用于储存和运输nk-92细胞系的方案和培养基的制作方法
【专利摘要】本文中描述了用于运输NK-92细胞的储存培养基，其包含：人血清、约200IU/mL的IL-2、和一定密度的未辐照的NK-92细胞，所述NK-92细胞在递送至治疗场所时足以提供治疗量的NK-92细胞，其中所述培养基的温度维持在20℃至40℃之间的选定温度的±5℃内，使得所述NK-92细胞在放入储存培养基中以后多达至少24小时的时段内保持存活以施用给患者。也描述了运输NK-92细胞的方法，使得所述NK-92细胞在放入储存培养基中以后多达至少24小时的时段内保持存活以施用给患者。
【专利说明】用于储存和运输NK-92细胞系的方案和培养基
【技术领域】
[0001] 本发明涉及NK-92细胞的储存和运输，使得所述细胞保持存活以用于施用给患 者，例如，在放入储存培养基中以后存活至少24小时的时段。
【背景技术】
[0002] 免疫系统的某些细胞对特定靶细胞具有细胞毒性活性。天然杀伤（NK)细胞(通常 占循环淋巴细胞的约10-15%)会结合和杀死靶细胞，包括病毒感染的细胞和许多恶性细胞， 就抗原而言是非特异性的，且没有先前免疫致敏。Herberman等人，Science214:24 (1981)。 靶细胞的杀死通过诱导细胞裂解而发生。已经证实，NK细胞在具有晚期癌症的患者的 离体疗法和体内治疗中都是有效的。但是，内源NK细胞（即，从供体或从患者收获的那 些）仍然难以起作用和应用于免疫疗法。难以离体繁殖维持它们的体内靶向肿瘤能力、 杀肿瘤能力和杀病毒能力的NK细胞，这是它们在过继细胞免疫疗法中的临床应用的主 要障碍。Melder,等人，Cancer Research48:3461-3469 (1988); Stephen,等人，LeuL Lymphoma377-399(1992);Rosenberg，等人，New Engl. J.Med. 316:889-897(1987)。此外， 内源NK细胞的制品包括，如果使用NK细胞来治疗与供体无关的患者则必须除去的T细胞 和/或其它免疫效应细胞。
[0003] 本文中描述的实施方案一般地涉及用于运输和/或递送NK-92细胞的储存培养 基，以及涉及运输和使用运输的NK-92细胞的方法。
【发明内容】
[0004] NK-92细胞系是一种被发现在有白介素2(IL-2)存在下会繁殖的独特细胞系。 Gong等人，Leukemia8:652-658 (1994)。这些细胞对多种癌症具有高细胞裂解活性。NK-92 细胞系是具有宽抗肿瘤细胞毒性的均匀NK细胞群体，在繁殖以后具有可预测的产率。I期 临床试验已经证实了它的安全性谱，并且已经观察到在某些具有晚期癌症的患者中的抗肿 瘤应答。
[0005] 用NK-92细胞治疗患者的一种限制是，在长时间段内储存和/或运输所述细胞的 能力。在患者疗法中使用的NK细胞必须维持在当前良好制备规程（cGMP)下，由此限制可 以培养和制备NK-92细胞系的场所的数目。迄今为止，NK-92细胞在患者疗法中的应用已 经受限于非常邻近要在其中进行治疗的医院的培养和生产场所的可用性；现在在邻近医院 的场所中制备NK-92细胞，然后携带至医疗队用于治疗患者。目前，冷冻的NK-92细胞在解 冻后表现出急剧下降的细胞毒性。即使在几天的培养恢复期以后，NK-92细胞数目和细胞 毒性仍然是次优的。
[0006] 迄今，对内源NK细胞的研究已经指示，IL-2(1000IU/mL)对于运输过程中的NK细 胞活化是至关重要的，但是所述细胞不需要维持在37°C和5%二氧化碳下。Koepsell,等 人，Transfusion53:398-403(2013)。但是，内源NK细胞显著不同于NK-92细胞，这主要是 由于它们的不同起源：NK-92是癌症衍生的细胞系，而内源NK细胞收获自供体（或患者） 并在加工后用于输注进患者中。内源NK细胞制品似乎异质细胞群体，而NK-92细胞是均匀 的克隆细胞系。NK-92细胞在维持细胞毒性的同时可容易地培养繁殖，而内源NK细胞却不 能。另外，内源NK细胞的异质群体不会以高密度聚集。因此，在储存和/或运输这2种细 胞类型以后，生存力和细胞毒性的最大化需要非常不同的考虑。
