一种用于松材线虫杀害作用的凤仙花制备方法
【专利摘要】有松材线虫杀灭作用的凤仙花（Impatiens?balsamina?L）制备方法，新鲜凤仙花及经烘晒所得干凤仙花，均包含整株植物及茎、叶、花、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和，直接榨汁应用，以及经过有机溶剂如石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上混合溶剂提取的提取物及残渣，直接应用或制成各种制剂。本发明方法简单、易于操作，降低了对松材线虫的防治成本，能够从多方面及时有效地杀灭松材线虫，如降低生存率、由于神经系统受到破坏导致运动行为降低、降低繁殖能力等。
【专利说明】一种用于松材线虫杀害作用的凤仙花制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物源农药【技术领域】，特别涉及对松材线虫有杀害作用的凤仙花的制 备方法。
【背景技术】
[0002] 凤仙花L)凤仙花科（Balsaminaceae)凤仙花属 -年生草本植物(别名：透骨草、指甲花、小桃红、凤仙草、旱珍珠等)。凤仙花 属共有植物900余种，全球均有分布。凤仙花L.)作为观赏植物国 内外均有种植，也是该属植物的常见品种，其全草及花、莖、叶、果皮、种子、根在民间有悠久 的药用历史，被广泛用于治疗腰胁痛、蛇咬伤、鹅掌风、手足癣病、灰指甲、甲沟炎、风湿 性关节炎、痈疖疮疔、胎衣不下、溃疡日久不愈和经闭腹痛等，2010年版《中国药典》收载 其种子急性子作为药用部位。凤仙花的化学成分主要有黄酮、萘醌、香豆素、有机酸、花青素 和甾醇类。现代药理研究表明凤仙花具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗过敏、止痒、镇痛和抑制fct 信号通道等活性[η]。但未见有关制备农药的资料报道和产品，利用凤仙花适应性强，耐旱 耐瘠薄，生长迅速，养护管理粗放的优势，大力开发相关农药产品，不仅可提高产品的附加 值，而且还可以控制松材线虫的危害而减免经济损失。
[0003] 松树是丘陵山区和风景名胜区的主要造林绿化树种，1982年，江苏省因松材线虫 ^:_77〇/7力27〇5·)病死亡松树仅265株，而到2002年秋普查时，全省因松材 线虫病危害而死亡松树达47万株；由此可见松材线虫病传播很快，危害非常重。它既具有 一般病虫害的普遍性，更具有自身的特殊性。松材线虫病发生早期，只危害黑松，现在已对 马尾松普遍产生危害，目前病死树中马尾松约占42%，海岸松、黄松、白皮松、湿地松也受害 死亡。病害发生初期，主要分布于人为活动频繁区域，现已向林区深处扩展。一是蔓延速度 惊人，以江苏省为例，短短19年，疫区已由南京东郊极小的危害区域迅速扩展蔓延到20个 县区；二是早期以疫区为中心逐步向四周扩散为主，后期在以疫区为中心向四周扩散的同 时，出现大跨度、长距离、跳越式的扩散，外围疫点相继增多。虽然采取了化学防治，实施飞 防、注干和释放天敌等综合治理措施，松材线虫病发生面积仍占全省松林面积的14. 7%，特 别是重点保护区、风景区。多年实践说明，松材线虫病防治关键在"预防"，疫情发生时能有 效杀死，寻找高效杀死松材线虫的药物已迫在眉睫。
[0004] 秀丽隐杆线虫e/egafls)属于线形动物门、线虫纲动物，是近年 来用于环境评价及毒理学研究的经典模式生物，生活在世界各地的泥土中，以细菌为食，容 易人工养殖，对人、动物和植物没有危害，非寄生，安全性高，且标本便宜，在实验室中容易 掌控。它能感知气味和味道，对光线、温度有反应。生命周期短(个体从一个受精卵发育成 可以产卵的成虫只需3天左右)，可进行多评价终点评价（如存活率、生殖、寿命、运动行为、 代谢等)，具有极其丰富的遗传与发育研究背景，对于环境胁迫的应激反应十分敏感，环境 胁迫会改变它们的生殖速度、生命周期以及其他发育特性。无论是利用胚胎发育来检测毒 物的毒性试验，还是在分子生物学水平对毒物进行分析，秀丽线虫都是比较可靠而有效的 模式生物。秀丽线虫是国内外研究的模式生物中最为简单、遗传与发育背景了解最清楚的 物种之一。松材线虫与秀丽隐杆线虫具有相似的发育周期及生活习性，氨基酸序列的一致 性为85%，根据多序列比对结果，及用MEGA 4. 0软件Neighor-Joining法构建的系统进化树 进行分析，同其它的植物寄生虫相比，松材线虫与秀丽隐杆线虫的亲缘关系比较近，本发明 从秀丽隐杆线虫生存率的下降、运动行为的下降、繁殖能力的降低等多个方面，说明凤仙花 可以用于松材线虫的预防及杀灭。
[0005] 参考文献：
[1] 鞠培俊，孔德云，李晓波.凤仙花化学成分及药理作用研究进展[J].沈阳药科 大学学报，2007, 24 (5) : 320?324·
[2] 苏秀芳，蓝金.凤仙花的化学成分及药理活性研究进展[J].南宁师范高等专科 学校学报，2010, 27(3) : 13?Ιδη] 胡喜兰，朱慧，刘存瑞，屠鹏飞等.凤仙花的化学成分研究 [J]. 中成 药，2003, 25(10) : 833?834.
