改善植物抗旱性：果胶酯酶的制作方法

改善植物抗旱性：果胶酯酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种增强植物抗旱性的新方法。所述方法包括破坏所述植物中一个或多个基因的表达。与没有被处理以破坏所述基因的表达的植物相比，该植物显示改善的抗旱性。还提供可以通过根据本发明的方法获得的植物和植物产品。
【专利说明】改善植物抗旱性：果胶酯酶

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种增强植物抗旱性的方法。所述方法包括破坏所述植物中一个或多 个基因的表达。与没有被处理以破坏所述一个或多个基因表达的植物相比，所述植物显示 改善的抗旱性。还提供了可以通过根据本发明的方法获得的植物和植物产品。

【背景技术】
[0002] 非生物胁迫，例如干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫都是农业的威胁，并 且其是全世界作物损失的主要原因（Wang等，（2003)Planta 218(1)1-14)。
[0003] 本领域中，一些报道可用于处理非生物胁迫的生物化学、分子和遗传学背景（Wang 等，（2003)Planta 218(1) 1-14 或 Kilian 等（2007)Plant J 50(2)347-363)。用于处理非 生物胁迫的植物改良通常是基于保护和保持细胞组分的功能和结构的基因操作。然而，由 于对非生物胁迫条件的遗传复杂反应，这样的植物似乎更难控制和工程化。Wang (Wang等， (2003)Planta 218 (1) 1-14)，特别地提及工程化的策略之一依靠使用一个或几个基因，所 述基因参与信号传导和调控途径、或编码引起功能和结构性保护物例如渗透物和抗氧剂的 合成的途径中存在的酶、或编码赋予耐逆性的蛋白质。
[0004] 尽管已经报道了在提供非生物胁迫抗性植物方面的改善，但是以其为基础的遗传 复杂机制的性质提供了进一步改善该领域的持续的需要。例如，据报道由于发育和生理失 衡，基因转化的抗旱植物通常可能显示更慢的生长和减少的生物量（Serrano等，（1999) J Exp Bot 50:1023 - 1036)，因此，与没有转化的植物相比具有显著的适合度代价（Kasuga 等，（1999)Nature Biot.Vol.l7;Danby and Gehring(2005)Trends in Biot.Vol.23 No. 11)。
[0005] 为了在胁迫条件下获得植物生长，提出了一些生物技术方法。例如，W003/020015 中公开了对盐胁迫的抗性增强的植物。该文件公开了利用9-顺式-环氧类胡萝卜素加双 氧酶核苷酸和多肽而抗盐胁迫的转基因植物。
[0006] 在例如 US2009/0144850、US 2007/0266453 和 W0 2002/083911 中公开 了抗旱 性增强的植物。US2009/0144850描述了由于DR02核酸的表达改变而显示耐旱表型的植 物。US 2007/0266453描述了由于DR03核酸的表达改变而显示耐旱表型的植物，并且 W02002/083911描述了由于在保卫细胞中表达的ABC转运体的活性降低而具有对干旱胁迫 的抗性增强的植物。另一个实例是Kasuga和合著者（1999)的工作，其描述了在正常生长 条件下，转基因植物中编码DREB1A的cDNA的过表达活化许多胁迫抗性基因的表达，导致对 干旱、盐负荷和严寒的抗性改善。然而，DREB1A的表达也引起在正常生长条件下严重的生 长迟缓（Kasuga(1999)Nat Biotechnol 17(3)287-291)。仍然需要用于增强对非生物胁迫 (尤其是如干旱的非生物胁迫）的抗性的新的、可替代的和/或另外的方法。
[0007] 本发明的一个目的是提供增强植物抗旱性的新方法。如果在低的水可利用性/干 旱的条件下生长，与没有接受根据本发明的方法的植物相比，这样的植物例如有可能生产 更多生物量和/或更多作物和其衍生的植物产品。


【发明内容】

[0008] 在第一个方面，本发明提供一种用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植 物的方法，其包括破坏植物、植物原生质体或植物细胞中功能性果胶酯酶蛋白质的表达的 步骤，和可选择地再生所述植物，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质包括具有与SEQ ID. No. 2 的氨基酸序列至少55%同一性的氨基酸序列。
[0009] 所述功能性果胶酯酶蛋白质可以是如下蛋白质：当在具有被破坏的内源性果胶 酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性果胶酯酶蛋白质未表 达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受 损的植物。
[0010] 在另一个方面，本发明提供一种用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植 物的方法，所述方法包括破坏植物、植物原生质体或植物细胞中功能性果胶酯酶蛋白质的 表达的步骤，和可选择地再生所述植物，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质是由包含与SEQ ID. No. 1的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列的核酸序列编码的。
[0011] 所述功能性果胶酯酶蛋白质可以是如下蛋白质：当在具有被破坏的内源性果胶 酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性果胶酯酶蛋白质未表 达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受 损的植物。
[0012] 所述破坏表达的步骤可以包括使编码所述功能性果胶酯酶蛋白质的核酸序列突 变。使所述核酸序列突变的步骤可以包括插入、缺失和/或取代至少一个核苷酸。
[0013] 所述破坏表达的步骤可以包括基因沉默。
[0014] 所述方法可以包括破坏两种或更多种功能性果胶酯酶蛋白质的表达。其可以进一 步包括由具有改善的抗旱性的植物生产植物或植物产品的步骤。
[0015] 在另一个方面，本发明还涉及与SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少55%同一性 的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列在植物抗旱性 筛选中的用途。
[0016] 另外，本文教导了 SEQ ID N0:2的果胶酯酶氨基酸序列或SEQ ID NO: 1的果胶酯 酶核酸序列在拟南芥植物抗旱性筛选中的用途。
[0017] 本发明还涉及具有SEQ ID NO: 1的果胶酯酶核酸序列的至少一部分或SEQ ID N0:2的果胶酯酶氨基酸序列的至少一部分作为培育抗旱性拟南芥植物的标记物的用途。
[0018] 本发明进一步涉及如本文定义的功能性果胶酯酶蛋白质用于调节、优选地增强植 物抗旱性的用途。
[0019] 另外，本发明涉及其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达受损的植物、植物细胞或植 物产品用于在干旱胁迫条件下生长的用途，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白 质：当在具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其得到与其 中所述功能性果胶酯酶蛋白质未表达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥 T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物，其中所述干旱胁迫条件引起其中所述功能 性果胶酯酶蛋白质的表达未受损的对照植物、植物细胞或植物产品显示比其中功能性果胶 酯酶蛋白质的表达被破坏的植物、植物细胞或植物产品更早的干旱胁迫症状，比如枯萎症 状。
