人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法
【专利摘要】本发明提供一种人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，该方法包括从从刚离体的大肠癌标本上切取肿瘤边缘鱼肉样的无坏死肿瘤组织；将该肿瘤组织剪成0.8-1.3mm3的小块后，进行原代移植与传代移植，最终通过传代移植的瘤模型来研究个体特异性，如某一个体对化疗药物或放射治疗的敏感性。
【专利说明】人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及，尤其涉及一种人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法。
【背景技术】
[0002]大肠癌是消化道常见肿瘤，恶性程度高，严重威胁人类健康，而且大肠癌的发病率呈逐年上升趋势。因此，大肠癌的研究己受到外科界的关注。为了更好地研究大肠癌的生物学特性、癌变机制、肿瘤诊断、抗癌药物筛选、肿瘤与宿主的关系、肿瘤侵袭与转移的过程以及治疗措施的有效性，建立稳定、可靠和重复性好的动物模型是十分必要的。动物模型具有避免在人体上进行实验所带来的风险:可以严格控制实验条件，增加实验材料的可比性；克服肿瘤的潜伏期短、病程长和发病率低的缺点，提高实验研究的效率；简化实验操作、日常管理和各种样品的收集；有助于更全面地认识人类肿瘤本质等优点。建立合适的大肠癌动物模型，是进行大肠癌实验研究的必备条件。[0003]人类疾病的动物模型是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。借助于动物模型可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便，更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。小鼠与人类在遗传学、病理学、生物学等许多特性方面都非常相似，是肿瘤研究的理想动物。理想的小鼠肿瘤模型应能模拟并真实地重复人类肿瘤的自然发生、发展过程，并具有与之相同的病理和生化特点。大肠癌是消化道常见肿瘤，恶性程度高，严重威胁人类健康，而且大肠癌的发病率呈逐年上升趋势。因此，大肠癌的研究己受到外科界的关注。
[0004]目前大肠癌动物的肿瘤模型的建立大多数采用单一的细胞株移植于实验动物体内而实现。这种模型的优点是细胞株通过数十代的传代，成瘤率高，生长稳定。缺点是肿瘤细胞来源单一，对于需要研究个体化如化疗药物敏感性方面就显示出局限性，不能反应人类肿瘤生物学特性个体变化巨大的特点，因此,对于一些需要研究个体特异性的如某一个体对化疗药物或放射治疗的敏感性等时，单一的细胞株动物模型就不能胜任。
【发明内容】
[0005]本发明直接利用人大肠癌新鲜肿瘤组织接种于裸小鼠皮下建立模型，所建模型可反映患者的个体特征，同时也代表了临床多样性,能够针对个体特异性来研究某一个体对化疗药物或放射治疗的敏感性。
[0006]一种人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，包括以下步骤:
[0007](I)、从刚离体的大肠癌标本上切取肿瘤边缘鱼肉样的无坏死肿瘤组织，用生理盐水反复冲洗后浸泡于含双抗的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往实验室，在超净工作台上取出标本，放入培养皿中，用含双抗的PBS液反复冲洗，剪除标本外部的脂肪及坏死组织；所述双抗为青霉素和链霉素，两者浓度均为500U/ml ；
[0008](2)、在培养皿中，用眼科剪将肿瘤组织剪成0.8-1.3mm3的小块；[0009](3)、原代移植，用浓度为70mg/kg的戊巴比妥钠经腹腔注射裸鼠，用镊子将肿瘤组织块塞到20号穿刺针的针孔中，然后用穿刺针移植于裸鼠腋下或腹股沟皮下组织内，或于裸鼠皮肤上剪一小切口，经切口在皮下组织内适度分离出一小腔隙，用眼科镊将肿瘤组织块塞入腔隙内，最后缝合切口 ；每例标本原代接种10只裸鼠，共5例；
