一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，将高脂松树嫩枝茎段灭菌消毒后，接入初代培养基中，在温度7-10℃暗培养5-7d，温度20-25℃培养50-60d形成初代芽；将初代芽转入增殖培养基内，温度17-20℃培养5-7d后，温度20-25℃培养15-20d形成增殖芽丛，芽丛转入伸长培养基中，温度17-20℃培养5-7d，温度20-25℃培养18-22d，芽增殖和伸长交替培养。该方法能有效遏制继代芽的褐化，使芽健康增殖，平均增殖系数6.95以上，芽伸长快，并且长势良好，经过多代培养增殖系数稳定，达到继代芽快速扩繁的目的，具有较好的经济效益和社会效益。
【专利说明】一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明属植物繁殖【技术领域】，涉及松树组织培养技术，尤其是一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法。
【背景技术】
[0002]高脂松树是新松木品种，是集采脂、纸浆、纤维板，胶合板、建筑材、家具材为一身的优良树种，具有速生、树干通直，高产脂，抗逆性及适应性强等优良性状，适合亚热带地区种植。高脂松树一般5-8年左右可以成材，综合利用价值高。由于高脂松树种子量少，同时种子苗有分化，良种资源极少。无性繁殖高脂松树，可以保持母本的优良性状。目前，高脂松树主要是扦插和嫁接。高脂松树的扦插和嫁接，由于受良种穗条有限，制约优良品种的快速推广。作为苗木的组培快繁技术，虽然在组织培养过程有所研究，仍存在着许多问题。例如继代芽松脂含量高造成芽褐死、易玻璃化，增殖系数低，有效芽数少，继代周期长，多次继代芽活性降低，增殖系数降低。因此，在高脂松组培继代芽培养中，上述问题更为突出，特别需要一种高脂松组培继代芽的培养方法，解决现有存在的技术问题，适应大力发展高脂松树人工林的需要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有高脂松树组织培养初代芽褐化严重至死，芽增殖系数低，高生长缓慢等问题，提供一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法。
[0004]本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:
一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，采用组培茎段选择与处理、组培芽诱导、继代增殖扩繁、丛生芽伸长和壮芽培养等组培技术体系，获得优质高脂松树芽，其操作步骤如下:
(1)组培茎段选择与处理
高脂松树的组培茎段芽选自年产松脂达4-4.5kg/a.株的高脂松树穗条嫁接成活的植株，剪取春季萌发的半木质化嫩枝稍，长6-lOcm，用苯扎溴铵按常规方法清洗，然后用自来水冲洗十浸泡15min,洗去嫩枝稍上的尘埃和苯扎溴铵,再将嫩枝稍裁成l_2cm长的莖段，视木质化程度分类置放容器内，用0.1%的新吉尔灭浸泡10-15 min，在无菌条件下，用0.15%HgCl2灭菌消毒3-5min,再用无菌水冲洗3_4次,最后用0.l%HgCl2灭菌消毒4_6min,无菌水冲洗4-5次后，将灭菌消毒的茎段放在无菌滤纸上将水吸干；
(2)组培芽诱导
将无菌茎段放入诱导培养基中进行组培芽诱导，组培芽诱导的方法是:先放置温度7-10°C的环境，暗培养5-7d，再转入温度20-25°C，光照强度1200-20001ux，光照12_14h/d条件下培养50-60d，形成初代芽；
(3)芽继代增殖扩繁
将初代芽接入增殖扩繁培养基中进行继代增殖扩繁，继代增殖扩繁控制温度17-20°C，光照强度2000-40001ux，光照10_14h/d，培养5_7d，再在温度20_25°C，光照强度2000-40001ux，光照10-14h/d的条件下培养15_20d，经2_3次继代增殖扩繁周期形成丛生芽，平均增殖系数6.95以上；
(4)丛生芽伸长
将< 1cm芽丛接入伸长培养基中进行丛生芽伸长，丛生芽伸长控制温度17-20°C，光照强度2000-40001uX，光照10-14h/d，培养5_7天，再在温度22-25 V，光照强度2000-40001ux，光照10-14h/d的条件下培养20_25d，得到长2_3cm的伸长丛生芽；