[0020] 最后，本发明提供其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达受损的番茄（Solanum lycopersicum)、陆地棉（Gossypium hirsutum)、大豆（Glycine max)、小麦属植物 (Triticum spp.)、大麦(Hordeum vulgare.)、燕麦(Avena sativa)、高梁(Sorghum bicolor)、黑麦（Secale cereale)或甘蓝型油菜（Brassica napus)植物、植物细胞或植物 产品，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白质：当在具有被破坏的内源性果胶酯酶 基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性果胶酯酶蛋白质未表达、 具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损 的植物。在一个实施方式中，所述植物、植物细胞或植物产品包括被破坏的内源性果胶酯酶 基因。

【专利附图】

【附图说明】
[0021] 图1显示在实施例1和2中说明的典型的实验的结果。
[0022] 图2显示与对照（野生型）植物的干旱敏感性表型相比，果胶酯酶敲除（拟南芥 At5gl9730插入突变体）的抗旱表型。
[0023] 图3显示At5gl9730插入突变体（果胶酯酶敲除）的干旱存活率。拟南芥 At5gl9730插入突变体比野生型植物或与补充来自芜菁、番茄或稻的同系物的At5gl9730 插入突变体抗干旱存活显著地更好（P < 〇. 05)。该图表明不仅在该基因中的插入突变产生 抗旱表型，而且来自进化不同的单子叶植物和双子叶植物物质的该基因同系物对于恢复正 常干旱-敏感性表型有作用。灰色条具有比黑色条显著更低的值（P < 〇. 05)。
[0024] 定义
[0025] 在下述说明和实施例中，使用大量术语。为了提供对说明书和权利要求书（包括 给出的这类术语的范围）的清楚一致的理解，提供下述定义。除非本文另有定义，否则使用 的所有技术术语和科技术语具有与如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的 含义。将所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献的全部内容通过引用合并于此。
[0026] 实施用于本发明方法中的常规技术的方法将对普通技术人员是显而易见的。本 领域技术人员熟知分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因 组学、序列和相关领域中常规技术的实践，并且在例如下述文献参考中讨论：Sambr 〇〇k等， Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 ;Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, 1987 及定期更新；和 the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego。
[0027] 在该文件及其权利要求书中，动词"包括"及其变化形式以非限定含义使用，意味 着包括该术语后的项目，但是不排除没有明确提及的项目。其涵盖动词"基本上由...组 成"以及〃由...组成〃。
[0028] 除非上下文另有清楚的规定，如本文使用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包 括复数指示。例如，如上述使用的用于分离"一个" DNA分子的方法包括分离多个分子（例 如，数十个、数百个、数千个、数万个、数十万个、数百万个、或更多分子）。
[0029] 对齐（Aligning)和比对（alignment):术语"对齐"和"比对"指根据相同或相似 核苷酸的短或长的延伸的存在，比较两个或更多个核苷酸序列。本领域已知一些核苷酸序 列比对的方法，如下进一步解释。
[0030] "基因表达"指可操作地连接到合适的调节区（尤其是启动子）的DNA区域转录成 RNA的过程，该RNA有生物活性，即能够翻译成生物活性蛋白质或肽（或活性肽片段）或其 本身有活性（例如，转录后的基因沉默或RNAi)。在某些实施方式中，活性蛋白质指具有组 成型活性的蛋白质。编码序列优选地位于有义方向，并且编码期望的、生物活性的蛋白质或 肽、或活性肽片段。"异位表达"指在其中通常基因不表达的组织中的表达。
[0031] 与果胶酯酶蛋白质（或变体，例如直系同系物或突变体、及片段）有关的"功能性" 指基因和/或编码蛋白质改良（定量和/或定性）耐旱性的能力，例如通过改良植物中基 因的表达水平（例如通过过表达或沉默）。例如，可以通过各种方法检测从植物物种X获得 的果胶酯酶蛋白质的功能性。优选地，如果蛋白质是功能性的，则植物物种X中编码该果胶 酯酶蛋白质的基因的沉默或敲除，例如使用基因沉默载体，将导致抗旱性改善，如通过本文 的详细阐述检测。而且，用编码所述功能性果胶酯酶蛋白质的核酸序列互补具有被破坏的 果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系将产生其中正常抗旱性恢复的植物，S卩补充的植物将 具有与对照植物类似的抗旱性。本领域技术人员能够使用如本文示例的常规方法测试果胶 酯酶蛋白质的功能性。
[0032] 术语"基因"指包含区域（转录区）的DNA序列，其被转录为可操作地连接至合适 的调控区（例如启动子）的细胞中RNA分子（例如mRNA)。因此，基因可以包括几个可操作 地连接的序列，例如启动子、5'前导序列（包含例如参与翻译起始的序列）、（蛋白质）编 码区（cDNA或基因组DNA)和3'非翻译序列（也称为3'未翻译序列或3' UTR，包含例如转 录终止序列位点）。
[0033] 术语"cDNA"指互补DNA。互补DNA是通过将RNA逆转录成互补DNA序列制备的。 因此，cDNA序列对应于从基因表达的RNA序列。由于当从基因组表达时mRNA序列可能受到 剪切，即在细胞质中翻译成蛋白质之前，内含子被从mRNA剪切掉且外显子连接在一起，应 当理解cDNA的表达指编码cDNA的mRNA的表达。因此，cDNA序列可能与其对应的基因组 DNA序列不相同，因为cDNA可能仅编码蛋白质的完全开放读码框（由连接的外显子构成）， 而基因组DNA编码被内含子序列散布的外显子，其侧面为5'和3' UTR序列。