[0010](4)、原代移植后，用游标卡尺测量肿瘤的最大直径Dmax和最小直径Dmin，按公式V = 1/2XDmaxXDmin2计算肿瘤体积,待原代荷瘤鼠的瘤体达300~500mm3时，随机取其中I只进行传代；
[0011](5)、传代移植，将随机选取的荷瘤鼠I只采用拉脱颈椎法处死动物，体表消毒，无菌条件下剖出移植瘤组织，将肿瘤组织放入玻璃均浆器中，加适量无菌生理盐水研磨后，经滤网过滤成单个的细胞悬液，用0.4%台盼蓝染色法计数活细胞数，将细胞浓度调整至5X106~5X107/ml，用Iml的注射器注射到荷瘤鼠腋下或腹股沟皮下组织内，每点接种
0.2ml，每例接种25只，共5例。
[0012]进一步地，如上所述的人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，步骤2还包括用眼科剪在剪切过程中向肿瘤组织上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持湿润。
[0013]进一步地，如上所述的人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，在步骤5之后，还包括以下步骤:
[0014]将原代与传荷瘤鼠均于接种后9周处死，所有荷瘤鼠均剖出肿瘤组织，10%甲醛固定，制作石蜡切片，苏木素一伊红染色，光镜下观察，并与患者原发肿瘤进行对比。
[0015]本发明以大肠癌患者手术切除肿瘤组织为瘤源，接种于裸鼠体内，通过原代移植与传代移植进行建模，经过传代移植后的瘤成活率高；通过观察肿瘤生长特征，建立一种代表个体化的大肠癌裸鼠移植模型，并为进一步对大肠癌的个体化研究提供一种新的模型系统，利用此模型来测试患者肿瘤细胞对放、化疗等治疗措施的敏感性，为临床治疗提供参考资料，实现肿瘤治疗的个体化以提高治疗的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为传代荷瘤鼠肿瘤移植生长曲线图；
【具体实施方式】
[0017]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018]实施例:
[0019]步骤1:原代裸鼠移植瘤模型的建立
[0020] 从刚离体的大肠癌标本上切取肿瘤边缘鱼肉样的无坏死肿瘤组织，用生理盐水反复冲洗后浸泡于含双抗(内含青霉素和链霉素各500U/ml)的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往实验室，在超净工作台上取出标本，放入培养皿中，用含双抗的PBS液反复冲洗，剪除标本外部的脂肪及坏死组织；在培养皿中，用眼科剪将组织剪成Imm3左右的小块，剪切过程中适当向组织上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持湿润；用戊巴比妥钠(70mg/kg)经腹腔注射裸鼠，用镊子将组织块塞到20号穿刺针的针孔中，然后用穿刺针移植于裸鼠腋下(或腹股沟)皮下组织内，或于裸鼠皮肤上剪一小切口，经切口在皮下组织内适度分离出一小腔隙，用眼科镊将肿瘤组织块塞入腔隙内，最后缝合切口。每例标本原代接种10只裸鼠，共5例。
[0021 ] 步骤2:裸鼠成瘤情况
[0022]原代移植后每日观察裸鼠的精神、饮食、活动、大小便等一般情况，移植处皮下是否成瘤。从接种之日起至接种部位出现肉眼可见的移植瘤时为潜伏期，发现成瘤后开始每周用游标卡尺测量肿瘤的最大直径(Dmax)和最小直径(Dmin)，按公式V =1/2 X DmaxX (Dmin) 2计算肿瘤体积，并画出肿瘤体积时间生长曲线,待原代荷瘤裸鼠的瘤体达300~500mm3左右时(约20~30天)，随机取其中I只进行传代。
[0023]步骤3:传代裸鼠移植瘤模型的建立
[0024]为了解决成本，本发明当原代移植成功后，继续进行传代裸鼠移植瘤模型的建立，其方法为:随机选取其中的荷瘤鼠I只，拉脱颈椎法处死动物，体表消毒，无菌条件下剖出移植瘤组织，将肿瘤组织放入 玻璃均浆器中，加适量无菌生理盐水研磨后，经滤网过滤成单个的细胞悬液，用0.4%台盼蓝染色法计数活细胞数，将细胞浓度调整至5X IO6~5X IO7/ml，用Iml的注射器注射到裸鼠腋下(或腹股沟)皮下组织内，每点(即每个接种的部位)接种0.2ml，每例接种25只，共5例。
