一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法，包括：1)材料准备：母本选用较早熟的饭豆材料，父本选用综合性状优良的小豆品种，精选无病饱满的籽粒以备种植；2)材料种植；3)杂交授粉；4)幼胚拯救；以及5)杂种幼苗移栽。本发明通过选用较早熟的饭豆材料作为母本，选用综合性状优良的小豆品种作为父本，获得的杂种幼胚可以直接长成幼苗，幼苗生长发育良好，移栽成活率高，远缘杂交F1植株成株期可以正常开花结实，并且能够收获F2种子。本发明方法能使大量远缘杂交胚继续发育成正常种子，有效避免远缘杂种胚败育，同时获得大量的远缘杂交后代，最终实现小豆和饭豆的种间远缘杂交。
【专利说明】一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小豆和饭豆远缘杂交的方法，特别涉及一种利用幼胚拯救实现小 豆和饭豆远缘杂交的方法，本发明属于生物技术育种领域。
【背景技术】
[0002] 小豆[Vigna angularis(Willd. )0hwi&0hashi]原产于中国，除个别高寒地区，在 我国各地均有种植，主产区在华北、东北和江淮地区。我国是世界上最大的小豆生产国，总 产量和出口量均居世界第1位。豆象是小豆生产过程中的一种仓储性害虫，受豆象危害后 的小豆重量降低、营养丧失、质量严重下降。生产上防治豆象危害的方法主要为磷化铝熏蒸 法，这不仅增加了小豆生产的成本，而且容易导致农药残留，造成环境污染，影响食用者身 体健康。防治豆象危害最为经济且环保的方法是培育抗豆象品种，利用作物本身的抗性防 止豆象危害。但迄今为止，在现有的小豆种质资源中没有发现抗豆象种质材料，大部分小豆 种质资源表现为完全感豆象。
[0003] 栽培饭豆[Vigna umbellata(Thunb. )Ohwi&Ohashi]与小豆同属于紅豆属 (Vigna)亚洲紅豆亚属（Ceratotropis),它们的亲缘关系较近。研究表明大部分饭豆种质 具有抗豆象的特性。因此，利用远缘杂交将饭豆的抗豆象基因导入小豆中是小豆抗豆象育 种的有效途径。小豆与饭豆杂交后，幼荚一般能够正常发育，但生长10-20天即开始干枯掉 落，不能获得有活力的杂交籽粒。剥开掉落的杂交荚可见发生败育的幼胚。因此在幼胚败 育前采取幼胚拯救的途径有可能获得杂交后代植株，实现小豆和饭豆的远缘杂交。然而，小 豆在我国作为一种小作物，其育种和遗传研究相对落后，目前的主要育种方法仍以自然变 异选择和种内杂交选育等方法为主，远缘杂交育种方面的研究报道十分缺乏。国内未见小 豆和饭豆远缘杂交方面的研究报道。
【发明内容】
[0004] 针对以上问题，本发明提供了一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方 法。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 本发明的一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法，其特征在于包括以 下步骤：
[0007] 1)材料准备：母本选用较早熟的饭豆材料，父本选用综合性状优良的小豆品种， 精选无病饱满的籽粒以备种植；
[0008] 2)材料种植：小豆亲本分批错期播种，以保证两亲本花期相遇并有足够的花蕾进 行杂交；
[0009] 3)杂交授粉：当父母本均开花时，于每天下午4-6时进行去雄，第二天7-9时进行 授粉；
[0010] 4)幼胚拯救：取授粉后10-15天的杂交荚，用蒸馏水将杂交荚表面清洗干净，用 尖头镊子将其剥开，取幼嫩籽粒；将幼嫩的杂交籽粒用70%酒精灭菌1分钟，0. 1%升汞灭 菌15分钟，灭菌蒸馏水冲洗3-5次；在解剖镜下剥取幼胚，将幼胚接种于装有灭菌培养基 的组培瓶中，其中培养基为添加10 μ M6-苄基腺嘌呤的MS基本培养基，以上整个操作过 程在超净工作台中完成；接种好的幼胚转移到光照培养箱中，培养条件为温度25°C，湿度 55-65%，12小时光照，12小时暗环境，直至杂种幼苗长出；
[0011] 5)杂种幼苗移栽。
