一种铁皮石斛组织培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种铁皮石斛发成为圆球茎，圆球茎增殖、分化，脱分化，壮苗，生根，炼苗六个步骤。本发明通过优化和改进各个步骤的培养基对铁皮石斛组织培养，所用的培养基分别为改良1/2MS基本培养基、添加土豆浸出粉的MS培养基、添加土豆浸出粉的1/2 MS培养基，添加土豆浸出粉和NAA的改良培养基，添加香蕉提取物和NAA、IBA的改良培组织培养方法，具体包括：铁皮石斛种子萌养基，添加花宝1号和花宝2号改良培养基；铁皮石斛萌发率高，且萌发时间短，加快了组培苗的生长速率，减少时间消耗，降低成本。
【专利说明】一种铁皮石斛组织培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业【技术领域】，具体为一种铁皮石斛组织培养方法。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生附生 草本植物，是一种名贵的中药材，具有悠久的应用历史，被列为九大仙草之首，是药中黄金。 《神农本草经》记载："石斛除痹下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴益精，久服厚肠胃"。金元四大名 医之一朱丹溪称石斛有卓著的滋阴健阳功效，并且在中医补阴药物中，石斛是独树一帜的。 古往今来石斛被称为滋阴补肾、养生保健之上品，一年四季皆可服用，且对各脏器的阴虚之 证有通补之效。长期的临床试验和科学研究的结果表明石斛具有补阴强身、健壮筋骨，延缓 衰老、润肤养颜，治疗眼疾、降低血糖、滋养肝阴、利胆溶石等多种功效，同时这些功效与石 斛中所含的丰富的营养成分密切相关，现代医学研究表明：铁皮石斛中所含有的石斛多糖， 氨基酸、生物碱及菲类化合物等具有较高的医疗保健作用，能够提高机体免疫力。
[0003] 长期以来，应用铁皮石斛主要以采集野生资源为主。近年来，随着人们对铁皮石斛 药用价值认识的日益提高，铁皮石斛的需求量也不断提高，传统的野生资源已不能满足人 们的需求量，甚至有些地区的野生资源面临枯竭。为了更好地保护和利用铁皮石斛资源，越 来越多的科研工作者开始响应国家号召，开始关注于铁皮石斛的研发工作，包括铁皮石斛 人工驯化栽培，无性繁殖等，铁皮石的组织培养技术是铁皮石斛繁殖的一种重要手段，也是 大力推广铁皮石斛种植、繁殖苗木的关键途径，但是一般组织培养过程中幼苗生长周期较 长，消耗大量资源,增加组培生产成本。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种铁皮石斛组织培养方法，该方法在于加快 了组培苗的生长速率，减少时间消耗，降低成本。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种铁皮石斛组织培养方法，具体包括：铁皮 石斛种子萌发成为圆球茎，圆球茎增殖、分化，脱分化，壮苗，生根，炼苗六个步骤。
[0006] 所述六个步骤具体培养方法如下： (1) 种子萌发成为圆球茎：将成熟铁皮石斛种子经消毒处理后播种于改良1/2MS基本 培养基中培养15-20天，经过种胚膨大、萌发形成绿色圆球茎；培养条件为25-26 °C，光照为 1700-2100 lx，光照时间为 13-14h/d ; (2) 圆球茎增殖、分化：将圆球茎转入加土豆浸出粉的MS改良培养基中培养23-28 天，使得圆球茎堆积在培养基中，并出现叶原基和分化苗；培养条件：温度25-26°C，光照度 1700-2100 lx，光照时间为 13-14h/d ; (3) 脱分化：将圆球茎分化苗转入改良1/2MS培养基中培养20-30天，经诱导产生叶原 基； (4) 壮苗：将步骤（3)中产生的小苗转入改良MS培养基中进行壮苗，经过60-70天壮 苗培养，高度达到1. 5-2. 5cm的幼苗出现，培养条件：温度25-26°C，光照度1700-2100 lx， 光照时间为13_14h/d ; (5) 生根：将步骤（4)得到的幼苗转入加花宝1号和2号的改良培养基进行诱导生根； (6) 炼苗：将步骤（5)得到的生根苗进行炼苗驯化。
[0007] 上述各步骤的培养基配方如下： (1) 种子萌发成为圆球茎的培养基：采用改良1/2MS基本培养基，即硝酸钾19000mg/ L、硝酸铵16500mg/L、磷酸二氢钾1700mg/L、硫酸镁3700mg/L、氯化钙4400mg/L、碘化钾 166mg/L、硼酸 1240mg/L、硫酸猛 2230mg/L、硫酸锌 860mg/L、钥酸钠 50mg/L、硫酸铜 5mg/L、 氯化钴5mg/L、硫酸亚铁2780mg/L、乙二胺四乙酸二钠3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸 400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/L、烟酸100mg/L、蛋白胨1. 