(5)壮芽培养
将高≥2cm的单芽切下，插入壮芽培养基中，温度20-25°C，光照强度2000-40001ux，光照10-14h/d，培养壮芽；将< Icm芽丛接入增殖扩繁培养基中，进行丛生芽继代增殖培养。
[0005]以上所述的诱导培养基配方为:1/2改良DCR十6-BA3-5mg/L十ΝΑΑ0.5-1.0mg/L十VC15 mg/L十椰子汁40-60ml/L十琼脂粉3.8g/L十鹿糖20g/L。
[0006]以上所述的增殖扩繁培养基配方为:1/2改良DCR十6-BA0.5_3mg/L十NAA0.05-0.5mg/L 十 VC15mg/L 十椰子汁 10_30ml/L 十琼脂粉 3.8g/L 十鹿糖 20g/L。
[0007]以上所述的伸长培养基配方为:改良DCR十6-BA0.1-0.3mg/L十NAA0.05-0.2mg/L十椰子汁10-20ml/L十活性碳3g/L十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L。
[0008]以上所述的壮芽培养基配方为:改良DCR十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L。
[0009]以上所述的改良DCR培养基配方为:DCR十NH4N03250 mg/L十谷氨酰胺5mg/L。
[0010]本发明相对于现有的技术具有优点和积极效果:
1、本发明筛选出一个适应高脂松树茎段芽的组培技术体系，其方案为:常规洁净溶液处理组培茎段，用诱导培养基组培芽诱导，用增殖扩繁培养基继代增殖扩繁，经2-3次继代周期形成丛生芽，伸长培养基丛生芽伸长，将高≥ 2cm的单芽切下插于壮芽培养基培养，< Icm芽丛接入增殖扩繁培养基中，进行丛生芽继代增殖培养，实现丛生芽继代增殖，能有效完成组培快繁芽培养过程。
[0011]2、本发明在芽继代培养初期，采用低温度培养后，转到较高温度下培养，通过前期低温培养有效遏制继代芽褐化和玻璃化，较高温度下培养促进芽快速生长，获得恒稳的健康芽增殖体系，保持较高增殖系数和优质有效芽数，达到组培芽高效扩繁的目的，增殖系数达到6.95以上。
[0012]3、本发明一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，其操作过程简便，培养周期短，继代芽质量优，继代芽产量大幅度提高，增殖系数达到6.95以上，具有较好的经济效益和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1和图2均为高脂松树茎段组培壮芽。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0015]实施例1
本实施例采用高脂松树穗条为年产松脂达4kg/a.株的母株穗条。在晴朗日剪取春季萌发的半木质化嫩枝稍，长6-lOcm，剪除针叶，在常规洗洁净溶液苯扎溴铵中刷洗干净，然后用自来水冲洗十浸泡15min，洗去嫩枝稍上的洗洁净溶液，再将嫩枝稍裁成l_2cm长的茎段，视木质化程度分类置放容器内，将幼嫩顶梢用0.1%的新吉尔灭浸泡15min，，无菌水冲洗2遍，再用0.15%的HgCl2灭菌消毒3min，然后用无菌水冲洗5次，最后用0.1%的HgCl2灭菌消毒6min，再用无菌水冲洗5次，将灭菌消毒的茎段放在无菌滤纸上将水吸干。
[0016]将无菌莖段放入含有:1/2改良DCR十6_BA4mg/L十ΝΑΑ0.8mg/L十VC15mg/L十椰子汁50ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的诱导培养基中进行组培芽诱导。方法是:先放置放置人工光照培养箱，控制温度10°C，全暗培养5d，再转入温度25°C，光照强度16001ux,光照13h/d条件下培养56d形成初代芽。 [0017]将形成的初代芽接入1/2改良DCR十6-BA2mg/L十ΝΑΑ0.2mg/L十VC15mg/L十椰子汁20ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的增殖扩繁培养基中进行继代增殖扩繁，控制温度18°C，光照强度30001UX，光照12h/d，培养6d，再在温度23°C，光照强度30001ux，光照12h/d，培养18d，经3次继代周期形成丛生芽，平均增殖系数7.1。