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供有松材线虫杀害作用的凤仙花的制备方法。本方法操作简 单，大大降低了松材线虫的防治成本。
[0007] 有松材线虫杀害作用的凤仙花制备方法，其特征在于： 1)新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部 位的总和，切碎成小块，榨汁直接应用。
[0008] 2)新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六 个部位的总和，用热水及冷水提取的提取物及残渣。
[0009] 3)新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六 个部位的总和，经单一有机溶剂、两种或两种以上混合溶剂或体积百分比浓度为20?80% 的该有机溶剂与水的混合物等溶剂提取物及残渣。
[0010] 4)凤仙花粉：新鲜凤仙花（包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个 以上部位的总和）经烘晒得到干花，干花经粉碎成细粉。
[0011] 5)凤仙花粉包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总 和，经石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙 酯、丙酮、丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两 种以上混合溶剂提取的提取物及残渣。
[0012] 本发明中，所说的凤仙花是新鲜花及经烘晒所得干花，均包含花、茎、叶片、果皮、 种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和，榨汁直接应用。所说的溶剂是石油醚、正己 烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、丁酮、异丙 醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上混合溶剂提取 的提取物及残渔，直接应用或制成乳油、微乳剂、可湿性粉剂等各种制剂，用于以松线虫杀 害为目的药物。
[0013] 本发明以新鲜凤仙花或凤仙花干花为原料，经适当处理或提取，对秀丽隐杆线虫 急性暴露后的身体弯曲、头部摆动、生存率、生殖率等均有显著影响，且与浓度存在依存关 系，表明凤仙花有一定的线虫杀害作用。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】： 附图1 :凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生存率的影响 附图2 :凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响 附图3 :凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫头部摆动的影响 附图4 :凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生殖率的影响
【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。 本发明所用缩略语具有本领域技术人员通常所理解和熟知的含义。
[0015] 实施例1 : 一、样品制备： 新鲜的凤仙花的茎经冷冻干燥，称取冻干样品50 g，粉碎，过40目筛，加入55%乙醇 300 mL室温进行渗漏提取，渗漏液经新华滤纸过滤，滤液用旋转蒸发仪于45 °C减压蒸去乙 醇，粗提物冷冻干燥，得率为18.62 %，-20°C储存备用。
[0016] 二、秀丽隐杆线虫实验： 野生型秀丽隐杆线虫C.elegans Bristol N2,处于同一发育时期的L1期（同步化24 h)线虫随机加入12孔板(每孔含50条虫子)，以K-medium为培养液，加入大肠杆菌EColi. 0P50为食物，经不同浓度的凤仙花茎提取物及空白对照暴露48小时（20 °C培养）。凤仙花 茎提取物：用DMS0溶解成母液，稀释成实验浓度，DMS0终浓度均为0. 5%。空白对照组：0. 5% DMS0,均置于4 °C冰箱避光保存。采用体视显微镜观察，丢失的线虫、因爬到培养皿壁而死 亡的线虫以及虫袋应从统计数据中排除；实验均重复3次，采用SPSS16.0软件进行如下 测定指标的单因素方差分析。
[0017] 1.凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生存率的影响： 凤仙花茎提取物为〇. lmg/mL时，生存率为99. 67%，与空白对照组比较没有差异；凤仙 花茎提取物为1. 〇mg/mL时，生存率为99. 0%，与空白对照组比较有差异（P〈0. 05);凤仙花 茎提取物为5. Omg/mL、10. 0 mg/mL时，生存率分别为92. 8%、87. 5%，与空白对照组比较均有 显著差异（P〈0.01)，见附图1。
