一种冠耳霉th130914及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种冠耳霉(Conidiobolus?coronatus)TH130914及其应用，该冠耳霉TH130914于2014年4月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?No.9019。本发明是初次从家蝇体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对家蝇成虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于家蝇的防治。
【专利说明】-种冠耳霉TH130914及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物【技术领域】，尤其涉及一种冠耳霉TH130914及其应用。
【背景技术】
[0002] 家蝇Musca domestica是重要的卫生害虫，它不仅能污染食物使食品变质，而且还 能通过其机体携带病原微生物传播疾病。对家蝇的防治，杀虫剂的研制也从第一代有机氯 开发到了第四代拟除虫菊酯卫生杀虫剂。化学杀虫剂虽然具有见效快、成本低的优点，但蝇 类的生活周期短（15?18天），分布范围广，繁殖能力强，无滞育现象。若常年用药防治次 数过多，不仅会造成严重的环境污染，而且易杀死蝇类的天敌，并使目标害虫产生抗药性。 这些负面影响使人们在防治中更加关注起生物防治。生物防治对人、畜、植物安全，害虫极 少或不产生抗性，有利于环境保护。因此，研究蝇类的生物防治，避免或减少因不合理使用 化学农药所带来的抗药性问题，已成为蝇类科学治理和可持续控制的重要课题。
[0003] 冠耳霉Conidiobolus coronatus (Cost. ) Batko属于接合菌亚门虫霉目新月霉科 耳霉属。据记载，冠耳霉可侵染扁豆姆Aphis craccivora (Koch.)(同翅目：姆科）、桃虫牙 Myzus persicae (Sulzer)(同翅目：虫牙科）、大青叶[ll单 Tettigella viridis (Linn.)、蚁、舞毒 蛾幼虫、毛蠓Psychoda sp等，而家蝇的侵染还未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种冠耳霉TH130914及其应用，旨在克服现有冠耳霉未 发现能寄生家蝇的不足，通过生物技术手段防治蝇类，避免或减少因不合理使用化学农药 所带来的抗药性问题。
[0005] 本发明是这样实现的，一种冠耳霉（Conidiobolus coronatus)TH130914,于 2014 年4月8日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9019， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006] 本发明的进一步的目的在于提供上述冠耳霉TH130914在家蝇防治方面的应用。 本发明于2012年9月，在云南省玉溪市通海县田间调查时发现冠耳霉在家蝇中大量发生流 行，引起大量家蝇感染死亡。因此，该菌株是目前国内首次发现的寄生家蝇、流行性很强的 虫生真菌，在防治家蝇中具有很大的开发应用前景。
[0007] 本发明从罹病家蝇成虫上分离获得冠耳霉野生菌株，将野生菌株回接于家蝇成虫 上复壮得到冠耳霉菌株，对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强 的冠耳霉菌。在光学显微镜（400倍）可以看到在该菌株的分生孢子球形，具乳突。在SDAY 培养基上培养时，生长旺盛，菌落表面白色像一层雪，少许脑折状。背面褶皱。初生分生孢 子大小为（39. 42±3· 57) μπιΧ (32. 41±3· 04) μπι[(30· 40 ?45. 50) X (24. 76 ?40. 22)] μπι，L/D = (1.22±0. 10) [(1.01?1.38)]，次生分生孢子与初生分生孢子形状相似，但 顶部无乳突，大小差异较大，大小为（23. 34±5. 24) μπιΧ(21.66±5. 45) μπι[(15. 87? 36. 38) X (13. 28?35. 56) ] μ m ;产生柔毛孢子和小分生孢子。在SDAY培养基上生长较快， 接种后24小时开始菌落直径日增长0. 45cm。
[0008] 相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明是初次从家蝇 体上分离得到的菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对家 蝇成虫致病力强，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于家蝇的防治。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是冠耳霉感染的家蝇及病原真菌的形态特征图；其中，a图为被冠耳霉 TH130914感染的家蝇；b图为初生分生孢子；c.图为次生分生孢子；d图为小分生孢子；e图 为柔毛孢子；f图为分生孢子梗。
【具体实施方式】
[0010] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0011] 实施例一、病原菌的分离、鉴定
[0012] 1.1材料与方法
[0013] 1. 1. 1 材料
[0014] 在云南省通海县采集到被一种虫生真菌侵染后的摧病家蝇Boettcherisea peregrine (Diptera :Sarcophagidae)成虫。
[0015] 萨氏培养基（SDAY) :1%蛋白胨+1%酵母粉+4%葡萄糖+1.5?2%琼脂粉 +1000ml 水。
[0016] 无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅（12rC，30min)，接种等操作 均在超净工作台内进行。
[0017] 培养条件：置于25°C光照（12L :12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管 SDAY斜面，培养2?3天，转入4°C冰箱储存。