[0034] "同一性"是对核苷酸序列或氨基酸序列的同一性的测量。通常，比对序列，以便 获得最高位匹配。"同一性"本身具有领域公知的含义，并且可以使用公开的技术计算。 参见，例如 "COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，New York，1988 ;BI0C0MPUTING:INF0RMATICS and GENOME PROJECTS，Smith, D.W.编 著，Academic Press，New York，1993 ;C0MPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，第 1 部分， Griffin，A.M.和 Griffin, H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994;SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G·，Academic Press，1987;和 SEQUENCE ANALYSIS PRIMER ;Gribskov，M.和 Devereux，J.编辑，M Stockton Press，New York，1991)。虽然 有多种测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性的方法，但是普通技术人员所熟知该 术语"同一性"（Carillo，H.和 Lipton，D·，SIAM J，Applied Math(1988)48:1073)。通 常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括，但不限于在⑶IDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop 编辑，Academic Press，San Diego, 1994,以及 Carillo，H.和 Lipton，D·，SIAM J，Applied Math(1988)48:1073中公开的方法。计算机程序编码了测定 同一性和相似性的方法。优选的测定两个序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法包 括，但不限于 GCS 程序包（Devereux，J.等，Nucleic Acids Research(1984) 12(1):387)， BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S. F.等，J.Molec. Biol. (1990)215:403)。
[0035] 作为示例，具有与编码某个序列的多肽的参考核苷酸序列至少例如95%"同一性" 的核苷酸序列多核苷酸，表示该多核苷酸序列除了可以相对于每1〇〇个参考多肽序列的核 苷酸包括至多5点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。因此，将在参考核 苷酸序列的全长上计算核苷酸序列与参考核苷酸序列的同一性百分比。换句话说，为了获 得与参考核苷酸序列具有至少95%同一'丨生的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5% 的核苷酸可以缺失和/或被另外的核苷酸取代，和/或参考序列中总核苷酸的至多5%的数 目核苷酸可以插入到参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或 3'末端位置上，或者这两种末端位置之间的任何位置上，单个散布在参考序列的核苷酸之 间或参考序列的一个或多个邻接组内。
[0036] 类似地，具有与SEQ ID N0 :2的参考核苷酸序列至少例如95% "同一性"的氨基 酸序列的多肽，表示该多肽序列除了可以相对于SEQ ID N0 :2的参考氨基酸的每100个氨 基酸包括至多5个氨基酸改变之外，该多肽的氨基酸序列与参考序列相同。因此，将在参考 氨基酸序列的全长上计算氨基酸序列与参考氨基酸序列的同一性百分比。换句话说，为了 获得与参考氨基酸序列具有至少95 %同一性的氨基酸序列的多肽，参考序列中至多5 %的 氣基酸残基可以缺失和/或被另外的氣基酸残基取代，和/或参考序列中总氣基酸残基的 至多5 %的数目的氨基酸可以插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考核苷 酸序列的氨基或羧基末端位置上，或者这两种末端位置之间的任何位置上，单个散布在参 考序列的残基之间或参考序列的一个或多个邻接组内。
[0037] 根据本发明的核酸可以包括嘧啶和嘌呤碱基，分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿 嘧啶、及腺嘌呤和鸟嘌呤的任何聚合物或低聚物（参见其全部内容为所有目的通过引 用合并于此的 Albert L.Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800(Worth Pub. 1982))。本发明涵盖任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分、及其任何化学变 体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。所述聚合物或低聚物组成上可以是 异质的或同质的，并且可以从天然存在来源分离，或人工或合成生成。另外，核苷酸可以是 DNA或RNA、或其混合物，并且可以以单链或双链形式永久或短时存在，包括同源双链体、异 源双链体和杂交体。
[0038] 如本文使用的术语"可操作地连接的"指功能上相关的多核苷酸元件的连接。当 核酸置于与另一个核酸序列功能相关时，其是"可操作地连接的"。例如，如果其影响编码序 列的转录，则启动子或更确切地转录调节序列与编码序列可操作地连接。可操作地连接意 思是连接的DNA序列通常是邻接的，并且当必要时结合邻接的和读码框中的两个或多个蛋 白质编码区。
[0039] "植物"指完整植物或可从植物获得的植物的一部分，例如细胞、组织或器官（例如 花粉、种子、配子、根、叶、花、花蕾、花粉囊、果实等），以及这些的任何衍生物及通过自交或 杂交衍生自这类植物的后代。"植物细胞"包括分离物中或组织、器官或生物体之内的原生 质体、配子、悬浮培养物、小孢子、花粉粒等。
[0040] 如本文使用的术语"启动子"指核酸序列，其起控制一个或多个基因的转录的作 用，相对于基因的转录起始位点的转录方向位于上游，并且从结构上识别为存在DNA-依赖 性RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列，包括，但不限于转录因子结合 位点、遏制子或激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知直接或间接地调节从该启动子 转录的量的任何其它核苷酸序列。可选择地，术语"启动子"在本文中也包括5'UTR区（5' 非翻译区）（例如启动子在本文中可包括基因的翻译起始密码子的一个或多个上游部分 (5'），因为该区域可在调节转录和/或翻译方面有作用。"组成型"启动子是在大部分生理 和发育条件下在大部分组织中有活性的启动子。"可诱导的"启动子是生理地（例如通过外 部应用某些化合物）或发育调节的启动子。"组织特异性"启动子仅仅在特定类型的组织或 细胞中有活性。"植物或植物细胞中的启动子活性"指启动子在植物或植物细胞内驱动转录 的启动子的一般能力。其没做出有关于启动子的时空活性的任何暗示。
[0041] 术语"蛋白质"或"多肽"可互换地使用，并且指由氨基酸链组成的分子，与具体作 用方式、尺寸、3维结构或来源无关。因此，蛋白质的"片段"或"部分"仍然可以称为"蛋白 质"。"分离蛋白"用于指不再位于其自然环境中的蛋白质，例如位于体外或重组的细菌或植 物宿主细胞中。
[0042] "转基因植物"或"转化植物"在本文中指例如通过将非沉默突变引入内源基因或 其部分中而已经转化的植物或植物细胞。这样的植物已经遗传修饰，以例如在基因中引入 一个或多个突变、插入和/或缺失和/或在基因组中引入基因沉默构建物。转基因的植物 细胞可以指处于分离物或组织培养中的植物细胞，或者包含在植物或分化的器官或组织中 的植物细胞，这两种都可能性都明确地包括在本文中。因此，在说明书或权利要求书中提及 植物细胞不是仅指培养物中分离的细胞或原生质体，而且指任何植物细胞，无论其位于任 何位置，或在任何类型的植物组织或器官中。
[0043] 靶核苷酸交换（TNE)是一种方法，通过该方法一条与染色体或附加体基因中的位 点部分互补的合成寡核苷酸在特定位点引导单个核苷酸的逆转。已经描述了 TNE使用多种 寡核苷酸和祀标。一些报道的寡核苷酸是RNA/DNA嵌合体，含有末端修饰以赋予核酸酶耐 受性。