[0007] NK-92细胞存在其它问题。例如，NK-92需要IL-2的存在才能保持存活和繁殖， 并且会在少至llU/mL的IL-2中繁殖。Gong，等人.出处同上。此外，细胞形态学和/或 表型随着在培养基中使用的IL-2的量而变化。Gong，等人.出处同上。例如，IL-2受体 (⑶-25)表达与IL-2浓度成反比。Gong,等人·出处同上。
[0008] 更进一步，在高浓度的NK-92细胞聚集会消极地影响它们在治疗患者中的应用。 这会产生困难，因为在没有IL-2存在下，NK-92细胞会丧失生存力，而在有IL-2存在下，所 述细胞会繁殖。实际上，在正常细胞培养条件下，NK-92细胞的数目在约26-32小时内倍增。 该困难被下述事实进一步复杂化：储存培养基必须能够允许在NK-92细胞放入储存培养基 中以后多达至少24小时内运输至医院。为了防止在运输过程中的聚集，必须考虑在任何给 定IL-2浓度下的NK-92细胞增殖速率。
[0009] 例如至少约24小时的时间范围允许将所述细胞放入储存培养基中，运输至医院， 然后实现适当操作以将NK-92细胞注射进患者中。一旦NK-92细胞到达医院（或其它治 疗场所），将它们洗涤并转移进适合于注射进患者中的溶液，例如，磷酸盐缓冲盐水（PBS)。 也辐照NK-92细胞以防止体内增殖。尽管将辐射剂量设计成维持细胞毒性，它会不利地影 响细胞的生存力。因此，重要的是，用于运输的储存培养基会在尽可能最大的程度上维持 NK-92细胞生存力，以便在转化成可用于治疗的形式的过程中使细胞群体的降解最小化。 [0010] 因此，需要用于运输NK-92细胞系的储存培养基，使得所述细胞可以在中心场所 培养和制备，并分配至遥远医院或其它治疗场所，用于在接收后不久治疗患者。该需要包括 这样的方法：所述方法会在储存和/或运输过程中维持NK-92细胞生存力和细胞毒性，同时 使细胞增殖最小化至发生大量聚集的点。本发明提供了储存和/或运输未辐照的NK-92细 胞的储存培养基和方法，它们满足了这些需要。
[0011] 本发明在某些实施方案中提供了用于储存和/或运输NK-92细胞系的储存培养基 和方法，以便维持所述细胞的生存力和细胞毒性，用于在远离NK-92细胞的起源场所的场 所处治疗患者。本发明是基于下述惊人发现：在有低水平的IL-2存在下和在最小可变温度 储存NK-92细胞，可以限制增殖，仍然阻止由增加的细胞密度引起的大量聚集，同时也维持 细胞生存力和细胞毒性。中心场所可以制备用于治疗的NK-92细胞，然后在由本发明提供 的条件下运输所述细胞，用于遥远治疗场所处的患者的治疗用途，无需在治疗场所处具有 专门的符合cGMP的场所。本发明因而提供了可再现的"货架外'WK-92产品，在治疗场所处 仅需要最少的细胞操作。本发明另外提供了在一致细胞生存力下将均匀NK-92细胞产品递 送至目的地的方法。
[0012] 在一个方面，本文中描述的发明一般地涉及用于运输和/或递送细胞的细胞储存 培养基，例如，涉及用于运输和递送NK-92细胞的无菌等渗NK-92细胞储存培养基，所述储 存培养基包含：人血清或人血清白蛋白；初始密度的未辐照的、基本上未聚集的NK-92细 胞，其在递送至治疗场所时足以提供治疗量的NK-92细胞；和约200IU/mL的IL-2浓度，其 中所述培养基在有足以维持细胞的生存力的氧存在下维持在为运输选择的温度±5°C内， 且进一步其中所述为运输选择的温度是在约20°C至约40°C之间，使得所述NK-92细胞在放 入储存培养基中以后多达至少24小时的时段内保持存活以施用给患者。在一个优选的实 施方案中，所述培养基中的NK-92细胞的治疗量是，在递送至治疗场所时，不超过约2. 5xl06 个细胞/ml。在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92细胞密度维持在约IxlO4个细胞 /mL至约IxlO7个细胞/mL之间。在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92细胞密度维 持在约0. 5xl06个细胞/mL至约8xl06个细胞/mL之间。在某些实施方案中，将所述培养基 维持在为运输选择的温度±2°C内。在某些实施方案中，所述培养基包含约1%至约5%人 血清或人血清白蛋白。在某些实施方案中，所述为运输选择的温度是在约25°C至约38°C之 间。在某些实施方案中，所述初始细胞密度是在约IxlO 6个细胞/ml至6xl06个细胞/ml之 间。