[0018] 2.凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响： 身体弯曲频率，将已发育为成虫的线虫挑到一个不含有0P50的NGM培养基上，记录 下20s内身体弯曲的次数，假定沿着咽泵的方向为y轴，那么线虫爬行过程中身体沿着相 应X轴方向上的1次改变定义为1个身体弯曲；凤仙花茎提取物为〇. lmg/mL时，身体弯 曲下降了 3. 32%，与空白对照组没有差异；凤仙花茎提取物为1. Omg/mL时，身体弯曲下降了 4. 40%，与空白对照组比较有差异（P〈0· 05);凤仙花茎提取物为5. 0mg/mL、10. 0 mg/mL时， 身体弯曲分别下降了 18. 47%、33. 33%，与空白对照组比较均有显著差异（P〈0.01)，见附图 2〇
[0019] 3.凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫头部摆动的影响： 头部摆动频率，将已发育为成虫的线虫挑入NGM(不含有0P50)培养基中，经过lmin的 恢复，向其身体滴一滴蒸馈水，记录线虫在lmin内头部摆动的次数，当身体弯曲达到体长 的一半作为1次头部摆动；凤仙花茎提取物为0. lmg/mL时，头部摆动下降了 1.81%，与空 白对照组没有差异；凤仙花茎提取物为1.0mg/mL时，头部摆动下降了 2. 68%，与空白对照组 比较有差异（P〈〇· 05);凤仙花茎提取物为5. 0mg/mL、10· 0 mg/mL时，头部摆动分别下降了 16. 38%、30. 55%，与空白对照组比较均有显著差异（P〈0.01)，见附图3。
[0020] 4.凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生殖率的影响： 生殖率即后代数目，指一条线虫在整个产卵期的所有卵数；凤仙花茎提取物为0. lmg/ mL时，子代数目下降了 1. 06%，与空白对照组没有差异；凤仙花茎提取物为1. Omg/mL时，子 代数目下降了 2. 16%，与空白对照组比较有差异（P〈0. 05);凤仙花茎提取物为5. Omg/mL、 10. 0 mg/mL时，子代数目分别下降了 8. 71%、15. 60%，与空白对照组比较均有显著差异（P 〈0.01)，见附图4。
【权利要求】
1. 有松材线虫杀害作用的凤仙花制备方法： 其特征在于： 鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的 总和，切碎成小块，榨汁直接应用； 鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的 总和，用热水及冷水提取物及残渣； 鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的 总和，经单一有机溶剂、两种或两种以上混合溶剂或体积百分比浓度为20?80%的该有机 溶剂与水的混合物等溶剂提取物及残渣； 干凤仙花粉：新鲜凤仙花（包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上 部位的总和）经烘晒得到干花，干花经粉碎成细粉； 凤仙花粉包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和，经石 油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、 丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上混 合溶剂提取的提取物及残渣。
2. 根据权利1所述的凤仙花杀害松材线虫物质的制备方法，其特征在于所说的凤仙花 是新鲜花及经烘晒所得干花，均包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上 部位的总和。
3. 根据权利1所述的凤仙花杀害松材线虫物质的制备方法，其特征在于所说的溶剂 是石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙 酮、丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上 混合溶剂提取的提取物及残渣。
4. 根据权利1至3所述的凤仙花杀害松材线虫物质的制备方法，其特征在于新鲜凤 仙花及经烘晒所得干花各部位直接应用，或经过有机溶剂提取物及残渣直接应用或制成乳 油、微乳剂、可湿性粉剂等各种制剂，用于松材线虫的杀灭。
【文档编号】A01P5/00GK104137857SQ201410354206
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】姜洪芳, 张卫明, 壮子恒 申请人:中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所