[0044] 如本文使用的术语"干旱胁迫"或"干旱"指与植物对水可获得性受限有关的次佳 (sub-optimal)环境条件。当例如不下雨或下雨少和/或当植物的灌溉常常比所需更少时， 可能出现水可获得性受限。当例如土壤中存在水但植物不能有效地吸取时，也可能出现植 物对水的可获得性受限。例如，当土壤强结合水时或水具有高含盐量时，植物可能更难从土 壤吸取水。因此，许多因素可能有助于导致植物的水可获得性受限，即干旱。植物经历"干 旱"或"干旱胁迫"的影响可能是植物不能具有最佳生长和/或发育。经历干旱的植物可具 有枯萎症状。例如，植物可以在其中不提供水（例如，没有降雨和/或灌溉植物）的特定控 制条件经历至少15天的时期。
[0045] 术语"改善的抗旱性"指当具有改善的抗旱性的植物经历干旱或干旱胁迫时，不会 显示如没有具有改善的抗旱性的对照植物中观察到的影响或显示减轻的影响。正常植物具 有一定水平的抗旱性。通过在所选控制条件下比较对照植物与具有改善的抗旱性的植物， 可容易地确定植物是否具有改善的抗旱性，因此，在一定时期之后，即当植物经历干旱或干 旱胁迫时，可以观察到对照植物干旱症状。与对照植物相比，具有改善的抗旱性的植物将 显示较少和/或减少的已经历干旱的症状，例如枯萎。本领域技术人员知道如何选择合适 的条件，例如像实施例中的控制条件。当植物具有"改善的抗旱性"时，经干旱或干旱胁迫 时能够持续正常生长和/或正常发育，否则将导致正常植物的生长减慢和/或发育减慢。 因此，"改善的抗旱性"是通过比较植物而确定的相对术语，其中在干旱胁迫下最能够持续 (正常）生长的植物是具有"改善的抗旱性"的植物。本领域技术人员熟知如何选择用于测 定植物抗旱性的合适条件和如何测量干旱症状，例如在例如如下提供的手册描述的：IRRI， Breeding rice for drought prone environments,Fischer等，2003,和CIMMYT,Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize ：from theory to practice, Banzinger 等，2000。Snow 和 Tingey，1985,Plant Physiol, 77,602-7,和 Harb 等，Analysis of drought stress in Arabidopsis，AOP 2010，Plant Physiology Review 中提供了用于 测定植物改善的抗旱性的方法的实例，并且如下述实施例部分中描述的。

【具体实施方式】
[0046] 本发明涉及一种通过修饰（例如破坏）植物中功能性果胶酯酶蛋白质的表达，例 如使用遗传修饰或靶核苷酸交换，调节（例如改善）所述植物的抗旱性的方法。调节（比如 改善）是相对于其中没有修饰功能性果胶酯酶蛋白质的表达的对照植物而言。换句话说， 与未修饰的植物相比，根据本发明修饰的植物能够在水可获得性减少、（暂时性）缺水或干 旱条件下较好地生长和存活。应当理解，根据本发明修饰（例如破坏）功能性果胶酯酶蛋 白质的表达可包括遗传修饰（例如遗传修饰果胶酯酶基因表达）或靶核苷酸交换。
[0047] 在实施方式中，本发明提供一种通过破坏植物中功能性果胶酯酶蛋白质的表达， 例如使用遗传修饰或靶核苷酸交换，改善所述植物的抗旱性的方法。
[0048] 遗传修饰包括在核酸序列中引入突变、插入、缺失和/或将基因沉默构造插入靶 向核酸序列的植物或植物细胞的基因组中。遗传修饰编码mRNA的核酸序列（例如基因） 不仅涉及修饰对应于mRNA序列的外显子序列，而且涉及使基因组DNA的内含子序列和/或 核酸序列的（其它）基因调节序列（例如基因）的突变。
[0049] 在实施方式中，功能性果胶酯酶蛋白质可以是如下蛋白质：当在具有被破坏 的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系，比如本文列举的At5gl9730敲除系，例 如 SALK_136556C(http://www. arabidopsis. org/servlets/SeedSearcher ? action = detail&stock_number = SALK_136556C)中表达时，产生与其中所述功能性果胶酯酶蛋白 质未表达的、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系（例如At5gl9730 敲除系，例如SALK_136556C)的抗旱性相比抗旱性受损的植物。
[0050] 如本文使用的术语"被破坏的内源性果胶酯酶基因"指被破坏（例如切断（例如利 用T-DNA插入所述果胶酯酶基因中的方式））植物基因组中天然存在的果胶酯酶基因。破 坏所述内源性果胶酯酶基因可以导致所述内源性果胶酯酶基因不表达。
[0051] 如本文使用的术语"对照植物"指相同种类的植物，优选相同种类，优选相同遗传 学背景的植物。然而，优选不存在向所述对照植物中引入修饰或修饰被引入所述对照植物 中。
[0052] 本发明还涉及通过修饰所述植物中功能性果胶酯酶蛋白质的表达而调节所述植 物的抗旱性。调节是相对于其中这种修饰没有被引入或不存在的对照植物（优选地相同遗 传学背景的植物）而言的。
[0053] 如本文使用的"使功能性果胶酯酶蛋白质的表达受损"可以指果胶酯酶基因的表 达受损，和/或果胶酯酶基因的表达正常但是得到的mRNA的翻译被抑制或阻止（例如，通 过RNA干扰），和/或果胶酯酶蛋白质的氨基酸序列改变使得优选地在生理条件下，尤其是 在相同的生理条件下，与包含如SEQ ID N0:2所述氨基酸序列的蛋白质的果胶酯酶比活性 相比，其果胶酯酶比活性降低。备选地，可通过使用（例如抗体或果胶酯酶抑制剂）清除 (scavenging)所述蛋白质而使果胶酯酶蛋白质变得功能很低或无功能。例如，特异性结合 所述果胶酯酶蛋白质的抗体可以同时表达，从而减小果胶酯酶蛋白质的比活性。如本文使 用的短语"功能性果胶酯酶蛋白质的表达受损"进一步涵盖通过提高果胶酯酶抑制剂（例 如，中止、阻止或降低果胶酯酶蛋白质的活性的蛋白质）的表达而清除功能性果胶酯酶蛋 白质。这样的果胶酯酶抑制剂的非限制性实例是基因 Atlg48020。备选地，可以使用化学果 胶酯酶抑制剂，例如可以被清除的离子、或金属、或果胶酯酶的辅因子，从而降低果胶酯酶 活性的可利用性。因此，该短语包括如下情形：其中果胶酯酶蛋白质以正常水平表达，但是 由于（可选地功能性）果胶酯酶蛋白质的清除的氨基酸序列的突变，与包含如SEQ ID N0:2 所示的氨基酸序列的果胶酯酶蛋白质相比，所述果胶酯酶蛋白质没有活性或活性降低。
[0054] 果胶酯酶催化果胶脱酯化为果胶酸盐和甲醇。果胶是植物细胞壁的主要组分之 一。如果相对于这样的果胶酯酶的果胶的脱酯化而言的比活性统计学显著地低于如SEQ ID N0:2所述果胶酯酶的比活性，则可以认为该果胶酯酶蛋白质的比活性"降低"。果胶酯酶蛋 白质的比活性可以降低，例如至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 或更多。可以通过例如使用靶核苷酸交换来改变启动子序列，实现植物的内源性果胶酯酶 基因的表达减少。
[0055] 本领域技术人员能够确定果胶酯酶的比活性。例如，可以通过如Tucker等 (Tucker GA，等人（1982). J Sci Food Agric 33 396 - 400)所述的滴定确定 PE 酶活性。
[0056] 本发明人相信由于低表达，例如用RNA干扰，或者由于果胶酯酶蛋白质的活性/功 能性降低的结果，或上述一种或多种，破坏功能性果胶酯酶蛋白质的表达（例如，通过表达 和/或活性的降低、抑制或缺失）导致功能性果胶酯酶蛋白质不存在或水平降低，并且所述 功能性果胶酯酶蛋白质不存在或水平降低导致所述植物对水的需要减少或抗旱性的改善。 [0057] 拟南芥的果胶酯酶蛋白质由383个氨基酸（氨基酸序列在SEQ ID N0:2中描述）。 由拟南芥的果胶酯酶基因衍生的cDNA包含1149个核苷酸，并且在SEQ ID NO: 1中描述其 核酸序列。