[0018]将< Icm芽丛接入改良DCR十6-BA0.2mg/L十ΝΑΑ0.lmg/L十椰子汁15ml/L十活性碳3g/L十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L的伸长培养基中进行丛生芽伸长，控制温度18°C，光照强度30001ux，光照12h/d的条件下培养6天，再控制温度23°C，光照强度30001ux，光照12h/d的条件下培养23d，得到芽长≥2.6cm的伸长丛生芽。
[0019]将高≥2cm的单芽切下，插入壮芽培养基中，控制温度25°C，光照强度30001ux，光照12h/d，培养壮芽。将< Icm芽丛接入增殖扩繁培养基中，进行丛生芽继代增殖培养。
[0020]以上所述的改良DCR培养基配方为:DCR十NH4N03250mg/L十谷氨酰胺5mg/L，培养基 pH 5.8。
[0021]实施例2
本实施例采用高脂松树穗条为年产松脂达4kg/a的母株穗条。在晴朗日剪取春季萌发的半木质化嫩枝稍，长6-8cm，剪除针叶，在常规洗洁净溶液苯扎溴铵中刷洗干净，然后用自来水冲洗十浸泡15min，洗去嫩枝稍上的洗洁净溶液，再将嫩枝稍裁成l_2cm长的茎段，视木质化程度分类置放容器内，将幼嫩顶梢用0.1%的新吉尔灭浸泡lOmin，，无菌水冲洗I遍，再用0.1%的HgCl2灭菌消毒5min，然后用无菌水冲洗3次，最后用0.1%的HgCl2灭菌消毒4min，再用无菌水冲洗4次，将灭菌消毒的茎段放在无菌滤纸上将水吸干。
[0022]将无菌莖段放入含有:1/2改良DCR十6_BA3mg/L十NAA0.5mg/L十VC15mg/L十椰子汁60ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的诱导培养基中进行组培芽诱导。方法是:先放置放置人工光照培养箱，控制温度10°C，全暗培养5d，再转入温度20°C，光照强度12001ux,光照14h/d条件下培养60d，形成初代芽。
[0023]将形成的初代芽接入1/2改良DCR十6-BA0.5mg/L十NAA0.05mg/L十VC15mg/L十椰子汁30ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的增殖扩繁培养基中进行继代增殖扩繁，控制温度17°C，光照强度20001uX，光照14h/d，培养7d，再在温度25°C，光照强度20001ux，光照10h/d，培养15d，经2次继代周期形成丛生芽，平均增殖系数6.86。
[0024]将< Icm芽丛接入改良DCR十6-BA0.lmg/L十ΝΑΑ0.05mg/L十椰子汁20ml/L十活性碳3g/L十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L的伸长培养基中进行丛生芽伸长，控制温度17°C，光照强度20001ux，光照14h/d的条件下培养7天，再控制温度22°C，光照强度20001ux，光照14h/d的条件下培养25d，得到芽长≥2.4cm的伸长丛生芽。
[0025]将高≥2cm的单芽切下，插入壮芽培养基中，控制温度22°C，光照强度20001ux，光照12h/d，培养壮芽。将< Icm芽丛接入增殖扩繁培养基中，进行丛生芽继代增殖培养。
[0026]以上所述的改良DCR培养基配方为:DCR十NH4N03250mg/L十谷氨酰胺5mg/L，培养基pH5.8。
[0027]实施例3
本实施例采用高脂松树穗条为年产松脂达4.5kg/a的母株穗条。在晴朗日剪取春季萌发的半木质化嫩枝稍，长8-lOcm，剪除针叶，在常规洗洁净溶液苯扎溴铵中刷洗干净，然后用自来水冲洗十浸泡15min，洗去嫩枝稍上的洗洁净溶液，再将嫩枝稍裁成l_2cm长的茎段，视木质化程度分类置放容器内，将幼嫩顶梢用0.1%的新吉尔灭浸泡15min，，无菌水冲洗2遍，再用0.1%的HgCl2灭菌消毒5min，然后用无菌水冲洗5次，最后用0.1%的HgCl2灭菌消毒4min，再用无菌水冲洗4次，将灭菌消毒的茎段放在无菌滤纸上将水吸干。
