一种羊肚菌杂交菌的菌核培养方法及其在菌种制备的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种羊肚菌杂交菌的菌核培养方法及其在菌种制备的应用，该方法使用四角法将不同菌株来源的菌丝块交叉接种于平板培养基的四角位置，待菌丝杂交形成融合菌丝时，将融合菌丝转接于微碱性培养基，并于低温黑暗条件下培养可获得大量羊肚菌菌核，该菌核可用于保存或者羊肚菌的母种、栽培种制作。使用四块菌丝块相互杂交融合的四角接种法保障了异核菌丝的高效生产，使用该菌丝并结合低温、微碱性的培养条件又保障了羊肚菌菌核的高产与稳产。
【专利说明】—种羊肚菌杂交菌的菌核培养方法及其在菌种制备的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种羊肚菌菌种制作和菌核培养技术，特别涉及一种优化的菌丝杂交融合操作技术、菌核的高效培养方法及其在菌种制备的应用。
【背景技术】
[0002]羊肚菌Morchella esculenta (L.) Pers 隶属于羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella)，是国际著名的珍贵食用菌，世界畅销，是中国主要出口到法国等欧洲国家的食用菌产品。并且随着德、法、意、美等国家对羊肚菌的需求量增大，其价格不断攀升。
[0003]羊肚菌最早记载于《本草纲目》，在我国利用的历史悠久。现代科学发现羊肚菌中富含蛋白质、脂肪酸和碳水化合物，特别是多种稀有氨基酸(如顺-3-氨基-L-脯氨酸、2-氨基异丁酸、2，4-三氨基异丁酸等)、矿质元素(钾、磷、镁、钙、铁、锌、铜、锰等)和多种维生素(硫胺素、核黄素、尼古酸、泛酸、叶酸、吡哆醇、生物素、抗坏血酸、VB12)等成分赋予了羊肚菌独特的风味和营养价值，成为国际餐饮中的高档食材。并且，羊肚菌食药同源，现代医学研究表明，羊肚菌能够补肾、补脑、壮阳、提神、降血脂、抗肿瘤等作用。另外，羊肚菌可用于泡酒原料，其液体发酵培养物又可用于调味品的生产等，故其在食品、保健品、医药化工等多领域有着广阔的应用前景。
[0004]目前，中国出口的羊肚菌大多采于自然野生，其远远不能满足国内与国际市场的需求，并且野生资源的过度采集造成其产量急剧减少，极大破坏了羊肚菌的生物多样性。因此，羊肚菌的人工或半人工栽培技术一直是国际食用菌研究的热点，栽培试验偶有成功，但其重复性差，出菇不稳定，至今不能进行成熟的商业化栽培。
[0005]多年的科学研究表明，在羊肚菌的生活史中，菌核的形成是生长子实体(即出菇)的必经阶段，而使用杂交菌丝培养出的菌核进行大田中栽培实验最易生长出子实体。实践生产中发现，人工培育羊肚菌菌种时缺乏规范统一且科学高效的菌种杂交方法，并且在菌种制作过程中培养条件的不适宜性经常导致菌种不形成菌核或者菌核消失，造成羊肚菌减产甚至绝收，这是目前羊肚菌(半)人工栽培试验不稳定的两个重要原因。
[0006]提供一种优化、高效的羊肚菌杂交菌的菌核多产、稳产培养方法以及杂交菌种制作技术，是本发明力图解决的问题。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的就是针对羊肚菌制种过程中的杂交效率不高、栽培试验中菌核形成不稳定的不足，提供一种羊肚菌杂交菌的菌核培养方法，该方法操作简便、集约、快捷，菌丝杂交效率高，保障了羊肚菌融合菌丝的获得；进一步根据羊肚菌的生长发育习性，设计了低温、微碱性的培养环境，能够大量培养出羊肚菌菌核，一定程度上保障了羊肚菌大田栽培的成功出菇。
[0008]本发明的技术目的是通过如下方案来实现的: 一种羊肚菌杂交菌的菌核培养方法，包括以下步骤:
将不同羊肚菌菌株来源的菌丝块交叉接种于平板培养基的周边，待菌丝杂交形成融合菌丝时，将融合菌丝转接于微碱性培养基，并于低温黑暗条件下培养，得到羊肚菌杂交菌的菌核。
[0009]优选的，本发明中，微碱性培养基的pH值为7.5-8.5,低温暗黑条件下培养的培养温度为10_15°C。培养基pH过高或过低都会降低菌丝生长速度以及减少菌核的形成数量。温度过低影响菌丝生长速度，温度过高不利于形成菌核。
[0010]采用培养基PH7.5-8.5，培养温度10_15°C的环境，有利于羊肚菌形成更多稳定的菌核体，减少了以往羊肚菌培养过程中的菌核不形成或者菌核消失退化现象，进而降低了农业损失。
[0011]所述菌丝块可以通过如下方法获得，(I)使用羊肚菌成熟的野生或栽培菌菇的孢子或组织块于培养基上20-25 V条件下进行萌发和菌丝纯化；此处培养基为PDA培养基，配方为:马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁I克，VBi 50微克，水1000毫升，pH自然；其制作方法为:将马铃薯去皮，称重，切成小块，放入烧杯内，800毫升水加热煮沸30分钟左右，煮至马铃薯块熟而不烂。然后用双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂，再加热煮沸使琼脂溶解，边煮沸边搅拌，防止液体溢出。待琼脂完全溶化后，加入葡萄糖，加热搅拌让葡萄糖完全溶解。最后补足水分，使其达到1000毫升。趁热分装入试管和三角瓶中，防止凝固。试管加绵塞，三角瓶加封口膜。分装好的培养基，及时于高压锅内灭菌，放气三次以排除锅内冷空气，0.147兆帕左右灭菌30-40分钟，停止加热，待锅内压力指针归零时且温度达90 V以下后，打开锅盖取出培养基。试管斜放冷却制作斜面培养基。三角瓶内培养基于无菌工作台内制作平板培养基。
[0012]孢子的萌发与菌丝纯化步骤为:于无菌工作台内将孢子的双蒸水悬液用接种环蘸取后于平板培养基上划线接种；然后于20-25 V黑暗培养，待菌丝长到2-5 cm左右时，切取尖端菌丝并转接在另一培养基上培养，连续转接至少两次后，获得纯化的羊肚菌菌丝块。
[0013]菌菇组织块的萌发与菌丝纯化步骤为:于无菌工作台内将去掉菌柄基部的刚成熟的羊肚菌子实体，在酒精火焰上方横切开，于子实体内腔表面削取黄豆大小的组织，放在平板培养基上于20-25 V黑暗培养，待菌丝长到2-5 cm左右时，切取尖端菌丝并转接在另一培养基上培养，连续转接至少两次后，获得纯化的羊肚菌菌丝块。
[0014]优选的，所述羊肚菌菌株为两种，尤其可以为野生种菌株和栽培种菌株，每种菌株的菌丝块各自为两块，接种方式是将两类菌丝块，交叉接种于同一平板培养基的四角位置，并置于20-25°C的黑暗条件下培养，待菌丝块萌生的次生菌丝于平板中间位置重叠、融合后，切取融合菌丝块转接于微碱性斜面培养基上进行菌核培养或保存。
[0015]优选的，培养羊肚菌杂交菌菌核时，所用菌丝块为四块。当所用菌丝块低于四块时，杂交融合效率低；高于四块时，杂交融合效率没有明显提升，且操作繁琐，容易染菌。
[0016]本发明的另外一个目的是提供羊肚菌杂交菌的菌核在制备羊肚菌母种和栽培种上的应用，其方法参照现有技术即可。
[0017]本发明的有益效果:
本发明的方法操作简便、集约、快捷，有效保障了羊肚菌融合菌丝的获得；进一步根据羊肚菌的生长发育习性，设计了低温、微碱性的培养环境，能够大量培养出羊肚菌菌核，一定程度上保障了羊肚菌大田栽培的成功出菇。
[0018]说明书附图
图1:制作融合菌丝的平板培养基四角接种法示意图，图中，I表示平板培养基；2与3表示来源于不同菌株的羊肚菌菌丝块。
【具体实施方式】