75g/L、鹿糖 30g/L、琼脂 6.5-8g/L; 采用加入蛋白胨的改良1/2MS培养基作为诱导种子萌发培养基，可促进种子萌发并 缩短萌发时间，蛋白胨的添加弥补了铁皮石斛种子不含胚乳的缺陷，为种子萌发提供的营 养； (2)圆球茎增殖、分化的培养基配方：硝酸钾38000mg/L、硝酸铵33000mg/L、磷酸二氢 钾3400mg/L、硫酸镁7400mg/L、氯化钙8800mg/L、碘化钾166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸锰 4460mg/L、硫酸锌1720mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁5560mg/ L、乙二胺四乙酸二钠7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐 酸批卩多醇l〇〇mg/L、烟酸100mg/L、土豆浸出粉15g/L、鹿糖30g/L、琼脂6. 5-8g/L ; 改良MS培养基中用土豆浸出粉代替传统的土豆汁，其优点在于方便快捷，节省时间； 克服使用土豆制作培养基导致不同批次培养基养分含量不同导致组培苗生长存在差异，并 且二者比较发现，组培苗在加土豆浸出粉培养基中的生长情况优于在加土豆的培养基； (3) 脱分化培养基配方：硝酸钾19000mg/L、硝酸铵16500mg/L、磷酸二氢钾1700mg/L、 硫酸镁3700mg/L、氯化钙4400mg/L、碘化钾166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸锰2230mg/L、硫酸 锌860mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁2780mg/L、乙二胺四乙酸 二钠3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/ L、烟酸 100mg/L、土豆浸出粉 15g/L、鹿糖 30g/L、琼脂 6. 5-8g/L ; (4) 壮苗培养基配方：硝酸钾38000mg/L、硝酸铵33000mg/L、磷酸二氢钾3400mg/L、硫 酸镁7400mg/L、氯化钙8800mg/L、碘化钾166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸锰4460mg/L、硫酸锌 1720mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁5560mg/L、乙二胺四乙酸 二钠7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/ L、烟酸 100mg/L、NAA6ml/L、土豆浸出粉 15g/L、蔗糖 30g/L、琼脂 6. 5-8g/L ; (5) 生根培养基配方：花宝1号2000 mg/L、花宝2号2000 mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨 酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/L、烟酸100mg/L、香蕉100g/L、NAA5ml/ L、IBA5ml/L、蔗糖 30g/L、琼脂 6. 5-8g/L ; 生根培养基采用花宝1号和花宝2号替代传统MS培养基中的大量元素，可促进组培苗 生根，缩短生根培养周期，铁皮石斛组培苗在传统生根培养基中需培养28-30诱导生根，而 在添加花宝1号和2号的生根培养基中仅需20-25天，另外，生根培养基中添加香蕉的方法 是将香蕉去皮切块，在水中煮沸15-20分钟，用200目筛网将香蕉水过滤，将滤水直接添加 到煮培养基的水中，定容，此方法与传统添加香蕉汁的方法相比，减少了培养基中的沉淀， 减少了细菌和真菌的生长介质，降低污染率。
[0008] 以上步骤所用的培养基pH5. 6-5. 7,添加活性碳5g/L，培养基用水均为普通自来 水。
[0009] 本发明的技术效果：本发明通过优化和改进各个步骤的培养基对铁皮石斛组织培 养，所用的培养基分别为改良1/2MS基本培养基、添加土豆浸出粉的MS培养基、添加土豆浸 出粉的1/2 MS培养基，添加土豆浸出粉和NAA的改良培养基，添加香蕉提取物和NAA、IBA 的改良培养基，添加花宝1号和花宝2号改良培养基，采用加入蛋白胨的改良1/2MS培养基 作为诱导种子萌发培养基，可促进种子萌发并缩短萌发时间，蛋白胨的添加弥补了铁皮石 斛种子不含胚乳的缺陷，为种子萌发提供的营养；添加土豆浸出粉组培苗生长旺盛、叶片浓 绿色、较厚。铁皮石斛萌发率高，且萌发时间短，加快了组培苗的生长速率，减少时间消耗， 降低成本。
【具体实施方式】 实施例