[0028]将无菌莖段放入含有:1/2改良DCR十6_BA5mg/L十NAA1.0mg/L十VC15mg/L十椰子汁40ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的诱导培养基中进行组培芽诱导。方法是:先放置放置人工光照培养箱，控制温度10°C，全暗培养5d，再转入温度25°C，光照强度20001ux,光照12h/d条件下培养50d，形成初代芽。
[0029]将形成的初代芽接入1/2改良DCR十6_BA3mg/L十NAA0.5mg/L十VC15mg/L十椰子汁10ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的增殖扩繁培养基中进行继代增殖扩繁，控制温度20°C，光照强度40001UX，光照10h/d，培养5d，再在温度25°C，光照强度40001ux，光照10h/d，培养15d，经2次继代周期形成丛生芽，平均增殖系数6.95。
[0030]将< Icm芽丛接入改良DCR十6-BA0.3mg/L十ΝΑΑ0.2mg/L十椰子汁10ml/L十活性碳3g/L十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L的伸长培养基中进行丛生芽伸长，控制温度20°C，光照强度40001uX，光照10h/d的条件下培养7天，再控制温度25°C，光照强度40001ux，光照10h/d的条件下培养25d，得到芽长≥2.8cm的伸长丛生芽。
[0031]将高≥2cm的单芽切下，插入壮芽培养基中，控制温度22°C，光照强度40001ux，光照14h/d，培养壮芽。将< Icm芽丛接入增殖扩繁培养基中，进行丛生芽继代增殖培养。
[0032]以上所述的改良DCR培养基配方为:DCR十NH4N03250mg/L十谷氨酰胺5mg/L，培养基 pH5.8。
[0033]实施例4
本实施例采用高脂松树穗条为年产松脂达4kg/a的母株穗条。在晴朗日剪取春季萌发的半木质化嫩枝稍，长6-8cm，剪除针叶，在常规洗洁净溶液苯扎溴铵中刷洗干净，然后用自来水冲洗十浸泡15min，洗去嫩枝稍上的洗洁净溶液，再将嫩枝稍裁成l_2cm长的茎段，视木质化程度分类置放容器内，将幼嫩顶梢用0.1%的新吉尔灭浸泡12min，，无菌水冲洗I遍，再用0.12%的HgCl2灭菌消毒3.5min,然后用无菌水冲洗3次，最后用0.1%的HgCl2灭菌消毒4min，再用无菌水冲洗4次，将灭菌消毒的茎段放在无菌滤纸上将水吸干。
[0034]将无菌莖段放入含有:1/2改良DCR十6_BA5mg/L十NAA1.0mg/L十VC15mg/L十椰子汁45ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的诱导培养基中进行组培芽诱导，方法是:先放置放置人工光照培养箱，控制温度9°C，全暗培养5.5d，再转入温度22°C，光照强度1200ux,光照13h/d条件下培养50d，形成初代芽。[0035]将形成的初代芽接入1/2改良DCR十6-BAlmg/L十NAA0.3mg/L十VC15mg/L十椰子汁12ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L的增殖扩繁培养基中进行继代增殖扩繁，控制温度18°C，光照强度32001UX，光照llh/d，培养6d，再在温度24°C，光照强度32001ux，光照llh/d，培养16d，经3次继代周期形成丛生芽，平均增殖系数7.13。
[0036]将< 1cm芽丛接入改良DCR十6-BA0.3mg/L十NAA0.2mg/L十挪子汁12ml/L十活性碳3g/L十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L的伸长培养基中进行丛生芽伸长，控制温度18°C，光照强度32001uX，光照llh/d的条件下培养6天，再控制温度24°C，光照强度3200ux，光照llh/d的条件下培养20d，得到芽长≥2.6cm的伸长丛生芽。
[0037]将高≥2cm的单芽切下，插入壮芽培养基中，控制温度23°C，光照强度30001ux，光照12h/d，培养壮芽。将< 1cm芽丛接入增殖扩繁培养基中，进行丛生芽继代增殖培养。
[0038]以上所述的改良DCR培养基配方为:DCR十NH4N03250mg/L十谷氨酰胺5mg/L，培养基 pH5.8。
【权利要求】
