黄果银桦的离体培养再生植株方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄果银桦的离体培养再生植株方法，该方法是采集生长健壮，无病虫害的黄果银桦树冠顶端的半木质化的枝条，清洗后切取2~3厘米的带1~2个腋芽的茎段，将茎段经过消毒、无菌水冲洗，在人为控制条件下诱导腋芽萌发，切取萌发的无菌芽，接种于增值培养基，诱导丛生芽生长，扩大繁殖数量；将丛生芽切成单芽诱导生根，获得完整的组培生根瓶苗，然后将生根的组培瓶苗移入基质中培养，待长出新芽新根后，移植到花盆中培育大苗。本发明方法可克服黄果银桦组培繁殖技术中存在的污染率高、褐化严重、诱导率低、移植成活率低的问题，实现黄果银桦的快速繁殖培育，对山龙眼科银桦属植物在中国园林绿化中的广泛推广有着重要意义。
【专利说明】黄果银桦的离体培养再生植株方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种离体培养再生植株方法，具体是一种黄果银桦的离体培养再生植 株方法，属于生物离体组织培养育苗【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 银桦，别名絹柏，丝树，银橡树，原产大洋洲，常绿，树干笔直，树形美观，尤其在开 花季节，万绿丛中衬以橙黄色的花朵，为风景树和行道树，中国广东、广西、云南各城镇均引 种，为城市主要绿化树种之一。本种树干通直，高大伟岸，树冠整齐，宜作行道树、庭荫树；亦 适合农村"四旁"绿化，宜低山营造速生风景林、用材林。在较冷地区也有作为室内观赏植物 栽培的。木材粗糙而坚硬，色淡红，断面上现有美丽斑纹，髓线排列甚密，弹力和耐朽力强， 施工容易，可供家具，雕刻，装饰和车辆制造等用途。
[0003] 黄果银桦（Grevillea orange marmalade)是山龙眼科银桦属常绿中型屏风型灌 木，高1~4米，圆形树冠，枝叶茂盛；叶片灰绿色，长披针形；花橙色或金黄色，三脚架花型， 富含蜜糖，花期为春秋冬。原产澳大利亚，全阳性植物，适应于排水良好、肥沃的酸性沙土， 中度耐霜冻、耐旱、耐高温，抗污染。黄果银桦是具有澳洲风情、地中海风情、海滨风情和热 带风情的树种。澳大利亚广泛应用于路边街景、庭园绿化、绿篱和盆栽，是具有挡风，吸引食 蜜动物的重要植物。
[0004] 常用于培育银桦苗木的传统方法为播种繁殖，效率较低，苗木成活率也较低，无 法满足大批量供应的需求。现有技术中已有关于银桦的培育和快速繁殖技术如下：CN 102301909A公开了一种橙黄银桦高效快速繁殖的方法，它通过选择合适的插条，对插条进 行适当的处理，在适宜的扦插繁殖时期，扦插在装有营养土的营养杯中，放置于扦插荫棚内 进行繁殖保育管理，再经适当的栽培管理技术，而获得优质橙黄银桦种苗；此类扦插的方法 往往存在获得的扦插苗根系较差，不能形成主根、生根较少、扦插后成活率较低的不足。CN 200910214053. 2公开了一种快速繁育红花银桦的方法，主要包括材料的选择和消毒、愈伤 组织的培养、愈伤组织的增殖、不定芽的诱导及扩繁、不定芽的生根培养、移栽和炼苗等步 骤。
[0005] 现有山龙眼科银桦属植物组织培养技术存在污染率高、褐化严重、诱导率低、移植 成活率低、生产成本高，难于适应大量苗木需求的发展。未见一种黄果银桦的离体培养再生 植株方法的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种黄果银桦的离体培养再生植株方法，该方法可克服黄果 银桦组培繁殖技术中存在的污染率高、褐化严重、诱导率低、移植成活率低的问题，实现黄 果银桦的快速繁殖培育，对山龙眼科银桦属植物在中国园林绿化中的广泛推广有着重要意 义，对研究山龙眼科银桦属植物组织培养，克服具有极其宝贵的学术研究价值。
[0007] 本发明的技术方案如下：一种黄果银桦的离体培养再生植株方法，包括以下步 骤： (1) 采集外植体及其材料处理：采集生长健壮，无病虫害的5年生黄果银桦树冠顶端的 半木质化的枝条，剪去枝条上的叶片，保留叶柄，装入密封袋里带回试验室；所述材料处理 是先将枝条用洗洁精溶液泡洗15~20分钟，泡洗过程中不断摇动瓶子，用流水冲洗干净，再 用浓度为95%的酒精浸泡10秒钟，然后用流水冲洗3次，洗净后切成2~3厘米的带1~2个 腋芽的茎段； (2) 建立无菌繁殖体：将步骤（1)获得的茎段在无菌实验室里用75%酒精灭菌广2分 钟，再用0. 1%氯化汞溶液灭菌ΚΓ15分钟，然后用无菌水清洗3~4次，一瓶一个茎段接种于 MSI培养基上，在培养室内进行培养，诱导腋芽萌发；所述培养条件为：室温2(T30°C，每日 光照8~12小时，光照强度80(T2000LX，培养3(Γ32天；当从叶腋萌发出绿芽，经分割、转接 并能够使绿芽连续生长繁殖，完成无菌繁殖体的建立； (3) 增殖培养：将步骤（2)获得的无菌繁殖体接种于MS2的增殖培养基中，放置在人为 控制室温为3(T32°C，每日光照8?12小时，光照强度80(T2000LX的条件下培养3(Γ32天，从 叶腋萌发出无菌绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增 殖倍数5飞倍，在无菌条件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖； (4) 生根培养：当步骤（3)的增殖培养过程中，丛生芽高20毫米以上时，将丛生芽从基 部切下，分割成单株接种于MS3生根培养基中，放置在室温2(T30°C左右，每日光照8~12小 时，光照强度在80(T2000LX的条件下培养2(Γ25天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下 温室中炼苗疒14天，生根瓶苗叶片展开，茎芽生长健壮，形成完整植株； (5) 移植：将培养得到的根系生长良好的瓶苗移入温室驯化，瓶苗从人为控制培养条件 并给予营养元素到适应自然环境条件，并自我吸取养份的驯化过程后，将其移植到装有育 苗营养基质的育苗杯中；移植方法是：将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在幼苗上的培养基， 将幼苗移植到填满营养基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系， 一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水； (6) 幼苗培育：移植后的幼苗在一个月内要加强水肥管理及病防虫防治，并适当遮荫， 保证幼苗成活，当幼苗生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照 常规管理，幼苗培育至15厘米高时，可移上大一号花盆培育大苗。
