一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法与流程

本发明涉及一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法。本发明属农业生物技术领域。

背景技术：
白桦(Betulaplatyphylla)为桦木科桦木属落叶乔木。自然分布主要在东北地区的北部：大小兴安岭、完达山等林区。因其姿态优美，树皮光滑洁白，作为庭园树、行道树及街心绿地栽培，具独特的观赏价值。白桦属强阳性树种，耐贫寒、生长快、材质优良，为重要工业用材树种之一。花药培养能够获得纯系育种材料，进行单倍体育种，缩短育种年限和提高育种效率，而且在基础生物科学领域具也有广泛应用(王延玲等，山东农业大学学报(自然科学版)，2006，37(1)：149～151)。花药培养建立的双单倍体群体DH群体，具有遗传学上的纯合基因组，是AFLP,RAPD,SSR等分子标记和基因图谱的理想材料，能极大提高基因定位、标图的准确性。从20世纪60年代，Nitshc通过花药培养得到烟草的单倍体植株后，花药培养得到了很大的发展并于70年代达到了高速发展阶段。自1964年印度的Guha和Maheshwari(GuhaandMaheshwari,Nature,1964,204:497)首次成功地从毛叶曼陀罗离体花药培养中获得单倍体植株，并随后证实是由胚状体途径获得的单倍体花粉植株，从此开创了利用花药培养诱导单倍体的新途径。之后，花药培养诱导单倍体在许多重要作物上获得成功，如在小麦(倪胜利等，甘肃农业大学学报，2004，39(2):141～145)、玉米(付迎军，延边大学农学学报，2004，26(1)：1～5)、水稻(赵海岩等，辽宁农业科学，2005(1)：5～7)、茄子(Miyoshi，PlantCellReports，1996，15(6)：391～395)、草莓(Rosati等，HortScience，1975，10(2)；119～120)等农作物上都有成功的报道。到目前为止，白桦花药培养体系及单倍体植株还未有报道。由于小孢子处于单核靠边期的白桦花药很小，约1.5-2.0mm，无菌接种操作较困难。根据相关研究研究报道(李同华，东北林业大学硕士论文，2004)，白桦小孢子在每年的8月下旬发育到小孢子，9月份完发育到单核靠边期越冬，第二年再继续发育成熟。本发明的目的是建立一种培养白桦花药获得单倍体的技术体系，为白桦单倍体育种及基础研究提供原始研究材料。