[0013] 在另一个方面，本文中描述的发明涉及用于运输未辐照的、基本上未聚集的NK-92 细胞以维持所述用于施用给患者的NK-92细胞的生存力的方法，所述生存力维持至多达放 入储存培养基中以后至少24小时的时段，所述方法包括：
[0014] (a)提供无菌储存容器；
[0015] (b)将无菌储存培养基加入所述容器中，其中所述培养基包含人血清或人血清白 蛋白、和约200IU/mL的IL-2 ;
[0016] (C)向所述容器中加入初始密度的未辐照的、基本上未聚集的NK-92细胞，其在递 送至治疗场所时足以提供治疗量的NK-92细胞；
[0017] (d)密封所述容器；
[0018] (e)将所述培养基维持在为运输选择的温度±5°C内，其中所述为运输选择的温 度是在约20°C至约40°C之间；和
[0019] (f)在有足以维持细胞的生存力的氧存在下，运输所述NK-92细胞持续至在放入 储存培养基中以后多达至少24小时的时段，
[0020] 使得所述NK-92细胞在放入储存培养基中以后多达至少24小时的时段内保持存 活以施用给患者。
[0021] 在一个优选的实施方案中，所述培养基中的NK-92细胞的治疗量是，在递送至治 疗场所时，不超过约2. 5xl06个细胞/ml。在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92细胞 密度维持在约IxlO 4个细胞/mL至约IxlO7个细胞/mL之间。在某些实施方案中，在运输过 程中，将NK-92细胞密度维持在约0. 5xl06个细胞/mL至约8xl06个细胞/mL之间。在某些 实施方案中，将所述培养基维持在为运输选择的温度±2°C内。在某些实施方案中，温度控 制装置将储存培养基维持在为运输选择的温度±5°C内。在某些实施方案中，所述储存容器 标有将未辐照的NK-92细胞加入培养基中的日期和时间。在某些实施方案中，所述培养基 包含约1%至约5%人血清或人血清白蛋白。在某些实施方案中，所述为运输选择的温度是 在约25°C至约38°C之间。在某些实施方案中，所述初始细胞密度是在约IxlO 6个细胞/ml 至6xl06个细胞/ml之间。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1显示了 NK-92细胞在生长培养基中的倍增时间。
[0023] 图2A指示NK-92细胞的细胞毒性，所述NK-92细胞以IxlO6个细胞/mL(红色圆 圈）或6xl06个细胞/mL (蓝色正方形）的密度运输过夜，或者以4xl05个细胞/mL (绿色三 角形）的密度在培养箱中储存过夜。图2B指示在稀释和静置以后的细胞的细胞毒性。
[0024] 图3指示以IxlO6个细胞/mL或6xl06个细胞/mL的密度运输过夜的NK-92细胞 的流式细胞计量术分析的结果。
【具体实施方式】
[0025] 在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应当理解，下述的方面不限于特定组 合物、方法或用途，因为这些当然可以变化。还应该理解，本文中使用的术语仅用于描述特 定方面的目的，无意是限制性的。
[0026] 在本说明书中和在下面的权利要求书中，将提及许多应当定义为具有下述含义的 术语：
