，3%的蔗糖，PH值为5.6~5.8，温度， 25°C ±2 ;茎尖启动诱导培养基为MS+6-BA1.0~2.0mg/L+NAA0.1~0.5mg/L ;不定芽继代增殖培养基为MS+6-BA1.0~3.0mg/L+NAA0.01~0.lmg/L ;试管内生根培养基为2/1MS+ΝΑΑ0.5~1.5mg/L ;试管外生根基质为蛭石和珍珠岩等量混合而成。
【文档编号】A01H4/00GK103563746SQ201310494252
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】陈黎, 孟承安, 万志兵, 苏胜荣, 李燕 申请人:黄山学院