一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂在防治油橄榄果实腐烂病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂在防治油橄榄果实腐烂病中的应用，该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌，Bacillus?amyloliquefaciens，完整命名为解淀粉芽孢杆菌Ba4，已于2013年9月12日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.8177。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Ba4能有效预防和治疗油橄榄果实腐烂病。
【专利说明】一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂在防治油橄榄果实腐烂病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物学领域，尤其涉及的是一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂在防治油橄榄果实腐烂病中的应用。
【背景技术】
[0002]油橄榄果实腐烂病(Alternaria tenuissima)是油橄榄产地新发生病害,主要为害果、叶片，造成落果落叶。果实感病后初为黑色小点，逐渐扩大，斑点可联合成大斑，果实脱落腐烂。目前尚无有效防治方法，特别是无污染防治技术更未涉及。油橄榄果实是橄榄油生产的重要原料，因此，采用无公害环保型措施是防治该病的首选。
[0003]因此，现有技术存在缺陷，需要改进。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术对油橄榄果实腐烂病防治的缺陷，提供了一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂在防治油橄榄果实腐烂病中的应用。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]一株解淀粉芽 孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌，Bacillusamyloliquefaciens,已于2013年09月12日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8177。
[0007]所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制作方法，是将营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下，按IOOmL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态下接种解淀粉芽孢杆菌斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌菌剂。
[0008]所述的菌剂的制作方法，其营养肉质培养液的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，水 1000mL。
[0009]所述的菌剂的制作方法制得菌剂。
[0010]所述的菌剂在预防油橄榄果实腐烂病中的应用，是人工去除病叶、病果后，春季喷洒所述菌剂，每隔10天每株喷200ml，连续三次，可控制病害发生。
[0011]所述的菌剂在预防油橄榄果实腐烂病中的应用，其菌剂浓度为稀释200倍以下。
[0012]所述的菌剂在治疗油橄榄果实腐烂病中的应用，春季喷洒所述菌剂，每隔10天每株喷200ml，连续三次，可显著治疗油橄榄果实腐烂病。
[0013]所述的菌剂在治疗油橄榄果实腐烂病中的应用，其菌剂浓度为稀释100倍以下。
[0014]本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Ba4能有效预防和治疗油橄榄果实腐烂病。
【具体实施方式】
[0015]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0016]1、内生细菌的分离、纯化与保存[0017]在四川广元市朝天区核桃根腐病发生地采集健康核桃根系，带回实验室分离。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g根组织，用70%的酒精消毒30s，无菌水洗3次后，再用4%的NaClO消毒3min后，无菌水洗3次，吸取最后一次洗涤液100 μ I涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0，混匀分装后121 °C高压灭菌30min)，28°C黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。
[0018]将已表面消毒的根部组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和IOml无菌7jC,充分研磨，静置30min,稀释10-1，10_2，10_3，10_4，10_5共5个梯度，分别吸取100 μ 110_3，10_4，10_5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g,蒸馏水1000ml，pH7.0,混匀分装后121°C高压灭菌30min)，每个处理3次重复，28°C黑暗培养48h，选取生长最为均匀的梯度，进行平板计数。
[0019]依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4°C保藏备用。共获10个内生细菌。
[0020]2、内生细菌对油橄榄果实腐烂病病菌的平板拮抗作用
[0021]平板对峙法:在培养皿中央接种7d的油橄榄果实腐烂病病菌(Alternariatenuissima)菌饼(直径5mm),离该病菌饼约3cm处,分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，28°C培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率:
[0022]菌落生长抑制率=(对照菌落净生长直径一处理菌落净生长直径)/对照菌落净生长直径X 100%
[0023]表1是7d后内生细菌对油橄榄果实腐烂病病菌(Alternaria tenuissima)的拮抗作用，结果显示，有5种内生细菌菌落生长抑制率达75.39%以上，其中Ba4菌株抑制率达98.46%ο
[0024]表1内生细菌对油橄榄果实腐烂病病菌的拮抗作用(7天)
[0025]
【权利要求】
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC N0.8177。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的菌剂的制作方法，其特征是，将营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下，按IOOmL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态下接种解淀粉芽孢杆菌斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂的制作方法，其特征是，营养肉质培养液的成分为牛肉膏 7.0g，蛋白胨 10g，NaC15g，水 1000mL0
4.根据权利要求2或3所述的菌剂的制作方法制得菌剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂在预防油橄榄果实腐烂病中的应用，其特征是，人工去除病叶、病果后，春季喷洒所述菌剂，每隔10天每株喷200ml，连续三次，可控制病害发生。
6.根据权利要求5所述的菌剂在预防油橄榄果实腐烂病中的应用，其特征是，菌剂浓度为稀释200倍以下。
7.根据权利要求4所述的菌剂在治疗油橄榄果实腐烂病中的应用，其特征是，春季喷洒所述菌剂，每隔10天每株喷200ml，连续三次，可显著治疗油橄榄果实腐烂病。
8.根据权利要求7 所述的菌剂在治疗油橄榄果实腐烂病中的应用，其特征是，菌剂浓度为稀释100倍以下。
【文档编号】A01P3/00GK103555617SQ201310494832
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】朱天辉, 朱涵明月, 李姝江, 张静, 刘洋, 韩珊, 谯天敏, 张丽娜 申请人:四川农业大学