[0012] 在本发明中，饭豆生长期较长，为便于能够与小豆的花期相遇，优选的，所述的母 本为播种至开花期为50-60天的饭豆材料，更优选为河北保定的较早熟的饭豆亲本材料 F021，所述的父本为综合性状较好的吉林省小豆品种白红2号。
[0013] 其中，所述的河北保定的较早熟的饭豆亲本材料H)21由河北省农林科学院粮油 作物研究所保存，提供。
[0014] 在本发明中，优选的，小豆亲本材料白红2号分两批错期播种，第一批与饭豆材料 同期播种，第二批错后3-15天播种（具体错期播种天数视亲本材料而定），以保证两亲本花 期相遇并有足够的花蕾进行杂交。
[0015] 在本发明中，优选的，所述的杂交授粉的具体操作方法为选取第二天即将开放的 花蕾，用酒精消毒过的尖头镊子剥开龙骨瓣，将10个花药全部去除，仅留柱头；去雄后将整 个植株罩上防虫网，以防昆虫传粉，授粉时选取当天刚开放的花朵，用尖头镊子将整个包含 柱头、花药和花丝的龙骨瓣取下，从龙骨瓣细的开口一端将其套在母本的柱头上。
[0016] 在本发明中，优选的，所述的杂种幼苗移栽包括待幼苗长至8-12厘米高且生根良 好时，打开培养瓶口，炼苗48小时；炼苗结束后小心地用镊子将幼苗从组培瓶中取出，洗净 根上残留的培养基，将其移栽到花盆中，将整个花盆用透光性好的聚乙烯袋罩上，以保持高 湿环境，促进幼苗成活。
[0017] 相较于现有技术本发明的有益效果为：
[0018] 1、通过利用本发明所述的杂交授粉方法，可以有效的保证杂交成荚率，为后续幼 胚拯救提供材料保障。
[0019] 2、通过选用较早熟的饭豆材料作为母本，选用综合性状优良的小豆品种作为父 本，在本发明所述的幼胚拯救条件下，杂种幼胚可以直接长成幼苗。该方法可以有效避免远 缘杂种胚败育，同时获得大量的远缘杂交后代，实现小豆和饭豆的种间远缘杂交。
[0020] 3、获得的幼苗生长发育良好，移栽成活率
[0021] 4、远缘杂交F1植株成株期可以正常开花结实，并且能够收获F2种子。
[0022] 5、小豆初生叶为心形，较短圆，饭豆初生叶为披针形，较狭长，杂种植株的初生叶 形介于两者之间，从幼苗初生叶形可以直观判断是否为真杂种。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为利用幼胚拯救获得的小豆与饭豆远缘杂交幼苗照片；
[0024] 图2为小豆与饭豆远缘杂交植株成株期照片。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0026] 实施例1小豆和饭豆远缘杂交幼苗的获得
[0027] 一、试验材料
[0028] 选择收集自河北保定的较早熟的饭豆亲本材料R)21和综合性状较好的吉林省小 豆品种白红2号作为杂交亲本。
[0029] 其中，所述的河北保定的较早熟的饭豆亲本材料R)21由河北省农林科学院粮油 作物研究所保存，提供。
[0030] 白红2号为吉林省育成小豆品种，可从吉林白城市农科院申请或购买。
[0031] 二、试验方法
[0032] 材料种植：将亲本材料播种于花盆中，其中母本材料饭豆H)21种植5盆，每盆留苗 3株。父本材料白红2号分两批播种，第一批与饭豆同期播种，第二批错后7天播种，每批各 5盆，每盆留苗3株，以保证花期相遇并有足够的花蕾进行杂交。
[0033] 杂交授粉：当父母本均开花时，利用小豆和饭豆亲本进行正反杂交。具体操作方法 为于每天下午4-6时选取母本第二天即将开放的花蕾，用酒精消毒过的尖头镊子剥开龙骨 瓣，将10个花药全部去除，仅留柱头。去雄后将整个植株罩上防虫网，以防昆虫传粉。第二 天7-9时，选取父本当天刚开放的花朵，用尖头镊子将整个龙骨瓣（包含柱头、花药和花丝） 取下，从龙骨瓣细的开口一端将其套在母本的柱头上。
[0034] 幼胚拯救：各取正反杂交授粉后10-15天的杂交荚，用蒸馏水将杂交荚表面清洗 干净，用尖头镊子将其剥开，取幼嫩籽粒。在超净工作台中，将幼嫩的杂交籽粒用70v/ v%酒 精灭菌1分钟，〇. lv/v%升汞灭菌15分钟，灭菌蒸馏水冲洗4次；在解剖镜下剥取幼胚，将 幼胚接种于装有灭菌培养基的组培瓶中。培养基为MS基本培养基+10 μ M6-苄基腺嘌呤。 接种好的幼胚转移到光照培养箱中，培养条件为温度25°C，湿度60%左右，12小时光照，12 小时暗环境，直至杂种幼苗长出。