[0008] 所述MSI培养基为初代培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加500ml蒸馏水， 加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分， 加水至1000ml，搅拌均匀，pH调至5.8,装瓶、灭菌，备用；所述培养基配方中的营养元 素成分及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤0.05?5.0mg/L、萘乙酸0.01?0. 5mg/L、NH4N03 990?1650mg/L、KN03 114(Tl900mg/L、CaCl22H20 24(T400mg/L、MgS047H20 74?370mg/L、 ΚΗ2Ρ04 102?170mg/L、ΚΙ 0· 5?0· 83mg/L、H3B03 3· 72?6. 2mg/L、MnS044H20 13. 38?22. 3mg/ L、ZnS047H20 5.16?8.6mg/L、NaM〇022H20 0.15?0.25mg/L、CuS045H20 0.015?0.025mg/L、 C〇C126H20 0· 015?0· 025mg/L、Na2EDTA 22. 38?37. 3mg/L、FeS047H20 16. 68?27. 8mg/L、肌醇 6(Tl00mg/L、烟酸0· 3?0· 5mg/L、盐酸吡哆醇0· 3?0· 5mg/L、烟酸硫胺素0· 06?0· lmg/L、甘 氨酸 1. 2?2. Omg/L、鹿糖 30000mg/L。
[0009] 所述MS2培养基为增殖培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加500ml蒸馏水，力口 热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分，力口 水至1000ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述培养基配方中的营养元素成分 及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤0· 05?0· 2mg/L、萘乙酸0· 1?0· 3mg/L、活性炭1. (Γ3. 0g/ L、NH4N03 990?1650mg/L、KN03 1140?1900mg/L、CaCl22H20 240?400mg/L、MgS047H20 222?370mg/L、KH 2P04 102?170mg/L、KI 0· 5?0· 83mg/L、H3B〇3 3. 72?6. 2mg/L、MnS044H20 13. 38?22. 3mg/L、ZnS047H20 5. 16?8. 6mg/L、NaMo022H20 0· 15?0· 25mg/L、CuS045H20 0. 015?0. 025mg/L、CoC126H20 0. 015?0. 025mg/L、Na2EDTA 22. 38?37. 3mg/L、FeS047H20 16.68?27.811^/1、肌醇60?10011^/1、烟酸0.3?0.511^/1、盐酸吡哆醇0.3?0.511^/1、烟酸硫 胺素 0.06?0.1mg/L、甘氨酸 1.2?2.0mg/L、鹿糖 30000mg/L。
[0010] 所述MS3培养基为诱导生根培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加500ml蒸馏 水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成 分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养元素成分 及其质量配比如下：萘乙酸 (Γ4. Omg/L、活性炭 L (Γ3. Og/L、NH4N03 20(T800mg/L、KN03 250?900mg/L、CaCl22H20 50?200mg/L、MgS047H20 222?370mg/L、Ca(N03)2 200?400mg/L、 KH2P04 102?170mg/L、KI 0· 5?0· 83mg/L、H3B03 3. 72?6. 2mg/L、MnS044H20 13. 38?22. 3mg/ L、ZnS047H20 516?8.6mg/L、NaM〇022H20 0.15?0.25mg/L、CuS045H20 0.015?0.025mg/L、 C〇C126H20 0· 015?0· 025mg/L、Na2EDTA 22. 38?37. 3mg/L、FeS047H20 16. 68?27. 8mg/L、肌醇 5(Tl00mg/L、烟酸 0.25?0.5mg/L、盐酸吡哆醇 0.5?l.Omg/L、烟酸硫胺素 0.1 ?0.25mg/L、 甘氨酸 l.〇?2.0mg/L、蔗糖 1500(T30000mg/L。
[0011] 优选的，MS1、MS2、MS3培养基配方中的营养元素成分及其质量配比分别如下： (1)MS1 培养基：6?苄基腺嘌呤 2.5mg/L、萘乙酸 0.25mg/L、NH4N03 1650mg/L、KN03 1900mg/L、CaCl22H20 400mg/L、MgS047H20 370mg/L、KH2P04 170mg/L、ΚΙ 0· 83mg/L、H3B〇3 6. 2mg/L、MnS044H20 22. 3mg/L、ZnS047H20 8. 6mg/L、NaMo022H20 0· 25mg/L、CuS045H20 0· 025mg/L、CoC126H20 0· 025mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeS047H20 27. 8mg/L、肌醇 100mg/ L、烟酸0.5mg/L、盐酸批咳醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L、鹿糖 30000mg/L〇
[0012] (2)MS2培养基：6?苄基腺嘌呤0· lmg/L、萘乙酸0.2mg/L、活性炭2.0 g/L、 NH4N〇3 1650mg/L、KN〇3 1900mg/L、CaCl22H20 400mg/L、MgS047H20 370mg/L、KH2P04 170mg/ L、KI 0· 83mg/L、H3B03 6. 2mg/L、MnS044H20 22. 3mg/L、ZnS047H20 8. 6mg/L、NaMo022H20 0· 25mg/L、CuS045H20 0· 025mg/L、C〇C126H20 0· 025mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeS047H20 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸批卩多醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、甘氨 酸 2. 0mg/L、鹿糖 30000mg/L。