技术实现要素：
本发明主要涉及快速获得大量小孢子处于单核靠边期的白桦花药，花药植株再生及单倍体植株的鉴定。具体如下：(1)小孢子处于单核靠边期白桦花药的大量获得在8月下旬到9月初，不断取材，利用醋酸洋红法于光学显微镜下观察花药中小孢子的发育时期。当小孢子发育到单核靠边期时,采集雄穗在超净工作台内用70％消毒3分钟。普通豆浆机的刀片和杯也事先在超净工作台内经70％酒精经消毒后，将花穗放入豆浆机的杯中，拧上刀片，然后拿出超净工作台，插入电机粉碎。之后取下杯和刀片在超净工作台内打开，取出物分别以40目和60目网筛过筛，除去大于和小于花药的杂质获得大量无杂质、无菌花药。(2)花药植株再生将上述花药接种到添加40g/L蔗糖和0-3.0mg/L2,4-D，0.5mg/LKT的MS培养基中诱导愈伤组织。培养四周，在40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下获得大量愈伤组织。然后转入添加0.5-2.0mg/LBA，0.1-0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖的MS培养基进行分化。培养四周后，在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT最多。分化出的不定芽在WPM+0.4mg/LIBA+0.2mg/LNAA培养基中诱导生根培养。(3)单倍体植株的鉴定当根长约为0.5cm～1.0cm时，在上午9:00～12:00取样，用蒸馏水仔细洗去根上残存的培养基。用0.2％秋水仙素、饱和对二氯苯对根尖分别进行预处理：1.5h-4.0h。将预处理好的根尖放入到卡诺氏液(冰乙酸1份，无水乙醇3份)中固定2～4h。然后根尖经70％的酒精转入蒸馏水中漂洗5～6遍，洗去表面的酒精，使着色更加充分，在1mol/LHCl中处理2～3min，用蒸馏水漂洗5～6遍后，用刀片把根尖的分生区切下并移至载玻片上，用刀片将分生区压扁，滴上1～2滴卡宝品红，染色5～10min。然后进行压片和制片。将制好的装片在光学显微镜60×和100×的油镜下进行染色体数目的观察、计数和显微拍照。发现用饱和对二氯苯溶液对白桦的根尖进行预处理4h，染色体收缩效果最佳，且最分散。共查到有3个株系染色体数是14条。本发明中所用的培养基都先调整pH值为5.8，经过高温高压灭菌(121℃、1.5个大气压、15分钟)后使用的。本发明的培养环境是在常规组织培养室(温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx,光/暗周期16h/8h,湿度60％～70％)中进行的。本发明的特点：1、快速获得大量干净无杂质、无菌白桦花药，为白桦花药培养提供了充足的外植体材料，极大提高了接种效率。2、建立了花药再生培养体系，为白桦单倍体育种及基础研究奠定基础。3、建立了白桦组织培养植株根尖染色体杂片技术。附图说明：图1普通豆浆机的主要组成：刀片、杯和电机图2经豆浆机粉碎雄穗后经网筛筛选，并接种的白桦花药图3花药愈伤组织的诱导：A、B分别为在MS+40mg/L蔗糖+3.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT、MS+40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下诱导的愈伤组织；C为B中愈伤组织在同样条件下继代培养的愈伤组织图4花药愈伤组织在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT条件下分化的不定芽图5经根尖染色体制片技术观察到的染色体图片具体实施方式实例1、小孢子处于单核靠边期白桦花药的大量获得在2014和2015年8月下旬到9月初，采集东北林业大学校内的白桦雄花穗，取出花药，用卡诺固定液固定。然后红醋酸洋红观察花药中小孢子的发育情况。当小孢子发育到单核靠边期时,采集雄穗在超净工作台用70％酒精消毒3分钟后，用灭菌的蒸馏书冲洗5遍，用灭菌滤纸将雄穗上的水吸干净。普通豆浆机的杯子和刀片也事先在超净工作台内用70％酒精经消毒。将花穗放入豆浆机的杯中，拧上刀片，然后拿出超净工作台，插入电机粉碎。再在超净工作台内分别以40目和60目网筛过筛,除去大于和小于花药的杂质，获得大量无杂质、无菌花药。实例2、花药植株再生将上述获得的花药接种到添加40g/L蔗糖和0-3.0mg/L2,4-D，0.5mg/LKT的MS培养基中诱导愈伤组织。培养4周后，调查发现在40mg/L蔗糖+3.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下获得的愈伤组织最多，但有大量不定根产生，不能继代培养；在40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT条件下获得的愈伤组织诱导率为31.5％，虽然不是最多，但生长松散，且在同样条件下继代仍然生长良好(见表1)。然后转入添加0.5-2.0mg/LBA，0.1-0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖的MS培养基进行分化。培养6周后，在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT最多(见表2)。分化出的不定芽在WPM+0.4mg/LIBA+0.2mg/LNAA培养基中诱导生根培养。表1白桦花药接种4周后诱导的愈伤组织注：“-”表示愈伤组织生长不好；“+”表示愈伤组织生长较好。表2愈伤组织培养6周后的再分化实例3、单倍体植株的鉴定当根长约为0.5cm～1.0cm时，在上午9:00～12:00取样，每个植株取5个以上的根尖，浸泡于蒸馏水中，仔细洗去根上残存的培养基，然后用对根用0.2％秋水仙素、饱和对二氯苯对根尖进行预处理1.5-4.0h。之后用于蒸馏水漂洗5～6遍，放在1mol/LHCl中处理2～3min进行解离。解离后的根尖用蒸馏水漂洗5～6遍后，用刀片把根尖的分生区切下并移至载玻片上，用刀片将分生区压扁，滴上1～2滴卡宝品红，染色5～10min后，将材料轻轻盖上盖玻片，防止空气进入，用滤纸吸干多余的染液，并用铅笔的橡皮头轻轻敲击盖玻片，使细胞均匀分散。将制好的装片分别在光学显微镜60×和100×的油镜下进行染色体数目观察、计数，并对理想的分裂相拍照。比较发现：用饱和对二氯苯预处理根尖4h时，染色体收缩较好，且较分散(见表3、4)。最终共获得3个染色体数为14条的单倍体株系。表3白桦根尖用2％秋水仙素处理表4白桦根尖用饱和对二氯苯预处理