[0035] 杂种幼苗移栽：待幼苗长至8-12厘米高且生根良好时，将培养瓶口渐进打开，炼 苗48小时。小心地用镊子将幼苗从组培瓶中取出，洗净根上残留的培养基，将其移栽到花 盆中。将整个花盆用透光性好的聚乙烯袋罩上，以保持高湿环境，促进幼苗成活。
[0036] 真假杂种鉴定：小豆初生叶为心形，较短圆，饭豆初生叶为披针形，较狭长，杂种植 株的初生叶形介于两者之间，从幼苗初生叶形可以直观判断是否为真杂种。
[0037] 三、试验结果
[0038] 图1为利用幼胚拯救获得的小豆与饭豆远缘杂交幼苗照片，图2为小豆与饭豆远 缘杂交植株成株期照片。以上结果表明，采用本发明方法获得的杂种幼胚可以直接长成幼 苗，且幼苗生长发育良好，移栽成活率高，远缘杂交F 1植株成株期可以正常开花结实，能够 收获F2种子。
[0039] 试验例1、正反杂交的幼胚拯救结果的对比试验
[0040] 1.通过对正反杂交的幼胚拯救结果进行比较（表1)，表明小豆做母本时，杂种幼 胚多分化为愈伤组织；饭豆做母本时，杂种幼胚可以直接长成幼苗（图1)。因此利用饭豆 做母本时更利于获得小豆与饭豆间的远缘杂交后代植株。
[0041] 表1小豆与饭豆正反杂交幼胚拯救结果比较
【权利要求】
1. 一种利用幼胚拯救实现小豆和饭豆远缘杂交的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 材料准备：母本选用较早熟的饭豆材料，父本选用综合性状优良的小豆品种，精选 无病饱满的籽粒以备种植； 2) 材料种植：小豆亲本分批错期播种，以保证两亲本花期相遇并有足够的花蕾进行杂 交； 3) 杂交授粉：当父母本均开花时，于每天下午4-6时进行去雄，第二天7-9时进行授 粉； 4) 幼胚拯救：取授粉后10-15天的杂交荚，用蒸馏水将杂交荚表面清洗干净，用尖头镊 子将其剥开，取幼嫩籽粒；将幼嫩的杂交籽粒用70%酒精灭菌1分钟，0. 1 %升汞灭菌15分 钟，灭菌蒸馏水冲洗3-5次；在解剖镜下剥取幼胚，将幼胚接种于装有灭菌培养基的组培瓶 中，其中培养基为添加10 μ M6-苄基腺嘌呤的MS基本培养基，以上整个操作过程在超净工 作台中完成；接种好的幼胚转移到光照培养箱中，培养条件为温度25°C，湿度55-65%，12 小时光照，12小时暗环境，直至杂种幼苗长出； 5) 杂种幼苗移栽。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的母本为从播种至开花期为50-60天的 饭豆材料，所述的父本为综合性状较好的吉林省小豆品种白红2号。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的母本为河北保定的较早熟的饭豆亲本 材料R)21。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于小豆亲本材料白红2号分两批错期播种，第一 批与饭豆材料同期播种，第二批错后3-15天播种，以保证两亲本花期相遇并有足够的花蕾 进行杂交。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的杂交授粉的具体操作方法为选取第二 天即将开放的花蕾，用酒精消毒过的尖头镊子剥开龙骨瓣，将10个花药全部去除，仅留柱 头；去雄后将整个植株罩上防虫网，以防昆虫传粉，授粉时选取当天刚开放的花朵，用尖头 镊子将整个包含柱头、花药和花丝的龙骨瓣取下，从龙骨瓣细的开口一端将其套在母本的 柱头上。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的杂种幼苗移栽包括待幼苗长至8-12厘 米高且生根良好时，打开培养瓶口，炼苗48小时；炼苗结束后小心地用镊子将幼苗从组培 瓶中取出，洗净根上残留的培养基，将其移栽到花盆中，将整个花盆用透光性好的聚乙烯袋 罩上，以保持高湿环境，促进幼苗成活。
【文档编号】A01H4/00GK104221861SQ201410451976
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】刘长友, 田静, 范保杰, 曹志敏, 苏秋竹, 张志肖, 王彦 申请人:河北省农林科学院粮油作物研究所