[0013] (3)MS3 培养基：萘乙酸 3. 0mg/L、活性炭 2. 0g/L、NH4N03 8 00mg/L、KN03 9 00mg/L、 CaCl22H20 200mg/L、MgS047H20 370mg/L、Ca(N03)2 400mg/L、KH2P04 170mg/L、KI 0.83mg/L、 H3B03 6. 2mg/L、MnS044H20 22. 3mg/L、ZnS047H20 8. 6mg/L、NaMo022H20 0· 25mg/L、CuS045H20 0· 025mg/L、CoC126H20 0· 025mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeS047H20 27. 8mg/L、肌醇 100mg/ L、烟酸0.5mg/L、盐酸批咳醇lmg/L、烟酸硫胺素0.25mg/L、甘氨酸2.0mg/L、鹿糖 30000mg/L〇
[0014] 步骤（5)所述的育苗营养基质优选采用泥炭土、黄心土和珍珠岩按2:3:1的比例 充分混合得到。
[0015] 步骤（6)所述幼苗在移植后的水肥管理方法优选如下：保持基质湿润，空气相对 湿度在95%以上，防止植株失水，培养温度25~28°C，荫棚用75%的遮光网遮光；移植15天 后逐步控制基质水分，相对湿度控制在6(Γ80%，促进新根新芽发生。
[0016] 步骤（6)所述幼苗在移植后的病防虫防治方法优选如下：幼苗移植后第三天采用 0. 1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔1(Γ15天喷雾一次；当有新芽萌发，新根长出时，喷施 1200~1800倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔半个月喷施一次。
[0017] 所述营养液由以下质量配比的药品配制而成：NH4N03 70(T900mg/L、ΚΝ03 800?1000mg/L、CaCl22H20 150?250mg/L、MgS047H20 280?400mg/L、Ca(N03)2 300?500mg/ L、KH2P04 120?220mg/L、KI 0.6?1.0mg/L、H3B03 5?8mg/L、MnS044H20 20?25mg/L、 ZnS047H20 6. 5?10mg/L、NaMo022H20 0· 1 ?0· 5mg/L、CuS045H20 0· 01 ?0· 05mg/L、C〇C126H20 0. 01^0. 05mg/L〇
[0018] 所述营养液优选由以下质量配比的药品配制而成：NH4N03 8 00mg/L、KN03 9 00mg/ L、CaCl22H20 200mg/L、MgS047H20 370mg/L、Ca(N03)2 400mg/L、KH2P04 170mg/L、KI 0.83mg/ L、H3B03 6. 2mg/L、MnS044H20 22. 3mg/L、ZnS047H20 8. 6mg/L、NaMo022H20 0· 25mg/L、 CuS045H20 0. 025mg/L, CoC126H20 0. 025mg/L〇
[0019] 本发明相对于现有技术的有益效果如下：本发明为原产澳大利亚的黄果银桦提 供了一种快速繁殖的方法，对山龙眼科银桦属植物在中国园林绿化中广泛推广有着重要意 义；对研究山龙眼科银桦属植物组织培养，克服污染率高、褐化严重、诱导率低、移植成活率 低等组培繁殖技术具有极其宝贵的学术研究价值。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并 不限制本发明的范围。
[0021] 实施例1采用以下步骤实现本发明。
[0022] 1、采集外植体及材料处理：在广东省佛山市三水区爱嘉农场里，采集生长健壮，无 病虫害的5年生黄果银桦树冠顶端的半木质化的枝条，剪去枝条上的叶片，保留叶柄，装入 密封袋里带回试验室；先将枝条用洗洁精溶液泡洗15分钟，泡洗过程中不断摇动瓶子，用 流水冲洗干净，再用浓度为95%的酒精浸泡10秒钟，然后用流水冲洗3次，洗净后切成2~3 厘米的带1~2个腋芽的茎段。
[0023] 2、建立无菌繁殖体： (1)初代培养基的制备：MSI培养基为初代培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加 500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营 养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5.8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养 元素成分及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤2. 5mg/L、萘乙酸0. 25mg/L、NH4N03 1650mg/ L、KN03 1 900mg/L、CaCl22H20 400mg/L、S047H20 370mg/L、KH2P04 170mg/L、ΚΙ 0· 83mg/L、 H3B03 6. 2mg/L、MnS044H20 22. 3mg/L、ZnS047H20 8. 6mg/L、NaMo022H20 0· 25mg/L、CuS045H20 0· 025mg/L、CoC126H20 0· 025mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeS047H20 27. 8mg/L、肌醇 100mg/ L、烟酸0.5mg/L、盐酸批咳醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2.0mg/L、鹿糖 30000mg/L ； (2)将洗净后的茎段在无菌实验室里用75%酒精灭菌1分钟，再用0. 1%氯化汞溶液灭 菌12分钟，然后用无菌水清洗3~4次，一瓶一个茎段接种于MSI培养基上，在培养室内进行 培养，诱导腋芽萌发，当从叶腋萌发出绿芽，经分割、转接并能够使绿芽连续生长繁殖，完成 无菌繁殖体的建立；培养条件为：室温2(T30°C，每日光照10小时，光照强度100(Tl500LX， 培养30天。