[0018] 1. 1. 2病原菌的分离和纯化
[0019] 分离：从罹病家蝇成虫尸体上分离病原菌。将家蝇成虫罹病虫体带回实验室，将处 理好的家蝇成虫尸体用双面胶粘于培养盖上，再将该培养皿盖盖于含有SDAY培养基的培 养皿上。在温度为25°C条件下培养，长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、 产孢能力强的菌株冠耳霉C. coronatus(Cost. )Batko,转移到SDAY斜面上生长3?4天，在 4 °C冰箱储存。
[0020] 复壮：将分离到的菌株在SDAY上培养2?3天后，产生大量分生孢子，再将该分 生孢子挑入含1%吐温-80的无菌水，用玻璃棒搅拌均匀，得到适当浓度（10 8孢子/ml)的 孢子悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于家蝇成虫体表（以虫体表面湿润为度），保持相对湿度 80%以上。收集死虫并保湿，得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。
[0021] 纯化：挑取培养基上分生孢子粉，再次接种在新的培养基上。如此培养2?3代， 菌株就被纯化。
[0022] 1.1. 3病原菌的鉴定
[0023] 根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40X 10倍显光学 微镜，镜检菌丝、绒毛孢子和分生孢子的形态。
[0024] 1. 2 结果
[0025] 从被虫生真菌自然侵染的家蝇成虫虫体上分离获得野生菌株，在萨氏琼脂培养基 (SDAY)上培养，并回接于家蝇成虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的 菌株，即冠耳霉TH130914。
[0026] 在光学显微镜（400倍）下，如图1所示，可以看到初生分生孢子大小为 (39. 42±3· 57) μ mX (32. 41±3· 04) μ m[(30. 40 ?45. 50) X (24. 76 ?40. 22)] μ m， L/D = (1. 22±0. 10) [(1.01?1. 38)]，次生分生孢子与初生分生孢子形状相似，但顶 部无乳突，大小差异较大，大小为（23. 34±5. 24) μπιΧ (21.66±5. 45) μπι[(15. 87? 36. 38) X (13. 28?35. 56) ] μ m ;具柔毛孢子和小分生孢子。
[0027] 根据田间感染症状\采集罹病虫体室内分离观察，并根据《中国真菌志第十三卷： 虫霉目》（李增智，2000)有关冠耳霉感染症状、分生孢子及柔毛孢子和小分生孢子的形态特 征进行鉴定，确定为冠耳霉。
[0028] 实施例二、冠耳霉纯化菌株生物学特性
[0029] 2. 1材料与方法
[0030] 2. 1. 1供试菌株
[0031] 选择纯化后生长旺盛、生长均匀的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到SDAY 上，于25°C的恒温光照（12L:12D)培养箱中培养。
[0032] 2. 1. 2菌落生长速率和产孢量的测定
[0033] 将事先培养好的冠耳霉取一皿用8mm的打孔器打孔，接种于另外一个培养基上， 做3个重复，置于25°C的恒温光照（12L:12D)培养箱中培养，每天定时测定其直径并记录， 直到菌落长满培养基为止。用直径为8_的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，加1 %吐 温-80和15mL SDY (萨氏培养液）中，25°C、80r/min振荡培养48h，再转入40mL SDY (萨氏 培养液）中，恒温箱中培养48h，所得菌液为初始接种液。初始接种液每10ml转到含40mL 的SDY (萨氏培养液）中在20°C，80r/min振荡培养72h，取菌液15ml均匀涂布于水琼脂平 板（90_)上，用滤纸吸去多余水分，5点法放置5块盖玻片（15 X15mm)。产孢盛期将平板 倒置，使暴露在平板上主动弹落的分生孢子落下，每隔4h时更换盖玻片，在显微镜下每个 盖玻片上观察3个视野，记数单位面积上孢子数量。同时，另取10mL菌丝液移至事先称重 的滤纸上，用蒸馏水清洗3次后，在50°C下烘干3h后测定菌丝干重。
[0034] 单位菌丝体产孢量（孢子/mg)，C的计算公式为C = D π rV (VW)，其中D为累计产 孢浓度（孢子，mm2)，r为水琼脂平板半径，V为菌液体积，W为菌丝生物量（mg/mL) (Feng et al. , 1998) 〇
[0035] 2. 1. 3孢子萌发率的测定
[0036] 将菌株培养2?3天，分别用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻 片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加 几滴无菌水保持湿度在100% RH，培养24小时后镜检，每个处理3次重复。
[0037] 2. 2 结果
[0038] 在SDAY培养上于25°C条件下生长良好，表1结果表明，培养前3天时菌落直径 平均生长速度为0. 76cm/d，其中在培养24、32、36h时菌落生长速度分别为3. 34,4. 71和 6. 02cm/d。表2结果表明，该菌株产孢快、产孢量较高，培养至第2天时产孢量可达6. 7 X 105 孢子/mg。表3结果表明，24小时孢子的萌发率平均可以达到85%左右，表明该菌株的生长 情况较好，生物学活性较好。
[0039] 表1菌落直径的生长速度
[0040]
【权利要求】
1. 一种冠耳霉（Conidiobolus coronatus) TH130914,于2014年4月8日保藏于中国微 生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9019。
2. 权利要求1所述的冠耳霉TH130914在家蝇防治方面的应用。
【文档编号】A01N63/04GK104059856SQ201410279668
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】肖关丽, 杜广祖, 陈斌, 李正跃, 桂富荣, 和淑琪, 严乃胜 申请人:肖关丽