[0027] 必须指出，如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式"一个"、"一种"和 "所述"包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。
[0028] 本文中使用的术语"约"是指，值可以变化±15%，且保持在本发明范围内。例如， "约200IU/mL的IL-2浓度"包括在170IU/mL和230IU/mL之间的IL-2浓度。
[0029] 用于描述本发明的"天然杀伤（NK)细胞"是，在没有特定抗原刺激存在下杀死靶 细胞的免疫系统细胞，且没有根据MHC类别的限制。靶细胞可以是肿瘤细胞或携带病毒的 细胞。NK细胞的特征在于，⑶56的存在和⑶3表面标志物的缺失。
[0030] 术语"内源NK细胞"用于表示，源自供体（或患者）的NK细胞，其区别于NK-92 细胞系。内源NK细胞通常是在其中已经富集NK细胞的异质细胞群体。可以预见到内源NK 细胞用于患者的自体或同种异基因治疗。
[0031] 永生的NK细胞系NK-92最初得自具有非霍奇金淋巴瘤的患者。就本发明的目的 而言和除非另外指出，术语"NK-92"意图表示原始NK-92细胞系以及已经修饰（例如，通过 引入外源基因）的NK-92细胞系。NK-92细胞及其示例性的和非限制性的修饰描述于美国 专利号7, 618, 817、8, 034, 332和8, 313, 943,它们都通过引用整体并入本文。
[0032] 本文中使用的"未辐照的NK-92细胞"是尚未辐照的NK-92细胞。辐照会使得细 胞不能生长和增殖。预见到，在治疗患者之前，将在治疗场所或某个其它地点辐照NK-92细 胞，因为辐射和输注之间的时间应当不长于4小时，以便保留最佳活性。可替换地，可以通 过另一种机制将NK-92细胞灭活。
[0033] 用于描述本发明的NK-92细胞的"灭活"会使得它们不能生长和/或不能实现它们 的正常功能，尤其是它们的细胞毒性活性。灭活也可能与NK-92细胞的死亡有关。预见到， 在NK-92细胞已经在治疗用途中有效地清除与病变有关的细胞的离体样品以后，或者在它 们已经在哺乳动物体内停留足以有效地杀死许多或所有存在于体内的靶细胞的时间段以 后，可以将NK-92细胞灭活。作为非限制性例子，通过施用NK-92细胞对其敏感的钝化剂， 可以诱导灭活。
[0034] 本文中使用的术语"基本上未聚集的"是指，NK-92细胞密度小于对聚集具有不良 作用的密度。也就是说，NK-92细胞的密度使得，任何聚集不会实质上改变它们的体内效力。 预见到约IxlO 7个细胞/mL的细胞密度是当维持适当生存力和不聚集时的NK-92细胞密度 的上限。
[0035] 通过大于约IxlO7个细胞/mL的细胞密度，测量聚集的程度（Materiality)。在运 输过程中小于约IxlO 7个细胞/mL的NK-92细胞密度不会实质上改变它们的体内效力。由 于NK-92细胞将在储存培养基中繁殖，最初加入储存培养基中的细胞的量必须反映生长的 程度和将要维持储存的时间长度。这样的计算属于本领域的技能。
[0036] 用于描述本发明的术语"细胞毒性"和"细胞裂解"当用于描述诸如NK细胞等效 应细胞的活性时，意图是同义的。一般而言，细胞毒性活性涉及通过多种生物、生化或生物 物理学机制中的任一种来杀死靶细胞。细胞裂解更具体地表示这样的活性：其中效应物裂 解靶细胞的质膜，由此破坏它的物理完整性。这会导致靶细胞的杀死。不希望受理论的约 束，据信，NK细胞的细胞毒性效应是由于细胞裂解。
[0037] 用于描述本发明的"靶细胞"是，通过本发明的NK细胞的细胞毒性活性杀死的细 胞。这些具体地包括恶性细胞或以其它方式从癌症衍生出的细胞，以及被致病性病毒(诸如 HIV、EBV、CMV或疱疹）感染的细胞。
[0038] 用于描述本发明的"清除"涉及效应细胞(诸如离体NK细胞)对靶细胞的杀死。靶 细胞可以被包括在得自哺乳动物的生物样品中，所述哺乳动物被认为遭受与靶细胞在样品 中的存在有关的病变。所述病变可以是由样品中的肿瘤细胞引起的癌症或恶性肿瘤，且可 以如下进行治疗：清除肿瘤细胞的样品，并将所述样品返回哺乳动物的体内。