[0024] 3、增殖培养： (1) 增殖培养基的制备：MS2培养基为增殖培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加 500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营 养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5.8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养 元素成分及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤0. lmg/L、萘乙酸0.2mg/L、活性炭2.0 g/L、 NH4N〇3 1650mg/L、KN〇3 1900mg/L、CaCl22H20 400mg/L、MgS047H20 370mg/L、KH2P04 170mg/ L、KI 0· 83mg/L、H3B03 6. 2mg/L、MnS044H20 22. 3mg/L、ZnS047H20 8. 6mg/L、NaMo022H20 0· 25mg/L、CuS045H20 0· 025mg/L、C〇C126H20 0· 025mg/L、Na2EDTA 37. 3mg/L、FeS047H20 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸批卩多醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、甘氨 酸 2. Omg/L、鹿糖 30000mg/L ; (2) 将获得的无菌繁殖体接种于配制好的MS2的增殖培养基中，放置在人为控制室温 为30°C，每日光照10小时，光照强度1600LX的条件下培养32天，从叶腋萌发出无菌绿芽， 剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增殖倍数6倍，在无菌条 件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖。
[0025] 4、生根培养： (1) 生根培养基的制备：MS3培养基为诱导生根培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L 加500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中 的营养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的 营养元素成分及其质量配比如下：萘乙酸3.0mg/L、活性炭2.0g/L、NH4N0 3 8 00mg/L、KN03 900mg/L、CaCl22H20 200mg/L、MgS047H20 370mg/L、Ca(N03)2 400mg/L、KH2P04 170mg/L、KI 0. 83mg/L> H3BO3 6. 2mg/L> MnS044H20 22. 3mg/L> ZnS047H20 8. 6mg/L> NaMo022H20 0. 25mg/L> CuS045H20 0.025mg/L、CoCl26H20 0.025mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、FeS047H20 27.8mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸批卩多醇lmg/L、烟酸硫胺素0.25mg/L、甘氨酸2.0mg/L、鹿糖 30000mg/L ； (2) 增殖培养过程中，丛生芽高22毫米以上时，将丛生芽从基部切下，分割成单株接种 于MS3生根培养基中，放置在室温2(T30°C左右，每日光照10小时，光照强度在1800LX的条 件下培养22天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中炼苗10天，生根瓶苗叶片展 开，茎芽生长健壮，形成完整植株。
[0026] 5、移植： (1) 驯化：将培养得到的根系生长良好的瓶苗移入温室驯化，使瓶苗从人为控制培养条 件并给予营养元素到适应自然环境条件，并自我吸取养份； (2) 移植：用泥炭土、黄心土和珍珠岩按2:3:1的比例充分混合制得营养基质，填满到 育苗杯中，将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在幼苗上的培养基，将幼苗移植到填满营养基质 的育苗杯，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质， 使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水。
[0027] 6、幼苗培育：移植后的幼苗在一个月内要加强水肥管理及病防虫防治，并适当遮 荫，保证幼苗成活，当幼苗生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光 照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，可移上大一号花盆培育大苗。
[0028] 水肥管理的方法：保持基质湿润，空气相对湿度在95%以上，防止植株失水，培养 温度25~28°C，荫棚用75%的遮光网遮光；移植15天之后逐步控制基质水分，相对湿度控制 在75?80%，促进新根新芽发生。
[0029] 病虫防治方法：幼苗移植后第三天采用0. 1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔12 天喷雾一次；当有新芽萌发，新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔 半个月喷施一次；所喷施的营养液是由以下配比的药品配制得到：NH 4N03 8 00mg/L、ΚΝ03 900mg/L、CaCl22H20 200mg/L、MgS047H20 370mg/L、Ca(N03)2 400mg/L、KH2P04 170mg/L、KI 0. 83mg/L> H3BO3 6. 2mg/L> MnS044H20 22. 3mg/L> ZnS047H20 8. 6mg/L> NaMo022H20 0. 25mg/L> CuS045H20 0. 025mg/L, CoC126H20 0. 025mg/L〇
[0030] 实施例2采用以下步骤实现本发明。
[0031] 1、采集外植体及材料处理：在广东省佛山市三水区爱嘉农场里，采集生长健壮，无 病虫害的5年生黄果银桦树冠顶端的半木质化的枝条，剪去枝条上的叶片，保留叶柄，装入 密封袋里带回试验室；先将枝条用洗洁精溶液泡洗18分钟，泡洗过程中不断摇动瓶子，用 流水冲洗干净，再用浓度为95%的酒精浸泡10秒钟，然后用流水冲洗3次，洗净后切成2~3 厘米的带1~2个腋芽的茎段。
