胡桃楸诱导不定芽的方法
【专利摘要】本发明及一种胡桃楸诱导不定芽的方法，(1)外植体的选择、(2)合子胚消毒、(3)合子胚预培养、(4)不定芽外植体的选择、(5)诱导和分化。本发明简单方便、快速有效，能在短时间内繁殖出大批的组培苗，能够为以后培育出优良无性系植株做好基础，有效地保护和繁殖国家濒危树种存在的危机状态，为今后更进一步保护和利用该物种奠定良好基础。
【专利说明】胡桃楸诱导不定芽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及林业生物技术中胡桃楸种苗快繁生产技术。
【背景技术】
[0002]目前,胡桃楸(Juglans mandshurica Max im.)隶属于胡桃科核桃属，是东北林区三大硬阔树种之一，其材质坚硬致密，纹理通直美观，未成熟外果皮、根(枝)皮、外壳及叶片均可入药，用途广泛，经济价值极高。由于长期的过度采伐，致使其资源已近濒危，远远不能满足国内外市场经济发展和医学等领域的需要。常规条件下，胡桃楸种子属于休眠性，繁殖速度缓慢，效率低，周期长。
[0003]关于胡桃楸的组织培养，由于初接种污染率高，外植体萌发较难，离体培养物褐化、退化严重，增殖系数低等问题一直未能得到很好解决，迄今未在生产上广泛应用。目前，以胡桃楸的未成熟胚为外植体进行体细胞胚胎发生已成功诱导出体细胞胚(王彦清等2000;张建瑛等2010)，未见完整植株。以胡桃楸休眠枝条进行无性繁殖(周宇等2001，张建琪等2011),无性繁殖效果未见成效。
【发明内容】
[0004]本发明的目 的在于克服上述技术中存在的不足之处，提供一种通过选择合适的外植体，再经植物生长调节剂处理，在合适的条件下培养，而诱导出胡桃楸丛生芽，丛生芽经过分株后再接种于诱导培养基上培养获得大量不定芽。
[0005]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是:
[0006](I)外植体的选择
[0007]每年8-10月份采取成熟的胡桃楸种子，经清水洗涤、在阳光下晾晒将胡桃楸外表皮去除掉，放置温度20-25°C条件下干燥、通风处备用，用锤子将外壳打碎，取胡桃楸种子尖部那端带少量子叶的合子胚，
[0008](2)合子胚消毒
[0009]先用70%乙醇浸润30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分钟,用无菌水冲洗5-7次，然后在无菌水中浸泡2-4小时，备用，
[0010](3)合子胚预培养
[0011]在无菌水中浸2-7小时后，将消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接种于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培养基中培养，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度24_26°C，光照时间16h/d，光照强度20001x，培养25-30天，
[0012](4)不定芽外植体的选择
[0013]待培养后的胡桃楸合子胚基部子叶张开，发育成带不同个数腋芽的小植株后，将胡桃楸植株基部存在的子叶掰掉，用镊子夹紧植株茎段，用无菌剪刀将胡桃楸植株从基部处开始剪成1.0-2.0cm左右各带不同腋芽的茎段，作为不定芽诱导分化的外植体，
[0014](5)诱导和分化[0015]将外植体接种在不定芽诱导培养基中，培养基为DKW培养基附加激素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同时附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度为25-27°C、光照时间16h/d，光照强度1000-20001 x,培养7_8天后外植体基部切口处边缘出现绿色芽点，培养15-20天获得不定芽。
[0016]本发明的优点是:
[0017]本发明简单方便、快速有效，能在短时间内繁殖出大批的组培苗，能够为以后培育出优良无性系植株做好基础，有效地保护和繁殖国家濒危树种存在的危机状态，为今后更进一步保护和利用该物种奠定良好基础。
[0018]本发明提供了胡桃楸诱导不定芽的方法，此方法效率高，繁殖速度快，平均出芽率较高，不定芽诱导率达90.6%，增殖倍数在7.5左右。本发明证实进行胡桃楸种苗的快繁可以不必通过种子育苗法和嫁接法，从而节约了时间，解除了时间限制而且繁殖效率大大提高，可以快速为胡桃楸经济林的建设提供充足的种苗；同时，这种高效的无性繁殖方法为胡桃楸的分子改良特别是转基因技术提供了很好的基础。
【具体实施方式】
[0019]下面结合对本发明的实施例作进一步详细描述。
[0020]实施例1、
[0021](I)外植体的选择
[0022]每年8月份采取成熟的胡桃楸种子，经清水洗涤、在阳光下晾晒将胡桃楸外表皮去除掉，放置温度20°C条件下干燥、通风处备用，用锤子将外壳打碎，取胡桃楸种子尖部那端带少量子叶的合子胚，
[0023](2)合子胚消毒
[0024]先用70%乙醇浸润30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分钟,用无菌水冲洗5次,然后在无菌水中浸泡2小时,备用，
[0025](3)合子胚预培养
[0026]在无菌水中浸2小时后，将消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接种于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培养基中培养，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度24°C，光照时间16h/d，光照强度20001x，培养25天，
[0027](4)不定芽外植体的选择
[0028]待培养后的胡桃楸合子胚基部子叶张开，发育成带不同个数腋芽的小植株后，将胡桃楸植株基部存在的子叶掰掉，用镊子夹紧植株茎段，用无菌剪刀将胡桃楸植株从基部处开始剪成1.0cm左右各带不同腋芽的茎段，作为不定芽诱导分化的外植体，
[0029](5)诱导和分化