[0058] 如本文使用的"果胶酯酶蛋白质"指包含SEQ ID N0:2中所述的氨基酸序列的蛋白 质、及其片段和变体。果胶酯酶蛋白质的变体包括，例如（优选地在全长上）与SEQ ID N0:2 的氨基酸序列具有至少 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高，比如100%的氨基酸序列同一性的蛋白质。使用如上定义的Needleman 和Wunsch算法及GAP缺省参数，通过双序列比对确定氨基酸序列的同一性。可使用如上 定义的Needleman和ffunsch算法及GAP缺省参数，通过双序列比对确定氨基酸序列的同一 性。
[0059] 在另一个方面，提供一种用于增强植物抗旱性的方法，所述方法包括破坏所述植 物中编码果胶酯酶蛋白质的基因的表达的步骤。
[0060] 根据本发明"基本表达受损"指功能性果胶酯酶蛋白质不存在或存在减少。本领域 技术人员熟知本领域其可获得许多机制以（例如转录水平或翻译水平）破坏基因的表达。
[0061] 转录水平的破坏可能是在转录调控序列（包括启动子、增强子、起始子、终止子或 内含子剪切序列）中引入一个或多个突变的结果。这些序列通常位于根据本发明的果胶酯 酶基因的编码序列的5'、3'或该编码序列内。也可以通过基因编码区中核苷酸的缺失、取 代、重排或插入独立地或同时地提供表达的破坏。
[0062] 例如，在编码区中，核苷酸可以被取代、插入或缺失，导致引入一个、两个或更多个 过早（premature)终止密码子。而且，插入、缺失、重排或取代可以导致编码的氨基酸序列 中的修饰，从而提供功能性果胶酯酶蛋白质的受损表达。甚至更大部分的基因可以被移除， 例如至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或者甚至100%的基因（编码 区）被从植物中存在的DNA中移除，从而破坏功能性果|父醋酶蛋白质的表达。
[0063] 备选地，可以将一个、两个、三个或更多个核苷酸引入编码果胶酯酶蛋白质的一个 或多个基因中，其导致例如移码，或导致引入编码另外的氨基酸的序列，或引入不编码氨基 酸的序列，或引入大的插入片段，从而破坏功能性果胶酯酶蛋白质的提供/表达。
[0064] 换句话说，如上所述编码果胶酯酶蛋白质的核苷酸序列中核苷酸的缺失、取代或 插入可导致例如移码、引入终止密码子、或引入无义密码子。特别地，通常接受引入终止密 码子和引入移码突变作为有效的方式，以产生敲除种植，即具有特定蛋白质的表达和/或 活性降低、被抑制或缺失的敲除植物的有效方式。
[0065] 移码突变（也称为框架错误或阅读框移位）是一种由核苷酸序列中不能被3可整 除的大量核苷酸的indel (插入或缺失）导致的遗传突变。由于基因表达利用密码子的三 联体性质，插入或缺失可改变读码框（密码子组），导致与原始完全不同的翻译。序列中缺 失或插入发生的越早，生成蛋白质的改变越多。移码突变通常将导致对突变之后密码子的 阅读，以编码不同的氨基酸，但是可能存在由遗传密码冗余造成的例外。此外，原始序列中 终止密码子（"UAA"、"UGA"或"UAG"）不会被阅读，替代的终止密码子可产生较早或更迟 的终止位点。产生的蛋白质可异常短或异常长。
[0066] 在编码如本文定义的果胶酯酶蛋白质的核苷酸序列中引入终止密码子可导致转 录过早终止，其通常产生缩短的、不完整的或无功能的果胶酯酶蛋白质。优选地，最初在转 录方向引入终止密码子。在核苷酸序列中引入终止密码子越早，生成蛋白质越短，并且改变 越多。在编码果胶酯酶蛋白质的核苷酸序列中引入无义密码子可产生转录mRNA，其中，例如 一个密码子不再编码果胶酯酶中天然存在的氨基酸，例如通常编码果胶酯酶蛋白质的功能 必要的氨基酸的密码子。因此，这样的果胶酯酶蛋白质可能没有功能。
[0067] 换句话说，破坏可包括使本文公开的基因或核酸序列中的一个或多个核苷酸突 变，导致蛋白质表达产物较少或甚至完全不存在（即，不存在当没有如上述修饰的根据本 发明的基因时将获得蛋白质），或导致存在无功能的蛋白质。
[0068] 因此，在本文公开的方法的实施方式中，破坏是所述果胶酯酶基因中一个或多个 突变的结果，导致与对照植物相比较少的蛋白质表达产物的存在或不存在蛋白质表达产 物。
[0069] 如本文使用的术语较少的蛋白质表达产物的抑制/存在指与其中表达未受损的 对照植物相比，蛋白质表达降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 甚至99%。术语"蛋白质表达不存在"指实际上不存在任何表达产物，例如与对照相比少于 5%、4%、3%、2%或甚至少于1%。
[0070] 如本领域技术人员理解，通过使用诱变化合物（例如甲磺酸乙酯（EMS)或能够在 核苷酸序列中（随机）引入突变的其它化合物）也可以在编码如本文定义的果胶酯酶的核 苷酸序列中引入突变。所述诱变化合物或所述其它化合物可用作产生具有在编码果胶酯酶 蛋白质的核苷酸序列中的突变的植物的工具。
[0071] 备选地，在编码根据本发明的果胶酯酶蛋白质的核苷酸序列中引入的突变可受 在编码这样的蛋白质的核苷酸序列中引入的转移-DNA(T-DNA)的影响，例如某些细菌 种属（例如根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens))的肿瘤-诱导（Ti)质粒的 T-DNA。T-DNA元件可以被引入所述核苷酸序列中，产生无功能的蛋白质或蛋白质的表达缺 失，因此减小了根据本发明的方法获得的植物对水的需要（参见例如Krysan等，1999The Plant Cell, Vol 11. 2283?2290)。使用转座因子插入可以获得同样的优点（参见，例 如 Kunze 等，（1997)Advances in Botanical Research 27 341-370 or Chandlee(1990) PhysiologiaPlanta79(l)105?115)。
[0072] 实施方式中，可通过TNE进行在编码根据本发明的蛋白质的核苷酸序列中突变的 引入，例如像W02007073170中所述。通过使用TNE，可以改变编码果胶酯酶的核苷酸序列中 的特定核苷酸，由此，例如可以引入终止密码子，其可例如产生编码具有果胶酯酶活性降低 或消失的缩短的蛋白质的核苷酸序列。
[0073] 在另一个实施方式中，提供一种如上面公开的方法，其中功能性果胶酯酶蛋白质 的表达破坏是通过无功能的蛋白质或具有减小的功能的蛋白质表达引起的。如上述，本领 域技术人员在确定根据本发明的基因的功能性方面没有问题。例如，可以通过将没有任何 修饰的对照基因引入其中根据本发明的蛋白质的表达已经受损植物中进行补充研究，并且 研究抗旱性。
[0074] 备选地，可以进行类似于如下实施例中所述实验的实验，并通过与合适的对照/ 野生型植物相比较，测定其中将一个或多个突变引入根据本发明的基因中的植物的抗旱 性。
[0075] 也可以在翻译水平提供破坏，例如通过引入过早终止密码子或通过影响（例如蛋 白质折叠的）的翻译后修饰。
[0076] 与机制无关，通过功能性果胶酯酶蛋白质不存在或存在减少而表示根据本发明的 破坏，包括存在正常水平的无功能的（dysfunctional)果胶酯酶。
[0077] 如上面解释，如本文使用的术语表达抑制或存在减少指与其中表达未受损的对照 植物相比，蛋白质表达降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至 99%。术语"蛋白质表达不存在"指实际上不存在任何表达产物，例如与对照相比少于5%、 4%、3%、2%或甚至少于1%。
[0078] 根据另一个实施方式，所述破坏是由基因沉默引起的，例如RNA干扰或RNA沉默。
[0079] 借助于本领域技术人员容易获得的分子生物学方法，基因的破坏也可以通过基 因沉默实现，例如使用RNA干扰技术、dsRNA或其它表达沉默技术（参见例如，Kusaba等， (2004)Current Opinion in Biotechnology 15:139 - 143,或Preuss and Pikaard(2003) in RNA Interference (RNAi)?Nuts&Bolts of siRNA Technology (pp. 23-36)，?2003 by DNA Press，LLC Edited by:David Engelke，Ph.D.)或，如上已经讨论的敲除。