[0032] 2、建立无菌繁殖体： (1) 初代培养基的制备：MSI培养基为初代培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加 500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的 营养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营 养元素成分及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤3. Omg/L、萘乙酸0. 2mg/L、NH4N03 9 90mg/ L、KN03 1140mg/L、CaCl22H20 240mg/L、MgS047H20 222mg/L、KH2P04 102mg/L、KI 0.5mg/L、 H3B03 3.7mg/L、MnS044H20 13.38mg/L、ZnS047H20 5.2mg/L、NaMo022H20 0.15mg/L、CuS045H20 0· 015mg/L、C〇C126H20 0· 015mg/L、Na2EDTA 22. 38mg/L、FeS047H20 16. 68mg/L、肌醇 60mg/ L、烟酸0.3mg/L、盐酸批卩多醇(X3mg/L、烟酸硫胺素0.06mg/L、甘氨酸L2mg/L、鹿糖 30000mg/L ； (2) 将洗净后的茎段在无菌实验室里用75%酒精灭菌1分钟，再用0. 1%氯化汞溶液灭 菌10分钟，然后用无菌水清洗3~4次，一瓶一个茎段接种于MSI培养基上，在培养室内进行 培养，诱导腋芽萌发，当从叶腋萌发出绿芽，经分割、转接并能够使绿芽连续生长繁殖，完成 无菌繁殖体的建立；培养条件为：室温2(T30°C，每日光照8小时，光照强度180(T2000LX， 培养31天。
[0033] 3、增殖培养： (1)增殖培养基的制备：MS2培养基为增殖培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加 500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的 营养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营 养元素成分及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤0.05mg/L、萘乙酸0.3mg/L、活性炭l.Og/ L、NH4N03 9 90mg/L、KN03 1140mg/L、CaCl22H20 240mg/L、MgS047H20 222mg/L、KH2P04 102mg/ L、KI 0· 5mg/L、H3B03 3. 7mg/L、MnS044H20 13. 38mg/L、ZnS047H20 5. 2mg/L、NaMo022H20 0.15mg/L、CuS045H 20 0.015mg/L、CoCl26H20 0.015mg/L、Na2EDTA 22.38mg/L、FeS047H20 16.68mg/L、肌醇60mg/L、烟酸0.3mg/L、盐酸批卩多醇0.3mg/L、烟酸硫胺素0.06mg/L、甘氨 酸 1. 2mg/L、鹿糖 30000mg/L ; (2)将获得的无菌繁殖体接种于配制好的MS2的增殖培养基中，放置在人为控制室温 为31°C，每日光照12小时，光照强度1200LX的条件下培养31天，从叶腋萌发出无菌绿芽， 剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增殖倍数5倍，在无菌条 件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖。
[0034] 4、生根培养： (1) 生根培养基的制备：MS3培养基为诱导生根培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/ L加500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配 方中的营养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述配 方中的营养元素成分及其质量配比如下：2. Omg/L、活性炭1. Og/L、NH4N03 6 00mg/L、ΚΝ03 800mg/L、CaCl22H20 150mg/L、MgS047H20 222mg/L、Ca(N03)2 300mg/L、KH2P04 102mg/L、KI 0.5mg/L、H3B03 3.7mg/L、MnS044H20 13.38mg/L、ZnS047H20 5.2mg/L、NaMo022H20 0.15mg/L、 CuS045H20 0.015mg/L、CoCl26H20 0.015mg/L、Na2EDTA 22.38mg/L、FeS047H20 16.68mg/L、肌 醇80mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸批卩多醇lmg/L、烟酸硫胺素0.25mg/L、甘氨酸2.0mg/L、鹿 糖 28000mg/L ; (2) 增殖培养过程中，丛生芽高25毫米以上时，将丛生芽从基部切下，分割成单株接种 于MS3生根培养基中，放置在室温2(T30°C左右，每日光照11小时，光照强度在1400LX的 条件下培养25天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中炼苗7天，生根瓶苗叶片展 开，茎芽生长健壮，形成完整植株。
[0035] 5、移植： (1) 驯化：将培养得到的根系生长良好的瓶苗移入温室驯化，使瓶苗从人为控制培养条 件并给予营养元素到适应自然环境条件，并自我吸取养份； (2) 移植：用泥炭土、黄心土和珍珠岩按2:3:1的比例充分混合制得营养基质，填满到 育苗杯中，将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在幼苗上的培养基，将幼苗移植到填满营养基质 的育苗杯，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质， 使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水。
[0036] 6、幼苗培育：移植后的幼苗在一个月内要加强水肥管理及病防虫防治，并适当遮 荫，保证幼苗成活，当幼苗生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光 照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，可移上大一号花盆培育大苗。