[0010] 本实施例的铁皮石斛组织培养方法，包括如下步骤： (1) 种子萌发成为圆球茎：将成熟铁皮石斛种子经消毒处理后播种于MS基本培养基中 培养20天，经过种胚膨大、萌发形成绿色圆球茎；培养条件为25°C，光照为1700 lx，光照时 间为14h/d ; (2) 圆球茎增殖、分化：将圆球茎转入加土豆浸出粉的MS改良培养基中培养23天，使 得圆球茎堆积在培养基中，并出现叶原基和分化苗；培养条件：温度26°C，光照度2100 lx， 光照时间为13h/d ; (3) 脱分化：将圆球茎分化苗转入改良1/2MS培养基中培养25天，经诱导产生叶原基； (4) 壮苗：将步骤（3)中产生的小苗转入改良MS培养基中进行壮苗，经过70天壮苗 培养，高度达到1. 5-2. 5cm的幼苗出现，培养条件：温度25°C，光照度2100 lx，光照时间为 14h/d ； (5) 生根：将步骤（4)得到的幼苗转入加花宝1号和2号的改良培养基进行诱导生根； (6) 炼苗：将步骤（5)得到的生根苗进行炼苗驯化。
[0011] 上述各步骤采用的培养基配方如下所列： (1) 种子萌发成为圆球茎的培养基：采用改良1/2MS基本培养基，即硝酸钾19000mg/ L、硝酸铵16500mg/L、磷酸二氢钾1700mg/L、硫酸镁3700mg/L、氯化钙4400mg/L、碘化钾 166mg/L、硼酸 1240mg/L、硫酸猛 2230mg/L、硫酸锌 860mg/L、钥酸钠 50mg/L、硫酸铜 5mg/L、 氯化钴5mg/L、硫酸亚铁2780mg/L、乙二胺四乙酸二钠3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸 400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/L、烟酸100mg/L、蛋白胨1. 75g/L、鹿糖 30g/L、琼脂 6.5-8g/L; (2) 圆球茎增殖、分化的培养基配方：硝酸钾38000mg/L、硝酸铵33000mg/L、磷酸二氢 钾3400mg/L、硫酸镁7400mg/L、氯化钙8800mg/L、碘化钾166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸锰 4460mg/L、硫酸锌1720mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁5560mg/ L、乙二胺四乙酸二钠7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐 酸批卩多醇l〇〇mg/L、烟酸100 mg/L、土豆浸出粉15 g/L、鹿糖30 g/L、琼脂6. 5-8 g/L ; (3) 脱分化培养基配方：硝酸钾19000 mg/L、硝酸铵16500 mg/L、磷酸二氢钾1700mg/ L、硫酸镁 3700 mg/L、氯化钙 4400 mg/L、碘化钾 166mg/L、硼酸 1240mg/L、硫酸锰 2230 mg/ L、硫酸锌860mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁2780mg/L、乙二胺 四乙酸二钠3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇 100mg/L、烟酸 100mg/L、土豆浸出粉 15g/L、鹿糖 30g/L、琼脂 6. 5-8g/L ; (4) 壮苗培养基配方：硝酸钾38000 mg/L、硝酸铵33000 mg/L、磷酸二氢钾3400 mg/L、 硫酸镁7400 mg/L、氯化钙8800 mg/L、碘化钾166 mg/L、硼酸1240 mg/L、硫酸锰4460 mg/ L、硫酸锌1720 mg/L、钥酸钠50 mg/L、硫酸铜5 mg/L、氯化钴5 mg/L、硫酸亚铁5560mg/L、 乙二胺四乙酸二钠7460 mg/L、肌醇20000 mg/L、甘氨酸400 mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、 盐酸吡哆醇100 mg/L、烟酸100 mg/L、NAA 6 ml/L、土豆浸出粉15 g/L、蔗糖30 g/L、琼脂 6.5-8 g/L ； (5) 生根培养基配方：花宝1号2000 mg/L、花宝2号2000 mg/L、肌醇20000mg/L、甘 氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/L、烟酸100mg/L、香蕉100g/L、NAA 5ml/L、IBA 5ml/L、鹿糖 30g/L、琼脂 6. 5_8g/L ; 以上步骤所用的培养基pH 5. 6-5. 7,添加活性碳5 g/L，培养基用水均为普通自来水。
[0012] 将铁皮石斛种子播种于MS基本培养基和1/2MS基本培养基诱导萌发，结果如表1 所示。研究结果表明种子在1/2MS基本培养基萌发率明显高于在MS基本培养基，且萌发较 快。
[0013] 针对不同的培养基对种子萌发率及萌发时间的影响，详见表1与表2。
【权利要求】
1. 一种铁皮石斛组织培养方法，其特征在于包括：铁皮石斛种子萌发成为圆球茎，圆 球茎增殖、分化，脱分化，壮苗，生根，炼苗六个步骤。