[0080] 在另一个优选的实施方式中。且如上已经讨论的，提供一种根据本发明的方法，其 中所述破坏是由至少一个核苷酸的插入、缺失和/或取代引起的。例如，在根据本发明的基 因中可以插入、缺失或取代1、2、3...10、40、50、100、200、300、1000或甚至更多的核苷酸。还 预期所述基因的编码区或非编码区中插入、缺失和/或取代的组合。
[0081] 在本文公开的方法的另一个实施方式中，所述方法包括破坏所述植物中编码果胶 酯酶蛋白质的超过1个、例如2、3、4、5或所有基因的表达的步骤。
[0082] 在该实施方式中，如上所述存在于具体植物中超过一个基因的表达受损。例如，存 在于植物中的编码果胶酯酶蛋白质的一个、两个、三个、四个或所有基因的表达受损。通过 同时破坏上述多个基因（当植物中存在时）的表达，可以获得更加改善的抗旱性。
[0083] 在另一个实施方式中，根据本发明的方法提供的植物可用于生产其它植物和/或 由其衍生的植物产品。术语"植物产品"指可以从生长的植物获得的那些材料，并且包括压 碎的、磨碎的或仍完整的、与其它材料混合的、干燥的、冷冻等的果实、叶子、植物器官、植物 脂肪、植物油、植物淀粉、植物蛋白质级分。通常，如上述，可通过例如本文所公开的修饰为 使功能蛋白的表达受损的基因的存在识别这样的植物产品。
[0084] 优选地，在属于十字花科（包括甘蓝型油菜（油菜籽）、茄科（包括番茄）、或葫芦 科（包括甜瓜和黄瓜）、或禾本科（包括稻属（包括稻）或玉米属（包括玉蜀黍（玉米）））、 或豆科（包括豆类、豌豆或菜豆）的植物中，根据本发明的果胶酯酶蛋白质的表达和/或活 性受损（例如降低、抑制或缺失）。优选地，根据本发明的方法应用于番茄、稻、玉蜀黍、甜瓜 或黄瓜，从而提供与相应的对照植物相比具有对水的需求减小或抗旱性改善的植物。
[0085] 还提供通过根据本发明的方法可获得的植物细胞、植物或其衍生的植物产品，其 中所述植物细胞、植物或植物产品显示与没有经根据本发明的方法的对照植物相比功能性 果胶酯酶蛋白质的表达降低。
[0086] 还提供植物细胞、植物或其衍生的植物产品，特征在于在所述植物细胞、植物或 其衍生的植物产品中，编码果胶酯酶蛋白质的至少一个（优选所有）基因的表达受损，例 如对应于从所述至少一个基因转录的mRNA序列的cDNA序列包括SEQ ID NO: 1所示序列， 和与SEQ ID N0:1的核苷酸序列具有超过40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%同一 性的cDNA序列，和/或其中由所述至少一个基因编码的氨基酸序列包含SEQ ID N0:2所 示序列或其变体。优选地，所述植物不是如下实施例中所述的拟南芥突变体或短柄草属 (Brachypodium) T-DNA 插入突变体。
[0087] 在另一个方面，本发明涉及如下基因用于向植物提供增强抗旱性的用途：其中对 应于从所述基因转录的mRNA序列的cDNA序列包含SEQ ID NO: 1所示的序列，和与其具有 超过40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%同一性的〇0嫩序列和/或其中由所述基因编 码的氨基酸序列包含SEQ ID N0:2所示序列，和与其具有超过40%、50%、60%、70%、80%、 90^^95%同一性的氨基酸序列。
[0088] 在该实施方式中，根据本文公开的内容，所述基因可用作改善植物抗旱性的靶标， 或者所述基因可用于鉴别参与干旱敏感性和抗性的新的蛋白质。
[0089] 在另一个实施方式中，提供具有拟南芥种属的SEQ ID No. 1或2的果胶酯酶序列 在拟南芥植物抗旱性筛选中的用途。另外，提供其中果胶酯酶序列为与其它植物种属的SEQ ID No. 1或2类似的序列并且其中在其它植物种属的植物中筛选的用途。此外，提供用于筛 选具有改善的抗旱性的植物或植物细胞的方法，所述方法包括步骤：
[0090] -提供拟南芥种属的植物细胞或植物的异质种群；
[0091] -提供具有SEQ ID No. 1或2的果胶酯酶序列；
[0092] -测定所述植物细胞或植物的果胶酯酶基因的至少一部分的序列；
[0093] -比较由所述植物细胞或植物测定的果胶酯酶序列与提供的果胶酯酶序列；
[0094] -鉴别其中果胶酯酶序列包括突变的植物细胞或植物。
[0095] 备选地，在该方法中，提供的植物细胞或植物属于其它种属，并且其中提供的果胶 酯酶基因序列为其它种属的相似序列。
[0096] 因此，通过使用拟南芥物种的果胶酯酶序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2或来自其 它物种的相似序列，可以鉴别可提供改善的抗旱性的植物物种中突变的物种序列。在其它 物种中与物种拟南芥的果胶酯酶序列SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的相似序列定义为与其 具有至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少99%序列同一性的序 列。相似的果胶酯酶蛋白质可以具有与SEQ ID No. 2基本上相同的功能。在序列表的SEQ ID N0 :3?10中描述相似序列，并且分别来源于芜菁、番茄和水稻。它们与SEQ ID N0:2相 比较的序列同一性列在下表2中说明。
[0097] 在该方法中，提供所述种属的植物细胞或植物的异质种群。所述异质种群可以例 如通过如下提供：使植物细胞接受引入随机突变的诱变剂，从而提供植物细胞的异质种群。 因此，所述异质种群可以来源于单个植物品种，其接受随机诱变以便后代获得多种突变，从 而提供异质种群。许多诱变剂是本领域已知的，例如离子辐射、UV-射线、和诱变化学物（例 如叠氮化物、溴化乙锭或甲磺酸乙酯（EMS))。因此，本领域技术人员知道如何提供植物或植 物细胞的异质种群。而且，本领域技术人员也可提供多种植物作为异质种群，即来自多个种 属的非单一品种。多种植物显示遗传多样性，它们遗传上是不同的，但是因为植物来自同一 种属，所以它们是基本上相同的。在任何情况下，植物细胞或植物的异质种群可以具有至少 95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或至少 99. 9%的序列同一性。
[0098] 通过测定含有来自异质种群的植物或植物细胞的序列的果胶酯酶基因序列的至 少一部分序列，然后比较这些序列与提供的果胶酯酶基因序列（对照），可以鉴别包括果胶 酯酶基因序列突变的植物细胞或植物。应理解，可以通过序列的比对进行这样的比较，并且 突变为在植物种属的相似（对照）果胶酯酶序列中至少一个核酸或氨基酸位置的不同。这 样，鉴别具有可以提供改善的抗旱性的果胶酯酶基因突变（例如，插入、缺失、取代）的植物 或植物细胞。
[0099] 优选地，选择具有将导致功能性果胶酯酶蛋白质的表达破坏的突变的植物，例如 上述已经列举的。将破坏功能性果胶酯酶蛋白质表达的突变可以是如下突变：破坏开放读 码框（引入移码或终止密码子），或通过改变编码蛋白质的正常功能必需的氨基酸的密码 子中核苷酸来破坏或以其它方式改变编码蛋白质功能，从而导致与非改变的蛋白质相比对 干旱的抗性改善（例如增强）。该方法也可用于例如筛选和选择已经经靶向上述果胶酯酶 基因序列的遗传修饰的植物。而且，所述果胶酯酶序列也可用于筛选检测其中经历干旱的 植物的（异基因）种群。
[0100] 在另一个实施方式中，提供具有拟南芥种属的SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的果 胶酯酶序列的至少一部分作为培育抗旱拟南芥植物的标记物的用途。而且，所述果胶酯酶 序列可以是其它种属的相似序列，其中所述标记物用于培育其它种属的抗旱植物。