[0037] 水肥管理的方法：保持基质湿润，空气相对湿度在95%以上，防止植株失水，培养 温度25~28°C，荫棚用75%的遮光网遮光；移植15天之后逐步控制基质水分，相对湿度控制 在6(Γ65%，促进新根新芽发生。
[0038] 病虫防治方法：幼苗移植后第三天采用0. 1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔15天 喷雾一次；当有新芽萌发，新根长出时，喷施1200倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔半个 月喷施一次；所喷施的营养液是由以下配比的药品配制得到：NH 4N03 9 00mg/L、KN03 8 00mg/ L、CaCl22H20 150mg/L、MgS047H20 280mg/L、Ca(N03)2 300mg/L、KH2P04 220mg/L、KI l.Omg/ L、H3B03 8mg/L、MnS044H20 20mg/L、ZnS047H20 6. 5mg/L、NaMo022H20 0· lmg/L、CuS045H20 0· Olmg/L、CoC126H20 0· Olmg/L。
[0039] 实施例3采用以下步骤实现本发明。
[0040] 1、采集外植体及材料处理：在广东省佛山市三水区爱嘉农场里，采集生长健壮，无 病虫害的5年生黄果银桦树冠顶端的半木质化的枝条，剪去枝条上的叶片，保留叶柄，装入 密封袋里带回试验室；先将枝条用洗洁精溶液泡洗20分钟，泡洗过程中不断摇动瓶子，用 流水冲洗干净，再用浓度为95%的酒精浸泡10秒钟，然后用流水冲洗3次，洗净后切成2~3 厘米的带1~2个腋芽的茎段。
[0041] 2、建立无菌繁殖体： (1) 初代培养基的制备：MSI培养基为初代培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加 500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的 营养元素成分，加水至1000ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营 养元素成分及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤5.0mg/L、萘乙酸0. 5mg/L、NH4N03 1250mg/ L、KN03 1 450mg/L、CaCl22H20 320mg/L、MgS047H20 290mg/L、KH2P04 1 40mg/L、ΚΙ 0· 65mg/ L、H3B03 4. 82mg/L、MnS044H20 18. 55mg/L、ZnS047H20 6. 52mg/L、NaMo022H20 0· 2mg/L、 CuS045H20 0· 02mg/L、C〇C126H20 0· 02mg/L、Na2EDTA 28. 5mg/L、FeS047H20 21. 5mg/L、肌醇 80mg/L、烟酸0.4mg/L、盐酸批卩多醇0.4mg/L、烟酸硫胺素0.08mg/L、甘氨酸1.6mg/L、鹿糖 30000mg/L ； (2) 将洗净后的茎段在无菌实验室里用75%酒精灭菌2分钟，再用0. 1%氯化汞溶液灭 菌15分钟，然后用无菌水清洗3~4次，一瓶一个茎段接种于MSI培养基上，在培养室内进行 培养，诱导腋芽萌发，当从叶腋萌发出绿芽，经分割、转接并能够使绿芽连续生长繁殖，完成 无菌繁殖体的建立；培养条件为：室温2(T30°C，每日光照12小时，光照强度800LX，培养32 天。
[0042] 3、增殖培养： (1) 增殖培养基的制备：MS2培养基为增殖培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加 500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营 养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5.8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养 元素成分及其质量配比如下：6?苄基腺嘌呤0.2mg/L、萘乙酸0. lmg/L、活性炭3.0 g/L、 NH4N〇3 1250mg/L、KN〇3 1450mg/L、CaCl22H20 320mg/L、MgS047H20 290mg/L、KH2P04 1 40mg/ L、KI 0· 65mg/L、H3B03 4. 82mg/L、MnS044H20 18. 55mg/L、ZnS047H20 6. 52mg/L、NaMo022H20 0. 2mg/L、CuS045H20 0.02mg/L、CoCl26H20 0.02mg/L、Na2EDTA 28.5mg/L、FeS047H20 21.5mg/ L、肌醇80mg/L、烟酸0.4mg/L、盐酸批卩多醇0.4mg/L、烟酸硫胺素0.08mg/L、甘氨酸 1. 6mg/L、鹿糖 30000mg/L ; (2) 将获得的无菌繁殖体接种于配制好的MS2的增殖培养基中，放置在人为控制室温 为32°C，每日光照8小时，光照强度2000LX的条件下培养30天，从叶腋萌发出无菌绿芽，剪 取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增殖倍数5. 5倍，在无菌条 件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖。
[0043] 4、生根培养： (1) 生根培养基的制备：MS3培养基为诱导生根培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L 加500ml蒸馏水，加热至卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中 的营养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的 营养元素成分及其质量配比如下：4.0mg/L、活性炭3.0g/L、NH4N0 3 200mg/L、KN03 250mg/ L、CaCl22H20 100mg/L、MgS047H20 320mg/L、Ca(N03)2 200mg/L、KH2P04 1 40mg/L、KI 0.65mg/ L、H3B03 4. 82mg/L、MnS044H20 18. 85mg/L、ZnS047H20 6. 52mg/L、NaMo022H20 0· 2mg/L、 CuS045H20 0· 02mg/L、C〇C126H20 0· 02mg/L、Na2EDTA 28. 5mg/L、FeS047H20 21. 5mg/L、肌醇 50mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸批卩多醇0.5mg/L、烟酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸l.Omg/L、鹿 糖 15000mg/L; (2) 增殖培养过程中，丛生芽高20毫米以上时，将丛生芽从基部切下，分割成单株接种 于MS3生根培养基中，放置在室温2(T30°C左右，每日光照9小时，光照强度在1700LX的条 件下培养20天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中炼苗14天，生根瓶苗叶片展 开，茎芽生长健壮，形成完整植株。