[0039] 用于描述本发明的"癌症"、"肿瘤"和"恶性肿瘤"都等同地涉及组织或器官的增 生。如果所述组织是淋巴或免疫系统的一部分，恶性细胞可以包括循环细胞的非实体瘤。其 它组织或器官的恶性肿瘤可以产生实体瘤。一般而言，本发明的方法可以用于治疗淋巴细 胞、循环的免疫细胞和实体瘤。
[0040] 用于描述本发明的"致病性病毒"是在宿主中造成疾病的病毒。所述致病性病毒 会感染宿主动物的细胞，并且这样的感染的后果是宿主的健康的衰退。
[0041] 本文中使用的术语"10V'等同于10y。因此，2.5ΧΚΓ6等同于2.5x10 s或 2, 500, 000。
[0042] 本文中使用的术语"治疗场所"表示所述细胞要运送到的任何场所、医院、诊所或 其它机构。在一个优选的实施方案中，将所述细胞运送至治疗患者的场所。
[0043] 本文中使用的"运输方法"包括，从NK-92细胞最初所在的实验室或其它场所运输 至治疗场所的任何方法，包括但不限于道路运输、航空运输、铁路运输，和在适当时的徒步 运输（例如，行走）。
[0044] 为了读者的方便，可以在说明书中使用标题或小标题，它们无意影响本发明的范 围。另外，在下面更具体地定义了在本说明书中使用的一些术语。
[0045] NK-92 细朐系
[0046] Gong等人（1994)已经描述了 NK-92细胞系。发现它会展示CD56bl:ight、CD2、CD7、 ⑶11a、⑶28、⑶45和⑶54表面标志物。此外，它不展示⑶1、⑶3、⑶4、⑶5、⑶8、⑶10、 ⑶14、⑶16、⑶19、⑶20、⑶23和⑶34标志物。培养中的NK-92细胞的生长依赖于重组白 介素2(rIL-2)的存在，低至llU/mL的剂量足以维持增殖。IL-7和IL-12不会支持长期生 长，试验的其它细胞因子(包括IL-I a、IL-6、肿瘤坏死因子α、干扰素 α和干扰素 Y )也 不会。ΝΚ-92可非常有效地杀死某些肿瘤细胞，诸如Κ562(红白血病）和Daudi (伯基特淋 巴瘤）细胞，因为它即使在1:1的低效应物：靶标（Ε:Τ)比率下也具有高细胞毒性。Gong， 等人，出处同上。另外，NK-92细胞对8E5细胞具有高细胞毒性活性，所述8E5细胞被HIV 感染且产生HIV病毒粒子。将NK-92细胞保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC)，命名为 CRL-2407。
[0047] NK-92细胞表现出对宽范围的恶性靶细胞的裂解活性。这些包括：源自循环靶 细胞(诸如急性和慢性淋巴母细胞和髓性白血病)、淋巴瘤、骨髓瘤、黑素瘤的细胞系，以及 源自实体瘤的细胞，诸如前列腺癌、神经母细胞瘤和乳腺癌细胞系。即使在非常低的效应 物：靶标比率下，也观察到该效应。该裂解优于从用IL-2刺激4天的正常外周血单核细 胞得到的细胞毒性。在患者中使用辐照过的NK-92细胞的早期临床研究已经指示良好耐 受性，具有有益效果的迹象。这些研究已经在具有多种癌症类型的患者中进行，在例如肾 细胞癌症和骨髓瘤（Arai等人，Cytotherapy 10:625-632, 2008)和肺癌（Tonn等人，J. Hematother. &Stem Cell Res. 10:535-544, 2001)中具有鼓舞人心的结果。
[0048] 鉬合物和方法
[0049] 一些实施方案一般地涉及储存培养基，包括用于运输和/或递送NK92细胞的培养 基，所述培养基具有一个或多个如本文中所述的参数。在一个方面，本文中描述的发明涉及 用于运输和递送NK-92细胞的无菌的、等渗的NK-92细胞储存培养基，所述储存培养基包 含：人血清或人血清白蛋白；初始密度的未辐照的、基本上未聚集的NK-92细胞，其在递送 至治疗场所时足以提供治疗量的NK-92细胞；和约200IU/mL的IL-2浓度，其中所述培养基 在有足以维持细胞的生存力的氧存在下维持在为运输选择的温度±5°C内，且进一步其中 所述为运输选择的温度是在约20°C至约40°C之间，使得所述NK-92细胞在放入储存培养基 中以后多达至少24小时的时段内保持存活以施用给患者。