[0101] 本发明还涉及其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达受损的植物、植物细胞或植物产 品用于在干旱胁迫条件下生长的用途，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白质：当 在具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其得到与其中所述 功能性果胶酯酶蛋白质未表达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插 入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物，其中所述干旱胁迫条件引起其中所述功能性果胶酯 酶蛋白质的表达未受损的对照植物、植物细胞或植物产品比其中功能性果胶酯酶蛋白质的 表达被破坏的植物、植物细胞或植物产品更早地显示干旱胁迫症状，例如枯萎症状。
[0102] 在一个方面，本发明涉及通过本文教导的方法可获得的或获得的植物、植物细胞 或植物产品。另外，本发明提供来源于这样的植物的种子。
[0103] 本发明还涉及其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达被破坏的植物、植物细胞或植物 产品，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白质：当在具有被破坏的内源性果胶酯酶 基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质未表达。所述植物、 植物细胞或植物产品可以包括例如被破坏的内源性果胶酯酶基因。
[0104] 所述植物、植物细胞或植物产品可以是任何植物或植物细胞，或者可以来源 于任何植物，例如单子叶植物或双子叶植物，但是所述植物最优选属于茄科。例如， 植物可以属于爺属（包括番爺属（lycopersicum))、烟草属、辣椒属、碧冬爺属及其它 属。可合适地使用下述宿主：烟草（烟草种，例如本生烟草（N. Benthamiana)、皱叶烟草 (N.Plumbaginifolia)、普通烟草（N.Tabacum)等）、蔬菜种（例如番爺（例如，如搜桃番 爺变种cerasiforme或醋栗番爺变种pimpinellifolium、或树番爺（S. betaceum，同种异 名 Cyphomandra betaceae))、马铃暮（Solanum tuberosum)、爺子（Solanum melongena)、 爺瓜（Solanum muricatum)、可可果(Solanum sessiliflorum)和奎东爺(Solanum quitoense)、辣椒类（甜椒（Capsicum annuum)、小米椒（Capsicum frutescens)、风铃辣椒 (Capsicum baccatum))、观赏物种（例如，矮牵牛（Petunia hybrida)、肢花矮牵牛（Petunia axillaries)、匍匍性青紫矮牵牛（P. integrifolia))。
[0105] 备选地，所述植物可以属于任何其它科，例如葫芦科或禾本科。合适的宿主植物包 括例如玉米/谷类（玉蜀黍种（Zea species))、小麦（小麦种（Triticum species))、大麦 (例如大麦（Hordeum vulgare))、燕麦（例如燕麦）、高粱（高粱（Sorghum bicolor))、黑 麦（黑麦（Secale cereale))、大豆（野生大豆属种（Glycine spp)，例如大豆（G.max))、棉 花（棉属种（Gossypium species),例如陆地棉（G.hirsutum)、海岛棉（G.barbadense))、 芸苔属种（Brassica spp.)(例如，甘蓝型油菜（Β· napus)、芥菜（Β· Juncea)、甘蓝 (B. Oleracea)、芜菁（B. Rapa)等）、向日葵（Helianthus annus)、红花、山药、木薯、紫花苜 猜（Medicago sativa)、稻（稻属种（Oryza species)，例如籼稻栽培种（O.sativa indica (31111：；^31-81'0即）或粳稻栽培种（]_3口011；[0301111：；^31-81'0即)）、饲料草、珍珠稗（狼尾草 属种（Pennisetum spp·)，例如珍珠栗（P.glaucum))，树种（松属（Pinus)、杨树、冷杉、车 前草（plantain)等）、茶树、咖啡树、油棕、椰树，蔬菜种例如豌豆、西葫芦、豆类（例如菜豆 属种（Phaseolus species))、黄瓜、朝鲜蓟、芦笋、西兰花、大蒜、韭菜、莴苣、洋葱、萝卜、芜 菁、抱子甘蓝、胡萝卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠菜、菊苣、茴香、甜菜）、结肉质果植物（葡萄、 桃子、李类（plums)、草莓、芒果、苹果、李树（plum)、搜桃、杏、香蕉树、黑莓、越橘、柑橘、猕 猴桃、无花果、柠檬、酸橙、油桃、覆盆子、西瓜、橙子、葡萄柚等）、观赏物种（例如，玫瑰花、 矮牵牛花、菊花、百合、大丁草属种）、草本类（薄荷、欧芹、罗勒、百里香、等）、木本树（例 如，杨属种、柳属种、栎属种、桉属种）、纤维物种例如亚麻（Linum usitatissimum)和大麻 (Cannabis sativa)、或者模式生物（例如拟南芥）。
[0106] 优选的宿主是"作物植物"，即人类种植和培育的植物物种。可以种植作物植物用 于食物目的（例如田间作物）、或用于观赏目的（例如，产生用于切枝的花、用于草坪的草 等）。如本文定义的作物植物也包括从其中收获非食用产物的植物，例如用于燃料的油、塑 料聚合物、药物制品、软木等。
[0107] 优选地，本发明的植物、植物细胞或植物产品不是拟南芥或芜菁植物、植物细胞或 植物产品。
[0108] 本发明的植物、植物细胞或植物产品可以为例如番茄或芜菁植物、植物细胞或植 物产品。
[0109] 例如，本发明涉及其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达受损的番茄、陆地棉、大豆、 小麦属植物、大麦、燕麦、高粱、黑麦或甘蓝型油菜植物、植物细胞或植物产品，其中所述 功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白质：当在具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的拟南芥 T-DNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性果胶酯酶蛋白质未表达、具有被破坏的内 源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。所述番 茄、陆地棉、大豆、小麦属植物、大麦、燕麦、高粱、黑麦或甘蓝型油菜植物、植物细胞或植物 产品可以包含被破坏的内源性果胶酯酶基因。
[0110] 文中列举的所有文献的全部内容均通过引用合并于此。
[0111] 实施例
[0112] 实施例1干旱实骑
[0113] 从诺 丁汉拟南芥种子中心（NASC ;School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE12 5RD United Kingdom)获得用 根癌土壤杆菌载体PR0K2转化拟南芥（At)种子产生的功能性果胶酯酶蛋白质缺失的（NASC ID:N664100, AGI代码At5gl9730和SALK_136556C ;下文称为突变体种子或突变体植物）。 使用At Col-0 (Columbia, N60000)作为对照；下文称为对照种子或植物。
[0114] 生长培养基：
[0115] 使用包含一份沙和蛭石与两份堆肥的土壤混合物（沙：蛭石：堆肥=1:1:2)。该 混合物增加水渗透，因此促进每个盆均匀的水吸收和更好的排水。在播种之前，将种子在黑 暗湿润的条件下于4°C下保持3天，进行层积处理。