2. 如权利要求1所述的铁皮石斛组织培养方法，其特征在于：所述六个步骤具体培养 方法如下： (1) 种子萌发成为圆球茎：将成熟铁皮石斛种子经消毒处理后播种于改良1/2MS基本 培养基中培养15-20天，经过种胚膨大、萌发形成绿色圆球茎；培养条件为25-26 °C，光照为 1700-2100 lx，光照时间为 13-14h/d; (2) 圆球茎增殖、分化：将圆球茎转入加土豆浸出粉的MS改良培养基中培养23-28 天，使得圆球茎堆积在培养基中，并出现叶原基和分化苗；培养条件：温度25-26°C，光照度 1700-2100 lx，光照时间为 13-14h/d; (3) 脱分化：将圆球茎分化苗转入改良1/2MS培养基中培养20-30天，经诱导产生叶原 基； (4) 壮苗：将步骤（3)中产生的小苗转入改良MS培养基中进行壮苗，经过60-70天壮 苗培养，高度达到1. 5-2. 5cm的幼苗出现，培养条件：温度25-26°C，光照度1700-2100 lx， 光照时间为13_14h/d ; (5) 生根：将步骤（4)得到的幼苗转入加花宝1号和2号的改良培养基进行诱导生根； (6) 炼苗：将步骤（5)得到的生根苗进行炼苗驯化。
3. 如权利要求2所述的铁皮石斛组织培养方法，其特征在于：所述各步骤的培养基配 方如下： (1) 种子萌发成为圆球茎的培养基：采用改良1/2MS基本培养基，即硝酸钾19000mg/ L、硝酸铵16500mg/L、磷酸二氢钾1700mg/L、硫酸镁3700mg/L、氯化钙4400mg/L、碘化钾 166mg/L、硼酸 1240mg/L、硫酸猛 2230mg/L、硫酸锌 860mg/L、钥酸钠 50mg/L、硫酸铜 5mg/L、 氯化钴5mg/L、硫酸亚铁2780mg/L、乙二胺四乙酸二钠3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸 400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/L、烟酸100mg/L、蛋白胨1. 75g/L、鹿糖 30g/L、琼脂 6.5-8g/L; (2) 圆球茎增殖、分化的培养基配方：硝酸钾38000mg/L、硝酸铵33000mg/L、磷酸二氢 钾3400mg/L、硫酸镁7400mg/L、氯化钙8800mg/L、碘化钾166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸锰 4460mg/L、硫酸锌1720mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁5560mg/ L、乙二胺四乙酸二钠7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐 酸批卩多醇l〇〇mg/L、烟酸100mg/L、土豆浸出粉15g/L、鹿糖30g/L、琼脂6. 5-8g/L ; (3) 脱分化培养基配方：硝酸钾19000mg/L、硝酸铵16500mg/L、磷酸二氢钾1700mg/L、 硫酸镁3700mg/L、氯化钙4400mg/L、碘化钾166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸锰2230mg/L、硫酸 锌860mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁2780mg/L、乙二胺四乙酸 二钠3730mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/ L、烟酸 100mg/L、土豆浸出粉 15g/L、鹿糖 30g/L、琼脂 6. 5-8g/L ; (4) 壮苗培养基配方：硝酸钾38000mg/L、硝酸铵33000mg/L、磷酸二氢钾3400mg/L、硫 酸镁7400mg/L、氯化钙8800mg/L、碘化钾166mg/L、硼酸1240mg/L、硫酸锰4460mg/L、硫酸锌 1720mg/L、钥酸钠50mg/L、硫酸铜5mg/L、氯化钴5mg/L、硫酸亚铁5560mg/L、乙二胺四乙酸 二钠7460mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/ L、烟酸 100mg/L、NAA6ml/L、土豆浸出粉 15g/L、蔗糖 30g/L、琼脂 6. 5-8g/L ; (5)生根培养基配方：花宝1号2000 mg/L、花宝2号2000 mg/L、肌醇20000mg/L、甘氨 酸400mg/L、盐酸硫胺素100mg/L、盐酸批卩多醇100mg/L、烟酸100mg/L、香蕉100g/L、NAA5ml/ L、IBA5ml/L、蔗糖 30g/L、琼脂 6. 5-8g/L。
4.如权利要求3所述的铁皮石斛组织培养方法，其特征在于：所述各步骤的培养基 pH5. 6-5. 7,添加活性碳5g/L。
【文档编号】A01H4/00GK104429938SQ201410088679
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】胡耀光, 周健, 邵静 申请人:江苏天润本草生命科技有限公司