[0030]将外植体接种在不定芽诱导培养基中，培养基为DKW培养基附加激素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及I BA0.01mg/L,同时附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度为25°C、光照时间16h/d，光照强度ΙΟΟΟΙχ，培养7-8天后外植体基部切口处边缘出现绿色芽点，培养15天获得诱导芽，
[0031]实施例2、
[0032](I)外植体的选择[0033]每年9月份采取成熟的胡桃楸种子，经清水洗涤、在阳光下晾晒将胡桃楸外表皮去除掉，放置温度23°C条件下干燥、通风处备用，用锤子将外壳打碎，取胡桃楸种子尖部那端带少量子叶的合子胚，
[0034](2)合子胚消毒
[0035]先用70%乙醇浸润30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分钟,用无菌水冲洗6次,然后在无菌水中浸泡3小时,备用，
[0036](3)合子胚预培养
[0037]在无菌水中浸4小时后，将消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接种于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培养基中培养，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度25°C，光照时间16h/d，光照强度20001x，培养27天，
[0038](4)不定芽外植体的选择
[0039]待培养后的胡桃楸合子胚基部子叶张开，发育成带不同个数腋芽的小植株后，将胡桃楸植 株基部存在的子叶掰掉，用镊子夹紧植株茎段，用无菌剪刀将胡桃楸植株从基部处开始剪成1.5cm左右各带不同腋芽的茎段，作为不定芽诱导分化的外植体，
[0040](5)诱导和分化
[0041 ] 将外植体接种在不定芽诱导培养基中，培养基为DKW培养基附加激素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同时附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度为26°C、光照时间16h/d，光照强度15001X，培养8天后外植体基部切口处边缘出现绿色芽点，培养15-20天获得诱导芽。
[0042]实施例3、
[0043](I)外植体的选择
[0044]每年10月份采取成熟的胡桃楸种子，经清水洗涤、在阳光下晾晒将胡桃楸外表皮去除掉，放置温度25°C条件下干燥、通风处备用，用锤子将外壳打碎，取胡桃楸种子尖部那端带少量子叶的合子胚，
[0045](2)合子胚消毒
[0046]先用70%乙醇浸润30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分钟,用无菌水冲洗7次,然后在无菌水中浸泡4小时,备用，
[0047](3)合子胚预培养
[0048]在无菌水中浸7小时后，将消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接种于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培养基中培养，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度26°C，光照时间16h/d，光照强度20001x，培养30天，
[0049](4)不定芽外植体的选择
[0050]待培养后的胡桃楸合子胚基部子叶张开，发育成带不同个数腋芽的小植株后，将胡桃楸植株基部存在的子叶掰掉，用镊子夹紧植株茎段，用无菌剪刀将胡桃楸植株从基部处开始剪成2.0cm左右各带不同腋芽的茎段，作为不定芽诱导分化的外植体，
[0051](5)诱导和分化
[0052]将外植体接种在不定芽诱导培养基中，培养基为DKW培养基附加激素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同时附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度为27°C、光照时间16h/d，光照强度20001x，培养8天后外植体基部切口处边缘出现绿色芽点，培养20天 获得诱导芽。
【权利要求】
1.一种胡桃楸诱导不定芽的方法，其特征在于: (1)外植体的选择 每年8-10月份采取成熟的胡桃楸种子，经清水洗涤、在阳光下晾晒将胡桃楸外表皮去除掉，放置温度20-25°C条件下干燥、通风处备用，用锤子将外壳打碎，取胡桃楸种子尖部那端带少量子叶的合子胚， (2)合子胚消毒 先用70%乙醇浸润30秒2次，然后用0.1 %的升汞HgCl2溶液消毒15分钟,用无菌水冲洗5-7次,然后在无菌水中浸泡2-4小时,备用， (3)合子胚预培养 在无菌水中浸2-7小时后，将消毒后的胡桃楸合子胚外表皮去掉，接种于添加激素吲哚乙酸IBA0.01mg/L的MS培养基中培养，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度24_26°C，光照时间16h/d，光照强度20001x，培养25-30天， (4)不定芽外植体的选择 待培养后的胡桃楸合子胚基部子叶张开，发育成带不同个数腋芽的小植株后，将胡桃楸植株基部存在的子叶掰掉，用镊子夹紧植株茎段，用无菌剪刀将胡桃楸植株从基部处开始剪成1.0-2.0cm左右各带不同腋芽的茎段，作为不定芽诱导分化的外植体， (5)诱导和分化 将外植体接种在不定芽诱导培养基中，培养基为DKW培养基附加激素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 2.0mg/L及IBA0.01mg/L,同时附加腺嘌呤AD10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂6g/L，培养温度为25-27°C、光照时间16h/d，光照强度1000-20001 x,培养7_8天后外植体基部切口处边缘出现绿色芽点，培养15-20天获得诱导丛生芽，丛生芽经过分株后再接种于培养基上培养后获得大量不定芽。
【文档编号】A01H4/00GK103960130SQ201410195477
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】张建瑛, 祁永会, 吕跃东, 刘建明, 邢亚娟, 田新华, 李京 申请人:黑龙江省林业科学研究所