[0116] 将突变体和对照种子都种在含有?4cm直径的8X5 = 40个盆的长方形盘中，每 个盆的密度为5株植物。在发芽（DAG)之后10天，从盘中盆的底部向所有植物提供营养液 (EC = 1. 5)，并且在15DAG，通过将盆转移到干的盘中而使植物经历干旱（15、16、17或18 天）。然后，给植物加水，1周后观察植物恢复。
[0117] 在预干旱筛选中，包括每个基因型三个盆平行测定。完成实验所需的总时间约为 36?39天。
[0118] 干旱测定检查
[0119] 一旦植物达到2个真叶阶段，将其间苗保持严格每个盆5株植物。在10DAG，植物 接受营养物（EC = 1. 5)，并且在15DAG，将每个盆转移到干的盘。从这一天起，植物不再接 受任何水。每天，观察植物，尤其是对照（或野生型）（Col-Ο)的枯萎症状。在干旱（D0D) 第15天时，Col-Ο完全枯萎，并且加水时不能恢复。将这一天确定为其永久枯萎点（PWP)。 从这一天起，向突变体的一个平行测定加水，观察恢复症状，并照相。与对照相比，突变体显 示在干旱下多存活至少2天，并使其经进一步严格的筛选。
[0120] 实施例2干旱实骑
[0121] 生长培养基：
[0122] 在预筛选实验中，将与实施例1中相同的突变体和对照植物种植在如上所述类似 的盘装置中。通过从15DAG中断供水而使植物受胁迫，直到对照植物达到其PWP。在该期 间，每隔一天，将各盆在盘内随机摆放（shuffled)，以减少位置效应且允许均匀蒸发。在第 1OT0D天，对照植物达到PWP，并且当加水时没有恢复。从15D0D开始，每天给来自突变体的 一个盆平行测定加水，并检查干旱胁迫恢复。照相，并对恢复情况评分。突变体显示在对照 达到其PWP之后至少3天以上才从干旱胁迫恢复。
[0123] 图1显示比较突变体和对照的图片，表明与对照相比，突变体关于对干旱胁迫的 抗性的优异效果。
[0124] 实施例3干旱实骑
[0125] 材料和方法
[0126] 植物材料.从诺丁汉拟南芥种子中心（NASC)获得具有被破坏的AT5G19730(果 胶酯酶）基因（SALK_136556C)的TDNA插入系。通过使用浸花法转化（floral dip transformation)稳定地转化拟南芥产生互补系（Bent等人，2006. Methods Mol. Biol. Vol. 343:87-103)。由包括芜菁（甘蓝）、番爺（tomato)和水稻（Oryza sativa，rice)和 模型种拟南芥的几种作物种类鉴别拟南芥（AT5G19730)果胶酯酶基因的同系物。
[0127]

【权利要求】
1. 用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植 物、植物原生质体或植物细胞中功能性果胶酯酶蛋白质表达的步骤，和可选择地再生所述 植物，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质包含与SEQ ID. No. 2的氨基酸序列具有至少55%同 一性的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白质：当在 具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其产生与其中所述功 能性果胶酯酶蛋白质未表达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插入 系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。
3. 用于生产具有与对照植物相比改善的抗旱性的植物的方法，所述方法包括破坏植 物、植物原生质体或植物细胞中功能性果胶酯酶蛋白质表达的步骤，和可选择地再生所述 植物，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质由包括具有与SEQ ID NO: 1的核酸序列至少60%同 一性的核酸序列的核酸序列编码。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白质：当在 具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其产生与其中所述功 能性果胶酯酶蛋白质未表达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插入 系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。
5. 根据权利要求1?4中任一项所述的方法，其中所述破坏表达的步骤包括使编码所 述功能性果胶酯酶蛋白质的核酸序列突变。
6. 根据权利要求5的方法，其中使所述核酸序列突变包括至少一个核苷酸的插入、缺 失和/或取代。
7. 根据权利要求1?6中任一项所述的方法，其中所述破坏表达的步骤包括基因沉默。
8. 根据权利要求1?7中任一所述的方法，其中，所述方法包括破坏两种或更多种功能 性果胶酯酶蛋白质表达。
9. 根据权利要求1?8中任一项所述的方法，所述方法进一步包括由具有改善的抗旱 性的植物生产植物或植物产品的步骤。
10. 与SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有至少55%同一性的氨基酸序列或与SEQ ID N0:1 的核酸序列具有至少60%同一性的核酸序列在植物抗旱性筛选中的用途。 11. SEQ ID NO: 2的果胶酯酶氨基酸序列或SEQ ID NO: 1的果胶酯酶核酸序列在拟南芥 植物抗旱性筛选中的用途。
12. 具有SEQ ID NO: 1的果胶酯酶核酸序列的至少一部分或SEQ ID NO:2的果胶酯酶 氨基酸序列的至少一部分作为培育抗旱性拟南芥植物的标记物的用途。
13. 如权利要求1?4中任一项所定义的功能性果胶酯酶蛋白质用于调节、优选地增强 植物抗旱性的用途。
14. 其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达受损的植物、植物细胞或植物产品用于在干旱 胁迫条件下生长的用途，其中所述功能性果胶酯酶蛋白质为如下蛋白质：当在具有被破坏 的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达时，其产生与其中所述功能性果胶酯 酶蛋白质未表达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的所述拟南芥T-DNA插入系的抗旱性 相比抗旱性受损的植物，其中所述干旱胁迫条件引起其中所述功能性果胶酯酶蛋白质的表 达未受损的对照植物、植物细胞或植物产品比其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达被破坏的 植物、植物细胞或植物产品更早地显示的干旱胁迫症状，例如枯萎症状。
15. 其中功能性果胶酯酶蛋白质的表达被破坏的番茄、陆地棉、大豆、小麦属植物、大 麦、燕麦、高粱、黑麦或甘蓝型油菜植物、植物细胞或植物产品，其中所述功能性果胶酯酶蛋 白质为如下蛋白质：当在具有被破坏的内源性果胶酯酶基因的拟南芥T-DNA插入系中表达 时，其产生与其中所述功能性果胶酯酶蛋白质未表达、具有被破坏的内源性果胶酯酶基因 的所述拟南芥T-DNA插入系的抗旱性相比抗旱性受损的植物。
16. 根据权利要求15所述的番爺、陆地棉、大豆、小麦属植物、大麦、燕麦、高粱、黑麦或 甘蓝型油菜植物、植物细胞或植物产品，包含被破坏的内源性果胶酯酶基因。
【文档编号】A01H5/00GK104204208SQ201380009865
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年2月18日 优先权日:2012年2月17日
【发明者】安妮·德斯莱特斯·梅斯, 玛丽克·海伦娜·阿德里安娜·范·赫尔滕, 希塔尔·阿尼尔库马尔·迪克西特, 马丁·德·福斯, 杰斯·大卫·蒙克沃尔德, 马修·维塔比莱·迪莱奥 申请人:凯金公司