[0025]步骤4:病理学检查
[0026]原代与传代荷瘤鼠均于接种后9周处死，所有荷瘤鼠均剖出肿瘤组织，10%甲醛固定，制作石蜡切片，苏木素一伊红(HE)染色，光镜下观察，并与患者原发肿瘤进行对比。
[0027]表1、表2分别是原代荷瘤鼠与传代荷瘤鼠移植成瘤率的高低以及肿瘤生长的变化。原代接种共50只，成活20只，成功率为40% (20/50)，传代接种共125只，成活93只，成功率为74.4% (93/125)。见表1和表2。可见，通过传代移植后，成功率更高，因此，在建模的过程中增加传代移植建模，可降低本发明建模的成本。
[0028]表1原代裸鼠皮下移植瘤成活率及潜伏期(Xfs) (η = 10)
[0029]观察指标
[0030]
组别成话例数成话率14潜伏期(d )
第—例33015.66 士 1.52
第二例44014.33 士 2.51
第三例55013.66 士 2.08
第四例44013.33 士 2.43
第五例44014.63 士 2.32[0031]表2传代裸鼠皮下移植瘤成活率及潜伏期(rfs) (η = 25)
[0032]观察指标
[0033]
【权利要求】
1.一种人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、从刚离体的大肠癌标本上切取肿瘤边缘鱼肉样的无坏死肿瘤组织，用生理盐水反复冲洗后浸泡于含双抗的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往实验室，在超净工作台上取出标本，放入培养皿中，用含双抗的PBS液反复冲洗，剪除标本外部的脂肪及坏死组织；所述双抗为青霉素和链霉素，两者浓度均为500U/ml ； (2)、在培养皿中，用眼科剪将肿瘤组织剪成0.8-1.3mm3的小块； (3)、原代移植，用浓度为70mg/kg的戊巴比妥钠经腹腔注射裸鼠，用镊子将肿瘤组织块塞到20号穿刺针的针孔中，然后用穿刺针移植于裸鼠腋下或腹股沟皮下组织内，或于裸鼠皮肤上剪一小切口，经切口在皮下组织内适度分离出一小腔隙，用眼科镊将肿瘤组织块塞入腔隙内，最后缝合切口 ；每例标本原代接种10只裸鼠，共5例； (4)、原代移植后，用游标卡尺测量肿瘤的最大直径Dmax和最小直径Dmin，按公式V=1/2 X Dmax X Dmin2计算肿瘤体积，待原代荷瘤鼠的瘤体达300~500mm3时，随机取其中I只进行传代； (5)、传代移植，将随机选取的荷瘤鼠I只采用拉脱颈椎法处死动物，体表消毒，无菌条件下剖出移植瘤组织 ，将肿瘤组织放入玻璃均浆器中，加适量无菌生理盐水研磨后，经滤网过滤成单个的细胞悬液，用0.4%台盼蓝染色法计数活细胞数，将细胞浓度调整至5X IO6~5X107/ml，用Iml的注射器注射到荷瘤鼠腋下或腹股沟皮下组织内，每点接种0.2ml，每例接种25只，共5例。
2.根据权利要求1所述的人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，步骤2还包括用眼科剪在剪切过程中向肿瘤组织上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持湿润。
3.根据权利要求1所述的人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，在步骤5之后，还包括以下步骤: 将原代与传荷瘤鼠均于接种后9周处死，所有荷瘤鼠均剖出肿瘤组织，10%甲醛固定，制作石蜡切片，苏木素一伊红染色，光镜下观察，并与患者原发肿瘤进行对比。
【文档编号】A61D1/00GK103976803SQ201410225860
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】颜登国, 张东兴, 龚慧 申请人:贵阳医学院附属医院