[0050] 在另一个方面，本文中描述的发明涉及用于运输未辐照的、基本上未聚集的NK-92 细胞以维持所述用于施用给患者的NK-92细胞的生存力的方法，所述生存力维持至多达放 入储存培养基中以后至少24小时的时段，所述方法包括：
[0051] (a)提供无菌储存容器；
[0052] (b)将无菌储存培养基加入所述容器中，其中所述培养基包含人血清或人血清白 蛋白、和约200IU/mL的IL-2 ;
[0053] (c)向所述容器中加入初始密度的未辐照的、基本上未聚集的NK-92细胞，其在递 送至治疗场所时足以提供治疗量的NK-92细胞；
[0054] (d)密封所述容器；
[0055] (e)将所述培养基维持在为运输选择的温度±5°C内，其中所述为运输选择的温 度是在约20°C至约40°C之间；和
[0056] (f)在有足以维持细胞的生存力的氧存在下，运输所述NK-92细胞持续至在放入 储存培养基中以后多达至少24小时的时段，
[0057] 使得所述NK-92细胞在放入储存培养基中以后多达至少24小时的时段内保持存 活以施用给患者。
[0058] 在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92细胞密度维持在约IxlO4个细胞/mL 至约IxlO7个细胞/mL之间。在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92细胞密度维持在 约0. 5xl05个细胞/mL至约IxlO7个细胞/mL之间。在某些实施方案中，在运输过程中，将 NK-92细胞密度维持在约IxlO5个细胞/mL至约IxlO7个细胞/mL之间。在某些实施方案 中，在运输过程中，将NK-92细胞密度维持在约IxlO6个细胞/mL至约IxlO7个细胞/mL之 间。在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92细胞密度维持在约2xl05个细胞/mL至 约IxlO 7个细胞/mL之间。在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92细胞密度维持在约 IxlO4个细胞/mL至约9xl06个细胞/mL之间。在某些实施方案中，在运输过程中，将NK-92 细胞密度维持在约IxlO 4个细胞/mL至约8xl06个细胞/mL之间。在某些实施方案中，在运 输过程中，将NK-92细胞密度维持在约IxlO 4个细胞/mL至约6xl06个细胞/mL之间。可以 将NK-92细胞维持在这些范围中的任意范围内的任意密度，包括端点。
[0059] 在某些实施方案中，NK-92细胞的初始密度是在约0. 5xl04个细胞/ml至约9xl06 个细胞/ml之间。在某些实施方案中，NK-92细胞的初始密度是在约IxlO5个细胞/ml至 约9xl0 6个细胞/ml之间。在某些实施方案中，NK-92细胞的初始密度是在约IxlO6个细胞 /ml至约9xl0 6个细胞/ml之间。在某些实施方案中，NK-92细胞的初始密度是在约IxlO6 个细胞/ml至约8xl06个细胞/ml之间。在某些实施方案中，NK-92细胞的初始密度是在约 IxlO6个细胞/ml至约7xl06个细胞/ml之间。在某些实施方案中，NK-92细胞的初始密度 是在约IxlO 6个细胞/ml至约6xl06个细胞/ml之间。NK-92细胞的初始密度可以是在这 些范围中的任意范围内的任意密度，包括端点。
[0060] 在某些实施方案中，所述为运输选择的温度是在约20°C和约40°C之间。在一个优 选的实施方案中，所述为运输选择的温度是在约25°C和约38°C之间。在某些实施方案中， 所述为运输选择的温度是在约20°C和约25°C之间。在某些实施方案中，所述为运输选择的 温度是约室温。在某些实施方案中，所述为运输选择的温度是约37°C。