[0019]实施例一:
1、在无菌操作台内，将采于四川省绵阳市北川县的羊肚菌的野生菌菇成熟干燥孢子接种于平板培养基上(90mm直径培养皿，PDA培养基，pH值自然；下同)，于25 V黑暗培养。
[0020]2、羊肚菌孢子暗培养2天后切取2 cm左右的菌丝尖端，转接在另一培养基上培养，连续3次转接获得纯化的羊肚菌菌种。贴标签后于4 V保存。
[0021]3、于新的平板培养基上，围绕中心点星状均匀地分别接种1-8块菌丝块(相邻菌丝块为来源不同的菌株)，于25 V黑暗培养。每个菌丝块数目做20个重复的平板培养。
[0022]4、待菌丝长满平板且培养基全部呈现褐色时，于平板中心、菌丝块组成的圆环环1/2半径内随机挑取50个菌丝，于显微镜下观察记录融合菌丝的数量，并计算其占菌丝数量的比例，以20个重复实验的平均值作记录结果。
[0023]5、统计结果(见表I)显示:同一块培养基平板上接种1-3块菌丝块时，获得羊肚菌融合菌丝的比例小于33%。接种多余4-8块菌丝块时的菌丝融合效率为63.09%?66.00%,没有显著差异性，但其都明显优于I?3块菌种块的融合效果；相比于5块以上的接种块，在平板培养基四角分别接种羊肚菌的“四角接种法在获得高表达量融合菌丝的同时，能够节约菌种用量、减少染菌风险，更值得实践中推广应用。
表I杂交接种菌丝块数目对菌丝融合效率的影响
菌丝块数目(块)融合菌丝比例(%)
17.55
216.41
332.83
[0024]--
463.09
565.21
665.22
766.04
866.00
实施例二:
1、于无菌操作台内，将同源的融合菌丝块分别接种于PH4.0?11.0的PDA斜面培养基上(18mmX20cm试管,含约1ml培养基；下同)，菌丝块大小相近，相同pH值的培养基接种20管。
[0025]2、将斜面培养基置于25 V黑暗条件下，观察记录羊肚菌的菌核形成数量，并于显微镜下测定菌核的直径。
[0026]3、统计结果显示(见表2):PDA培养基的pH值对羊肚菌菌核的形成数量和直径大小具有明显的影响作用。PH4.0的酸性条件中几乎不能生长羊肚菌，而pH大于10.0的培养基也不利于羊肚菌的生长。相较于其他酸碱性值，PH7.5~8.5的PDA培养基上能够在接种第二周和第三周生长出更多的羊肚菌菌核，在大田实践栽培中将更利于出菇。
[0027]表2培养基pH值对羊肚菌菌核形成的影响
【权利要求】
1.一种羊肚菌杂交菌的菌核培养方法，其特征在于:包括以下步骤:将不同羊肚菌菌株来源的菌丝块交叉接种于平板培养基的周边，待菌丝杂交形成融合菌丝时，将融合菌丝转接于微碱性培养基，并于低温黑暗条件下培养，得到羊肚菌杂交菌的菌核。
2.根据权利要求1所述的羊肚菌杂交菌的菌核培养方法，其特征在于:所述羊肚菌菌株为两种，每种菌株的菌丝块各自为两块，接种方式是将两类菌丝块交叉接种于同一平板培养基的四角位置，并置于20-25°C的黑暗条件下培养，待菌丝块萌生的次生菌丝于平板中间位置重叠、融合后，切取融合菌丝块转接于的微碱性斜面培养基上进行菌核培养或保存。
3.根据权利要求2所述的羊肚菌杂交菌的菌核培养方法，其特征在于:所述微碱性斜面培养基的pH值为7.5-8.5。
4.根据权利要求1所述的羊肚菌杂交菌的菌核培养方法，其特征在于:所述低温黑暗条件的温度为10-15°C。
5.一种羊肚菌杂交菌的菌核在制备羊肚菌母种和栽培种上的应用。
【文档编号】A01G1/04GK104170653SQ201410432139
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】秦小波, 高继海, 彭天祥, 时小东, 张国珍 申请人:四川省自然资源科学研究院, 高继海