[0044] 5、移植： (1) 驯化：将培养得到的根系生长良好的瓶苗移入温室驯化，使瓶苗从人为控制培养条 件并给予营养元素到适应自然环境条件，并自我吸取养份； (2) 移植：用泥炭土、黄心土和珍珠岩按2:3:1的比例充分混合制得营养基质，填满到 育苗杯中，将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在幼苗上的培养基，将幼苗移植到填满营养基质 的育苗杯，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质， 使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水。
[0045] 6、幼苗培育：移植后的幼苗在一个月内要加强水肥管理及病防虫防治，并适当遮 荫，保证幼苗成活，当幼苗生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光 照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，可移上大一号花盆培育大苗。
[0046] 水肥管理的方法：保持基质湿润，空气相对湿度在95%以上，防止植株失水，培养 温度25~28°C，荫棚用75%的遮光网遮光；移植15天之后逐步控制基质水分，相对湿度控制 在65?75%，促进新根新芽发生。
[0047] 病虫防治方法：幼苗移植后第三天采用0. 1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔10 天喷雾一次；当有新芽萌发，新根长出时，喷施1800倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔 半个月喷施一次；所喷施的营养液是由以下配比的药品配制得到：NH 4N03 700mg/L、ΚΝ03 1000mg/L、CaCl22H20 250mg/L、MgS047H20 400mg/L、Ca(N03)2 500mg/L、KH2P04 120mg/L、 KI 0· 6mg/L、H3B03 5mg/L、MnS044H20 25mg/L、ZnS047H20 10mg/L、NaMo022H20 0· 5mg/L、 CuS045H20 0. 05mg/L, CoC126H20 0. 05mg/L〇
【权利要求】
1. 一种黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 采集外植体及其材料处理：采集生长健壮，无病虫害的5年生黄果银桦树冠顶端的 半木质化的枝条，剪去枝条上的叶片，保留叶柄，装入密封袋里带回试验室；所述材料处理 是先将枝条用洗洁精溶液泡洗15~20分钟，泡洗过程中不断摇动瓶子，用流水冲洗干净，再 用浓度为95%的酒精浸泡10秒钟，然后用流水冲洗3次，洗净后切成2~3厘米的带1~2个 腋芽的茎段； (2) 建立无菌繁殖体：将步骤（1)获得的茎段在无菌实验室里用75%酒精灭菌广2分 钟，再用0. 1%氯化汞溶液灭菌ΚΓ15分钟，然后用无菌水清洗3~4次，一瓶一个茎段接种于 MSI培养基上，在培养室内进行培养，诱导腋芽萌发；所述培养条件为：室温2(T30°C，每日 光照8~12小时，光照强度80(T2000LX，培养3(Γ32天；当从叶腋萌发出绿芽，经分割、转接 并能够使绿芽连续生长繁殖，完成无菌繁殖体的建立； (3) 增殖培养：将步骤（2)获得的无菌繁殖体接种于MS2的增殖培养基中，放置在人为 控制室温为3(T32°C，每日光照8?12小时，光照强度80(T2000LX的条件下培养3(Γ32天，从 叶腋萌发出无菌绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增 殖倍数5飞倍，在无菌条件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖； (4) 生根培养：当步骤（3)的增殖培养过程中，丛生芽高20毫米以上时，将丛生芽从基 部切下，分割成单株接种于MS3生根培养基中，放置在室温2(T30°C左右，每日光照8~12小 时，光照强度在80(T2000LX的条件下培养2(Γ25天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下 温室中炼苗疒14天，生根瓶苗叶片展开，茎芽生长健壮，形成完整植株； (5) 移植：将培养得到的根系生长良好的瓶苗移入温室驯化，瓶苗从人为控制培养条件 并给予营养元素到适应自然环境条件，并自我吸取养份的驯化过程后，将其移植到装有育 苗营养基质的育苗杯中；移植方法是：将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在幼苗上的培养基， 将幼苗移植到填满营养基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系， 一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水； (6) 幼苗培育：移植后的幼苗在一个月内要加强水肥管理及病防虫防治，并适当遮荫， 保证幼苗成活，当幼苗生长稳定，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照 常规管理，幼苗培育至15厘米高时，可移上大一号花盆培育大苗。