[0061] 在某些实施方案中，将所述培养基维持在为运输选择的温度±5°C内。在某些实施 方案中，将所述培养基维持在为运输选择的温度±4°C内。在某些实施方案中，将所述培养 基维持在为运输选择的温度±3°C内。在某些实施方案中，将所述培养基维持在为运输选择 的温度±2°C内。在某些实施方案中，将所述培养基维持在为运输选择的温度±1°C内。
[0062] 在某些实施方案中，温度控制装置将储存培养基维持在为运输选择的温度±5°C 内。这样的温度控制装置是本领域已知的。示例性的温度控制装置包括：加热至期望温度 的凝胶包、便携式运输培养箱、生物反应器或本领域已知的任意其它合适的装置。
[0063] 在某些实施方案中，所述NK-92细胞在放入储存培养基中以后多达至少24小时的 时段内保持存活以施用给患者。在某些实施方案中，所述NK-92细胞在放入储存培养基中 以后多达约14小时的时段内保持存活以施用给患者。在某些实施方案中，所述NK-92细胞 在放入储存培养基中以后多达约20、16、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小时的时段内保持存 活以施用给患者。在某些实施方案中，所述NK-92细胞在放入储存培养基中以后大于24小 时的时段内保持存活以施用给患者。在某些实施方案中，所述NK-92细胞在放入储存培养 基中以后多达约36、48、60或72小时的时段内保持存活以施用给患者。
[0064] 在某些实施方案中，在到达治疗场所以后，可以将NK-92细胞储存一段时间。例 如，可以在所述场所储存和/或培养NK-92细胞，然后实现操作以将NK-92细胞注射进患 者。在一个实施方案中，在递送以后，用生长培养基（例如，含有更高浓度的IL-2)替换储 存培养基。在一个实施方案中，将额外培养基加给NK-92细胞进行储存；也就是说，NK-92 细胞的密度降低。在一个实施方案中，在递送至所述场所以后，将NK-92细胞储存12小时、 24小时、36小时或48小时。在一个实施方案中，NK-92细胞的储存条件取决于细胞密度、 细胞生长、细胞生存力、IL-2水平或它们的任意组合。
[0065] 在某些实施方案中，所述培养基包含人血清或其等效物。在某些实施方案中，所述 培养基包含人血清白蛋白。在某些实施方案中，所述培养基包含人血浆。在某些实施方案 中，所述培养基包含约1%至约15%人血清或人血清等效物。在某些实施方案中，所述培养 基包含约1%至约10%人血清或人血清等效物。在某些实施方案中，所述培养基包含约1% 至约5%人血清或人血清等效物。在一个优选的实施方案中，所述培养基包含约2. 5%人血 清或人血清等效物。在某些实施方案中，所述血清是人AB血清。在某些实施方案中，使用 可接受的用于人治疗剂中的血清替代物来替代人血清。这样的血清替代物可以是本领域已 知的，或者在将来开发出。尽管可以使用超过15%的人血清浓度，预见到，大于约5%的浓度 将是成本过高的（cost-prohibitive)。
[0066] 在本文所述发明中使用的储存容器可以是任意细胞储存容器。在某些实施方案 中，所述储存容器可以是本领域已知的任意储存容器。在某些实施方案中，所述储存容器是 氧可透过的袋。在某些实施方案中，所述储存容器是组织培养瓶。在某些实施方案中，所述 储存容器是氧可透过的烧瓶。这样的烧瓶的一个例子是，由Wilson Wolf Manufacturing 制造的G-Rex烧瓶。在某些实施方案中，所述储存容器是氧不可透过的袋，其在顶空中具有 足够的氧以在运输过程中维持细胞的生存力。
[0067] 在某些实施方案中，所述储存容器标有信息。在一个优选的实施方案中，所述储存 容器标有关于将NK-92细胞放入储存培养基中的日期和时间的信息。标记容器的方法是本 领域众所周知的。在某些实施方案中，所述标记是条形码。在某些实施方案中，所述标记是 射频识别（RFID)标签。在某些实施方案中，所述标记是二维条形码。在某些实施方案中， 所述标记是快速应答（QR)代码。在某些实施方案中，所述标记是手写的、打字的或盖印的。 在某些实施方案中，采用多种标记方法。