1.一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，其特征在于:组培茎段选择与处理、组培芽诱导、继代增殖扩繁、丛生芽伸长和壮芽培养等组培技术体系，获得优质高脂松树芽，其操作步骤如下: (1)组培茎段选择与处理 高脂松树的组培茎段芽选自年产松脂4-4.5kg/a.株的高脂松树穗条嫁接成活的植株，剪取春季萌发的半木质化嫩枝稍，长6-lOcm，用苯扎溴铵按常规方法清洗，然后用自来水冲洗十浸泡15min,洗去嫩枝稍上的尘埃和苯扎溴铵,再将嫩枝稍裁成l_2cm长的莖段，视木质化程度分类置放容器内，用0.1%新吉尔灭浸泡10-15min，在无菌条件下，用0.15%HgCl2灭菌消毒3_5min,无菌水冲洗3_4次,再用0.l%HgCl2灭菌消毒4_6min,无菌水冲洗4-5次后，将灭菌消毒的茎段放在无菌滤纸上将水吸干； (2)组培芽诱导 将无菌茎段放入诱导培养基中进行组培芽诱导，组培芽诱导的方法是:先置温度7-10°C的环境，暗培养5-7d，再转入温度20-25°C，光照强度1200-20001ux，光照12_14h/d条件下培养50-60d，形成初代芽； (3)芽继代增殖扩繁 将初代芽接入增殖扩繁培养基中进行继代增殖扩繁，继代增殖扩繁控制温度17-20°C光照强度2000-40001UX，光照10-14h/d，培养5_7d，再在温度20-25 °C，光照强度2000-40001ux，光照10-14h/d的条件下培养15_20d，经2_3次继代增殖扩繁周期形成丛生芽，平均增殖系数6.95以上； (4)丛生芽伸长 将高< Icm的芽丛接入伸长培养基中进行丛生芽伸长，丛生芽伸长控制温度17-20°C，光照强度2000-40001UX，光照10_14h/d，培养5_7d，再在温度22-25°C，光照强度2000-40001ux，光照10-14h/d的条件下培养20_25d，得到长2_3cm的伸长丛生芽； (5)壮芽培养 将高≥2cm的单芽切下，插入壮芽培养基中，温度20-25°C，光照强度2000-40001ux，光照10-14h/d，培养壮芽；将< Icm的芽丛，接入继代增殖扩繁培养基中，继续进行丛生芽的增殖扩繁培养。
2.根据权利要求1所述的一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，其特征在于:所述的诱导培养基配方为:1/2改良DCR十6-BA3-5mg/L十ΝΑΑ0.5-1.0mg/L十VC15 mg/L十椰子汁40-60ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L。
3.根据权利要求1所述的一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，其特征在于:所述的增殖扩繁培养基配方为:1/2改良DCR十6-BA0.5_3mg/L十ΝΑΑ0.05-0.5mg/L十VC15mg/L十椰子汁10_30ml/L十琼脂粉3.8g/L十蔗糖20g/L。
4.根据权利要求1所述的一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，其特征在于:所述的伸长培养基配方为:改良DCR十6-BA0.1-0.3mg/L十ΝΑΑ0.05-0.2mg/L十椰子汁10-20ml/L十活性碳3g/L十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L。
5.根据权利要求1所述的一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，其特征在于:所述的壮芽培养基配方为:改良DCR十琼脂粉4.0g/L十蔗糖20g/L。
6.根据权利要求1所述的一种高脂松树茎段组培芽诱导和增殖培养的方法，其特征在于:所述的改良DC R培养基配方为:DCR十NH4N 03250 mg/L十谷氨酰胺5mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK103548699SQ201310593867
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】蔡玲, 姚瑞玲, 刘海龙, 吴幼媚 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院