2. 根据权利要求1所述的黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：所述MSI 培养基为初代培养基，其制备是将卡拉胶7〇〇〇mg/L加500ml蒸馈水，加热至卡拉胶完全 溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅 拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述培养基配方中的营养元素成分及其质量配比 如下：6?苄基腺嘌呤 0· 05?5. Omg/L、萘乙酸 0· 01?0· 5mg/L、NH4N03 99(Tl650mg/L、ΚΝ03 1140?1900mg/L、CaCl22H20 240?400mg/L、MgS047H20 74?370mg/L、KH2P04 102?170mg/L、KI 0· 5?0· 83mg/L、H3B03 3. 72?6. 2mg/L、MnS044H20 13. 38?22. 3mg/L、ZnS047H20 5. 16?8. 6mg/ L、NaMo022H20 0· 15?0· 25mg/L、CuS045H20 0· 015?0· 025mg/L、C〇C126H20 0· 015?0· 025mg/ L、Na2EDTA 22. 38?37. 3mg/L、FeS047H20 16. 68?27. 8mg/L、肌醇 6(Tl00mg/L、烟酸 0· 3?0· 5mg/L、盐酸批咳醇0· 3?0· 5mg/L、烟酸硫胺素0· 06?0· lmg/L、甘氨酸1. 2?2. Omg/L、 鹿糖 30000mg/L。
3. 根据权利要求1所述的黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：所述MS2 培养基为增殖培养基，其制备是将卡拉胶7〇〇〇mg/L加500ml蒸馈水，加热至卡拉胶完全 溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分，加水至l〇〇〇ml，搅 拌均匀，pH调至5. 8,装瓶、灭菌，备用；所述培养基配方中的营养元素成分及其质量配 比如下：6?苄基腺嘌呤0· 05?2mg/L、萘乙酸（λ 1?3mg/L、活性炭L (Γ3. Og/L、ΝΗ4Ν03 990?1650mg/L、KN03 114(Tl900mg/L、CaCl22H20 24(T400mg/L、MgS047H20 222?370mg/L、 KH2P04 102?170mg/L、KI 0· 5?0· 83mg/L、H3B03 3. 72?6. 2mg/L、MnS044H20 13. 38?22. 3mg/ L、ZnS047H20 5.16?8.6mg/L、NaM〇022H20 0.15?0.25mg/L、CuS045H20 0.015?0.025mg/L、 C〇C126H20 0· 015?0· 025mg/L、Na2EDTA 22. 38?37. 3mg/L、FeS047H20 16. 68?27. 8mg/L、肌醇 6(Tl00mg/L、烟酸0.3?0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.3?0.5mg/L、烟酸硫胺素0.06?0.1mg/L、甘 氨酸 1. 2?2. Omg/L、鹿糖 30000mg/L。
4. 根据权利要求1所述的黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：所述 MS3培养基为诱导生根培养基，其制备是将卡拉胶7000mg/L加500ml蒸馏水，加热至 卡拉胶完全溶解，然后加入已经预先溶解于水中的培养基配方中的营养元素成分，加水 至1000ml，搅拌均匀，pH调至5.8,装瓶、灭菌，备用；所述配方中的营养元素成分及其 质量配比如下：萘乙酸 (Γ4. Omg/L、活性炭 L (Γ3. Og/L、NH4N03 20(T800mg/L、KN03 250?900mg/L、CaCl22H20 50?200mg/L、MgS047H20 222?370mg/L、Ca(N03)2 200?400mg/L、 KH2P04 102?170mg/L、KI 0· 5?0· 83mg/L、H3B03 3. 72?6. 2mg/L、MnS044H20 13. 38?22. 3mg/ L、ZnS047H20 5.16?8.6mg/L、NaM〇022H20 0.15?0.25mg/L、CuS045H20 0.015?0.025mg/L、 C〇C126H20 0· 015?0· 025mg/L、Na2EDTA 22. 38?37. 3mg/L、FeS047H20 16. 68?27. 8mg/L、肌醇 5(Tl00mg/L、烟酸 0.25?0.5mg/L、盐酸吡哆醇 0.5?l.Omg/L、烟酸硫胺素 0.1 ?0.25mg/L、 甘氨酸 l.〇?2.0mg/L、蔗糖 1500(T30000mg/L。
5. 根据权利要求1所述黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：步骤（5)所述 的育苗营养基质是泥炭土、黄心土和珍珠岩按2:3:1的比例充分混合得到。
6. 根据权利要求1所述黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：步骤（6)所 述幼苗在移植后的水肥管理方法是：保持基质湿润，空气相对湿度在95%以上，防止植株失 水，培养温度25~28°C，荫棚用75%的遮光网遮光；移植15天后逐步控制基质水分，相对湿 度控制在6(Γ80%，促进新根新芽发生。
7. 根据权利要求1所述黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：步骤（6)所述 幼苗在移植后的病防虫防治方法是：幼苗移植后第三天采用〇. 1%百菌清喷雾消毒灭菌，之 后每隔1(Γ15天喷雾一次；当有新芽萌发，新根长出时，喷施120(Γ1800倍营养液，根据幼苗 生长状况，每隔半个月喷施一次。
8. 根据权利要求7所述黄果银桦的离体培养再生植株方法，其特征在于：所述营养液 是由以下质量配比的药品配制而成：ΝΗ4Ν0 3 70(T900mg/L、KN03 80(Tl000mg/L、CaCl22H20 150?250mg/L、MgS0 47H20 280?400mg/L、Ca(N03)2 300?500mg/L、KH2P04 120?220mg/L、KI 0· 6?1. 0mg/L、H3B03 5?8mg/L、MnS044H20 20?25mg/L、ZnS047H20 6. 5?10mg/L、NaMo022H20 0· 1 ?0· 5mg/L、CuS045H20 0· 01 ?0· 05mg/L、C〇C126H20 0· 01 ?0· 05mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK104145821SQ201410420044
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】韩宙 申请人:深圳市公园管理中心