[0068] 在本申请中使用下述缩写：
[0069]
【权利要求】
1. 一种用于运输和递送NK-92细胞的无菌的、等渗的NK-92细胞储存培养基，所述储存 培养基包含： (i)人血清或人血清白蛋白； (ii)初始细胞密度的未辐照的、基本上未聚集的NK-92细胞，所述NK-92细胞在递送至 治疗场所时足以提供治疗量的NK-92细胞；和 (iii)约200IU/mL的IL-2浓度， 其中所述培养基在有足以维持所述细胞的生存力的氧存在下维持在为运输选择的温 度±5°C内，且进一步其中所述为运输选择的温度是在约20°C至约40°C之间，使得所述 NK-92细胞在放入所述储存培养基中以后多达至少24小时的时段内保持存活以施用给患 者。
2.根据权利要求1所述的储存培养基，其中在运输过程中，将所述NK-92细胞密度维持 在约lxlO4个细胞/mL至约lxlO7个细胞/mL之间。
3.根据权利要求3所述的储存培养基，其中在运输过程中，将所述NK-92细胞密度维持 在约0. 5xl06个细胞/mL至约8xl06个细胞/mL之间。
4.根据权利要求1所述的储存培养基，其中所述初始细胞密度是在约lxlO6个细胞/ ml至6xl06个细胞/ml之间。
5.根据权利要求1所述的储存培养基，其中将所述培养基维持在所述为运输选择的温 度±2°C内。
6.根据权利要求1所述的储存培养基，其中所述培养基包含约1%至约5%人血清或人 血清白蛋白。
7.根据权利要求1所述的储存培养基，其中所述为运输选择的温度是在约25°C至约 38°C之间。
8. -种用于运输未辐照的、基本上未聚集的NK-92细胞以维持用于施用给患者的所述 NK-92细胞的生存力的方法，所述生存力维持至多达放入储存培养基中以后至少24小时的 时段，所述方法包括： (a)提供无菌储存容器； (b)将无菌储存培养基加入所述容器中，其中所述培养基包含人血清或人血清白蛋白 和约200IU/mL的IL-2 ; (c)向所述容器中加入初始密度的未辐照的、基本上未聚集的NK-92细胞，所述NK-92 细胞在递送至治疗场所时足以提供治疗量的NK-92细胞； (d)密封所述容器； (e)将所述培养基维持在为运输选择的温度±5°C内，其中所述为运输选择的温度是 在约20°C至约40°C之间；和 (f)在有足以维持所述细胞的生存力的氧存在下，运输所述NK-92持续至在放入所述 储存培养基中以后多达至少24小时的时段， 使得所述NK-92细胞在放入所述储存培养基中以后多达至少24小时的时段内保持存 活以施用给患者。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在运输过程中，将所述NK-92细胞密度维持在约 lxlO4个细胞/mL至约lxlO7个细胞/mL之间。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中在运输过程中，将所述NK-92细胞密度维持在约 0. 5xl06个细胞/mL至约8xl06个细胞/mL之间。
11. 根据权利要求8所述的方法，其中所述初始密度是在约lxlO6个细胞/ml至6xl06 个细胞/ml之间。
12. 根据权利要求8所述的方法，其中将所述培养基维持在所述为运输选择的温度 ±2°C内。
13. 根据权利要求8所述的方法，其中温度控制装置将所述储存培养基维持在所述为 运输选择的温度±5 °C内。
14. 根据权利要求8所述的方法，其中所述储存容器标有将所述NK-92细胞加入所述储 存培养基中的日期和时间。
15. 根据权利要求8所述的方法，其中所述培养基包含约1%至约5%人血清或人血清白 蛋白。
16. 根据权利要求8所述的方法，其中所述为运输选择的温度是在约25°C至约38°C之 间。
【文档编号】A01N1/02GK104509529SQ201410004944
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】汉斯·G·克林格曼, 巴里·J·西蒙 申请人:康克韦斯特公司